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    花旗松素對SGC-7901胃癌細胞生長、運動、氧化應激和p38MAPK信號通路的影響

    2022-10-10 13:05:00燕二偉樊占杰沈冰冰張燚
    淮海醫(yī)藥 2022年4期
    關(guān)鍵詞:素處理花旗氧化應激

    燕二偉,樊占杰,沈冰冰,張燚

    胃癌(gastric cancer,GC)是一種起源于胃黏膜上皮的常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤,患病人數(shù)呈逐年增加趨勢,對人體健康構(gòu)成嚴重威脅[1]。在大多數(shù)情況下,80%的胃癌是在晚期發(fā)現(xiàn)的[2-3]。目前,隨著治療的改善,包括手術(shù)、化學療法和成熟的內(nèi)窺鏡療法來治療胃癌,但大多數(shù)晚期胃癌的預后仍然很差[4]。大多數(shù)患者不可避免地死于腫瘤轉(zhuǎn)移或復發(fā)。迄今為止,還沒有有效的治療策略來解決這個問題。因此,探索全新有效的抗胃癌治療藥物是必要的。花旗松素(taxifolin,TXL),也稱二氫槲皮素,是松科植物中常見的黃酮類化合物,具有抗氧化、抗腫瘤、抗寄生蟲、抗炎、抗菌抗病毒和保護心肌細胞的藥理作用[5-9]。花旗松素已被鑒定為多種癌癥的潛在的抗腫瘤藥,如骨肉瘤,乳腺癌,結(jié)腸癌,尤因肉瘤[10-11]。已有相關(guān)研究[12]表明,花旗松素具體體外抗腫瘤活性,能抑制人胃癌MGC細胞增殖,可通過調(diào)節(jié)AhR/CYP1A1信號通路路抑制胃癌的惡性進展[13]。然而,花旗松素對高度侵襲性胃癌的影響和潛在機制仍未確定。因此,本研究探討花旗松素對胃癌細胞生長、運動以及氧化應激的影響,以期為花旗松素治療胃癌提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑與儀器 人胃癌細胞SGC-7901細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶購自美國Invitrogen公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒購自美國PIERCE公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)購自南京建成生物工程研究所;MatrigelTM底膜基質(zhì)、Transwell小室和人工基底膜購自美國BD公司;血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、波形蛋白(Vimentin)、神經(jīng)鈣黏蛋白(E-cadherin)、上皮鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體購自美國Sigma公司;HRP標記的山羊抗鼠二抗購自美國Santa Cruz公司;細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin PE/7-AAD)購自南京凱基生物有限公司;高速低溫離心機購自美國Beckman公司;CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司;電泳槽、電轉(zhuǎn)儀購自美國Bio-Rad公司;FACS Vantage SE流式細胞儀購自美國BD公司;凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP購自美國UVP公司。

    1.1.2 細胞培養(yǎng) SGC-7901細胞于37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱用DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS和1%青-鏈霉素)培養(yǎng),當細胞融合度達80%時,用0.25%胰蛋白酶消化,吹打形成單細胞懸液,2~3 d傳代1次。實驗時選擇對數(shù)生長期細胞。

    1.2 方法

    1.2.1 CCK8檢測細胞存活率 將SGC-7901細胞接種于96孔板(100 μL/孔)孵育24 h后,用不同濃度(0.5、1、2.5、5、10、20、50、100、200、300 μM)花旗松素處理細胞,每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h,用酶標儀測定。并計算花旗松素對SGC-7901細胞的半抑制濃度。

    1.2.2 EdU染色檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞以每孔1×105接種于96孔板,分組處理培養(yǎng)后,于每孔中加入100 μL含50 μmol/L EDU培養(yǎng)基孵育2 h,用PBS洗滌2次,每次5 min。將細胞進行固定和染色后用熒光顯微鏡進行觀測。

    1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 取處理后的各組SGC-7901細胞接種于6孔板,培養(yǎng)48 h后,室溫下加入5 μL Annexin V FITC混勻,最后加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)10 μL避光孵育15 min,流式細胞儀上機檢測。

    1.2.4 Transwell檢測細胞侵襲 將Matrigel基質(zhì)膠稀釋后加入小室的上室(45 μL/孔),37 ℃凝固5 h,取經(jīng)0、25、50、100 μM濃度花旗松素處理24 h后的SGC-7901細胞加入上室,下室加入500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取下室,洗滌后用多聚甲醛固定20 min,0.1%結(jié)晶紫染色10 min,顯微鏡下觀測并計數(shù)侵襲細胞數(shù)。

    1.2.5 化學比色法檢測氧化應激相關(guān)指標 試劑盒檢測SOD的活性和MDA、GSH的水平,按照SOD、MDA和GSH測定試劑盒說明書進行檢測。

    1.2.6 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)學觀察 取各組對數(shù)生長期細胞,通過顯微鏡觀察各組細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)學變化。

    1.2.7 Western blot檢測VEGF、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表達水平 各組SGC-7901細胞加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白含量。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,200 mA恒流點轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入一抗VEGF(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、p38(1∶1 000)和p-p38(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBST緩沖液清洗后加入辣根過氧化物酶標記的IgG(1∶10 000),膜上滴加電化學發(fā)光顯影液顯色。ImageJ V軟件分析各組TPC-1細胞目的蛋白與β-actin比值。

    2 結(jié)果

    2.1 花旗松素對SGC-7901細胞活力的影響 不同濃度花旗松素處理胃癌SGC-7901細胞24 h后,SGC-7901細胞的存活率以花旗松素濃度依賴的方式降低,當花旗松素濃度超過50 μM時,SGC-7901細胞的存活率較花旗松素濃度為0.5 μM時顯著降低(P<0.05),并計算得出IC50值=54.602,即選擇25、50、100 μM濃度進行后續(xù)實驗。見圖1。

    2.2 花旗松素對SGC-7901細胞增殖的影響 與對照組相比較,花旗松素50、100 μM組EdU陽性細胞數(shù)均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

    2.3 花旗松素對SGC-7901細胞凋亡的影響 與對照組相比較,花旗松素50、100 μM組細胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)。見圖3。

    2.4 花旗松素對SGC-7901細胞侵襲的影響 與對照組相比較,花旗松素50、100 μM組侵襲細胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見圖4A、4B?;ㄆ焖伤?0、100 μM組VEGF和Vimentin的蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。見圖4C、4D。

    2.5 花旗松素對SGC-7901細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 與對照組比較,花旗松素50、100 μM組EMT受到抑制,細胞從棒狀或長梭形的間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為鵝卵石狀或紡錘體形的上皮細胞形態(tài)。見圖5A?;ㄆ焖伤?0、100 μM組E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),N-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖5B、5C。

    2.6 花旗松素對SGC-7901細胞氧化應激的影響 與對照組相比較,花旗松素50、100 μM組SOD、GSH-Px活性均顯著降低(P<0.05),MDA含量顯著升高(P<0.05)。見圖6。

    注:1對照組 2花旗松素25 μM組 3花旗松素50 μM組 4花旗松素100 μM組 與對照組比較,*P<0.05。

    2.7 花旗松素對p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)活化的影響 與對照組相比較,花旗松素50、100 μM組p38 MAPK磷酸化水平均顯著降低(P<0.05)。見圖7。

    3 討論

    近年來,隨著中醫(yī)藥的不斷探索,天然膳食提取物作為一種附加的治療策略,在癌癥治療中表現(xiàn)出獨特的吸引力,主要是因為它們?nèi)菀撰@得,毒性低,在人體中耐受性好[14]?;ㄆ焖伤厥撬煽浦参镏谐R姷狞S酮類化合物,存在于洋蔥,水飛薊,法國海洋樹皮和花旗松樹皮中[15]。本文研究結(jié)果表明,不同濃度花旗松素處理后,SGC-7901細胞存活率以花旗松素濃度依賴的方式降低。因此,選擇無顯著毒性的花旗松素濃度 (0、5、10、20 μM) 進行后續(xù)實驗。

    癌細胞無限增殖是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要機制。研究[16]發(fā)現(xiàn),花旗松素處理可降低ki-67的表達,導致乳腺癌MDA-MB-231細胞存活率和增殖能力下降。同樣,用花旗松素處理可以呈劑量依賴性的抑制人皮膚鱗癌細胞增殖[6]。本文研究結(jié)果表明,不同濃度花旗松素處理后,SGC-7901細胞EDU陽性細胞數(shù)明顯減少,提示花旗松素可通過抑制胃癌細胞增殖來影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。

    誘導細胞凋亡是治療胃癌的必要方式之一。研究[6]發(fā)現(xiàn),花旗松素治療可誘導細胞凋亡抑制瘢痕細胞癌的生長。Razak等[17]對人類結(jié)直腸癌HCT116和HT29細胞使用花旗松素會導致細胞生長停滯,在細胞周期的G2期控制細胞周期的分子變化和濃度依賴性的凋亡。本文研究結(jié)果表明,不同濃度花旗松素處理后,SGC-7901細胞細胞凋亡率降低,與上述研究結(jié)果一致。提示花旗松素可通過誘導胃癌細胞凋亡,從而抑制腫瘤的生長。

    惡性腫瘤細胞向周圍正常組織浸潤和侵襲是導致腫瘤快速增長和蔓延的主要原因,且胃癌細胞的侵襲與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程密切相關(guān)[18]。Vimentin是一種中間絲蛋白,與肺、前列腺和乳腺癌等大多數(shù)實體腫瘤類型的轉(zhuǎn)移潛能增加相關(guān)[19]。由于Vimentin對于細胞的結(jié)構(gòu)完整性、層狀體的形成和粘附信號傳導是不可或缺的,下調(diào)Vimentin的表達足以改變細胞的體外形態(tài)以及抑制細胞的運動和侵襲[20]。VEGF是血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子,是大多數(shù)癌細胞合成和分泌的,在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[21]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胃癌組織和細胞中均表現(xiàn)為上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達的降低和間充質(zhì)細胞標志蛋白N-cadherin、Vimentin的過表達[22]。研究[16]發(fā)現(xiàn),花旗松素治療對MDA-MB-231和4T1乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力均有劑量依賴性的抑制作用?;ㄆ焖伤刂委熆赡芡ㄟ^PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制SSCC癌細胞的增殖和侵襲[6]。本文研究結(jié)果表明,不同濃度花旗松素處理后,SGC-7901細胞侵襲細胞數(shù)減少,EMT形態(tài)學變化受到抑制,E-cadherin蛋白表達水平升高,VEGF、Vimentin和N-cadherin的蛋白表達水平降低,提示花旗松素可抑制胃癌細胞的運動。

    GSH-Px和SOD是細胞內(nèi)抗氧化劑,MDA是脂質(zhì)過氧化的指標,兩者都在細胞氧化應激中發(fā)揮重要作用。GSH-Px的消耗由于清除活性氧的損害而導致氧化損傷,SOD可以中和自由基,保護細胞免受氧化損傷[23]。研究[24]證實,花旗松素能提高SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量,具有增強抗氧化酶活性和抑制自由基過氧化的心臟保護作用。本文研究結(jié)果表明,不同濃度花旗松素處理后,SGC-7901細胞SOD活性和GSH-Px水平降低,MDA水平升高。提示花旗松素可抑制SGC-7901細胞的氧化應激。

    在細胞水平上,絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族是細胞外和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的重要橋梁,在MAPK家族中,p38激酶在各種疾病中被發(fā)現(xiàn)改變,包括癌癥,這些激酶發(fā)揮基本作用,有時具有拮抗作用機制[25]。相關(guān)研究[26]表明p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導通路與腫瘤細胞增殖及凋亡密切相關(guān),p-P38對腫瘤的形成有負向調(diào)控作用。p38 MAPK信號通路也可影響 EMT 相關(guān)蛋白的表達,包括E-cadherin和波形蛋白,表明p38 MAPK信號通路可調(diào)節(jié)EMT[27]。本文研究結(jié)果表明,不同濃度花旗松素處理后,p38 MAPK磷酸化水平降低。

    綜上所述,花旗松素可抑制胃癌SGC-7901細胞生長和運動并誘導細胞氧化應激,這可能是通過抑制p38 MAPK的活化實現(xiàn)的。本文為花旗松素應用于臨床治療胃癌提供了實驗依據(jù),下一步計劃加入p38 MAPK信號通路抑制劑驗證花旗松素對胃癌細胞的抗腫瘤作用。

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