基于轉(zhuǎn)運體的何首烏致肝損傷作用機制探討△

汪祺，楊建波a，王瑩，李妍怡，2，文海若*，馬雙成*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；

2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029

何首烏是蓼科植物何首烏Polygonum multijiorumThunb.的干燥塊根。近年來，隨著何首烏及其制劑的廣泛應(yīng)用，其臨床不良反應(yīng)報道逐漸增多，其中以何首烏致肝損傷問題較為常見[1-2]。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，何首烏致肝損傷的臨床表現(xiàn)多以膽汁淤積及高膽紅素為主[3-4]。由于膽紅素和膽汁酸等的代謝轉(zhuǎn)運均與肝臟上的攝取和外排轉(zhuǎn)運體相關(guān)，因此推測這些轉(zhuǎn)運體功能出現(xiàn)障礙可能是何首烏致肝毒性的機制。

研究表明，有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽（OATPs）可介導(dǎo)藥物及內(nèi)源性物質(zhì)如膽紅素和膽汁酸的跨膜轉(zhuǎn)運，其中OATP1a1和OATP1b2在肝臟中高表達，位于肝細胞的基底側(cè)，對膽紅素和膽汁酸的攝取起著至關(guān)重要的作用[5]。而多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）和MRP3 在體內(nèi)主要負責對膽酸鹽的排泄，同時介導(dǎo)膽紅素及其葡萄糖醛酸結(jié)合物排入膽汁，兩者高表達于肝臟、腸及腎臟組織[6]。研究表明，MRP2、MRP3 蛋白功能受到影響時，肝臟表現(xiàn)出不同程度的膽汁酸或膽紅素淤積，繼而產(chǎn)生毒性反應(yīng)[7]。此外，外排轉(zhuǎn)運體如P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）也在膽紅素及膽汁酸代謝循環(huán)中起著重要的作用。膽汁酸也可經(jīng)Na+-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運多肽（NTCP）攝取進入肝細胞，再由肝細胞膽管側(cè)的膽鹽外排泵（BSEP）外排至膽汁[8-10]。由此可見，上述轉(zhuǎn)運體被抑制可導(dǎo)致膽紅素、膽汁酸代謝異常，從而產(chǎn)生肝毒性[11-12]。

因此，本研究以何首烏醇提物（PME）和何首烏水提物（PMW）為研究對象，考察大鼠長期灌胃PMW 和PME 后的毒性表現(xiàn)，同時測定給藥后膽汁酸、膽紅素代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運體（OATP1a1、OATP1b2、MRP2、MRP3、BSEP、NTCP、BCRP、P-gp）的表達變化，從而初探何首烏致肝損傷的可能機制，為何首烏的臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠40 只，體質(zhì)量（200±20）g，購于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK-2011-0004。標準動物房中飼養(yǎng)，室溫22～24 ℃，相對濕度55%～60%，光照12 h 明暗交替，以SPF 級標準飼料喂養(yǎng)。動物實驗由中國醫(yī)學科學院藥物研究所倫理委員會審批，審批號為00003037。

1.2 儀器

Multiskan MK3 型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；HH.S4型恒溫孵育器（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）；DKZ-450B 型電熱恒溫振蕩水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；TU-1901 型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；TGL20M 型高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；VORTEX GENIVS 3 型漩渦混勻儀（美國Scientific Industries 公司）；iQ5 型聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 試藥

何首烏藥材（北京本草方源藥業(yè)有限公司，批號：20160414）；異硫氰酸1-萘酯（ANIT，瑪雅試劑有限公司，批號：MAYA-CR-5311）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（批號：20170413）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（批號：20170417）、總膽汁酸（TBA）試劑盒（批號：20161025）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（批號：20170414）、總膽紅素（TBIL）試劑盒（批號：20170421）均購于南京建成生物工程研究所；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，美國Sigma 公司，純度：99.0%）；烏拉坦（純度：99.0%）、蘇木素（純度：99.0%）均購于德國Merck公司；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1何首烏提取物的制備 取何首烏藥材5 kg，用10 倍量70%乙醇加熱回流提取2 次，提取時間分別為2.0、1.5 h，合并提取液，濃縮、干燥，得PWE 粉末，得率為20%。取何首烏藥材5 kg，用10倍量蒸餾水加熱回流提取2 次，提取時間分別為2.0、1.5 h，合并提取液，濃縮、干燥，得PMW 粉末，得率為25%。精密稱取PMW 和PWE 適量，加0.5%的CMC-Na溶液混懸并定容，制成質(zhì)量濃度為0.6 g·mL-1的PME 混懸液和0.75 g·mL-1的PMW 混懸液（相當于何首烏生藥質(zhì)量濃度為3 g·mL-1），置于4 ℃，備用。

2.1.2ANIT 儲備液的配制 精密稱取ANIT 適量，加花生油溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1的ANIT儲備液，置于4 ℃，備用。

2.2 實驗分組及給藥

將SD 大鼠隨機分為4 組，分別為PMW 組（灌胃給予PMW 15 g·kg-1，20 mL·kg-1，相當于60 g·kg-1生藥量，約為臨床最大量的110倍）、PME組（灌胃給予PME 12 g·kg-1，20 mL·kg-1，相當于60 g·kg-1生藥量，約為臨床最大量的110倍）、對照組（灌胃給予同體積0.5%的CMC-Na 溶液）及陽性對照ANIT 組（灌胃給予同體積0.5%CMC-Na溶液，第40天灌胃給予ANIT 儲備液100 mg·kg-1，5 mL·kg-1）。每組10只，共40只，連續(xù)給藥42 d。期間大鼠飲食自由，并觀察大鼠的行為活動、外觀體征、尿液和糞便形態(tài)等。

2.3 生物樣品收集

給藥結(jié)束后，大鼠禁食24 h，分別腹腔注射25%烏拉坦麻醉，由腹主動脈取血，并置于離心管中，待有少量血清析出時，以3000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），取血清存于-20 ℃，待測。并立即處死大鼠，取肝臟，切成2 mm×2 mm 的塊狀，置于10%中性甲醛固定液中固定72 h。

2.4 生物樣品處理

2.4.1血清生化指標的測定 取各組大鼠血清樣品，根據(jù)試劑盒說明書進行操作，采用Multiskan MK3 型酶標儀測定血清生化指標TBIL 和TBA；采用TU-1901 型紫外-可見分光光度計測定血清生化指標AST、ALT 和ALP，并將所測定的結(jié)果與對照組進行比較分析。

2.4.2病理檢測 大鼠肝臟分離后使用10%中性甲醛固定組織標本。固定后的組織經(jīng)過修塊取材后采用乙醇逐級脫水，再由石蠟包埋，采用滑動切片機切片（厚約3 μm）。最終標本經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色后在光鏡下進行組織病理學檢查[13]。

2.5 轉(zhuǎn)運體mRAN表達的檢測

精密稱取大鼠肝臟組織100 mg，剪碎，經(jīng)RNA提取，RNA 濃度、純度及完整性的測定，反轉(zhuǎn)錄，PCR 擴增等過程。用PCR 儀自帶軟件進行熒光定量分析，得出循環(huán)數(shù)閾值（Ct），待測樣本目的基因表達數(shù)的計算方法用2-ΔΔCt法計算目標基因表達的相對水平[14]。OATP1a1、OATP1b2、MRP2、MRP3、BSEP、P-gp、NTCP mRNA 的引物序列見表1。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）評估相對基因表達，并使用iQ5光學軟件標準化為GAPDH水平。

表1 qRT-PCR引物序列

2.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均采用SAS 9.4統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計檢驗采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以（）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體征變化

與對照組大鼠比較，ANIT組大鼠呈現(xiàn)明顯的膽汁淤積樣癥狀，毛發(fā)明顯變黃，四肢、耳和尾部等毛發(fā)較少的地方可見明顯變黃，與文獻報道一致[15]。與對照組大鼠比較，PMW 和PME 組大鼠毛發(fā)變黃而粗糙，且PME 組大鼠四肢、耳和尾部等毛發(fā)較少的地方可見明顯變黃，呈現(xiàn)出黃疸癥狀，但癥狀輕于ANIT組。此外，PMW 和PME組大鼠尿液均呈黃紅色，糞便為稀便。

3.2 大鼠灌胃何首烏后血清生化指標的變化

各組大鼠血清生化指標ALT、AST、TBA、ALP 和TBIL 水平見表2。與對照組比較，ANIT 組大鼠的5 項血清生化指標水平均顯著升高（P＜0.01），說明該檢測方法具有可靠性；PMW 組大鼠血清中AST 水平顯著降低（P＜0.05），ALT、ALP水平顯著升高（P＜0.05），TBIL、TBA 水平差異無統(tǒng)計學意義，說明大鼠已經(jīng)出現(xiàn)肝細胞損傷，但TBIL、TBA水平仍未發(fā)生明顯變化；PME組大鼠血清中AST 水平顯著降低（P＜0.05），ALT、ALP、TBA 水平顯著性升高（P＜0.01），TBIL 水平差異無統(tǒng)計學意義，說明大鼠肝細胞損傷出現(xiàn)的同時已經(jīng)表現(xiàn)出膽汁酸代謝異常，提示有發(fā)生膽汁淤積的趨勢。

表2 PMW和PME對大鼠血清生化指標的影響（, n=10）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 大鼠肝臟組織的病理變化

各組大鼠肝臟染色結(jié)果見圖1。與對照組比較，PME 組和PMW 組大鼠肝臟均可見膽管增生及炎性細胞浸潤，提示2 組大鼠經(jīng)42 d 誘導(dǎo)后均存在不同程度的肝損傷。其中PME 組大鼠灶性壞死及炎性細胞浸潤發(fā)生率分別為5/10 和6/10，均高于PMW 組（分別為2/10 和3/10），提示PME 導(dǎo)致的肝臟病變較重。

圖1 PMW和PME對大鼠肝臟組織病理學的影響（HE）

3.4 大鼠肝臟轉(zhuǎn)運體mRNA表達變化

大鼠肝臟轉(zhuǎn)運體OATP1a1、OATP1b2、MRP2、MRP3、BSEP、NTCP、BCRP、P-gp 的mRNA 表達結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，與對照組比較，PME 組大鼠肝臟組織中MRP2、BSEP、NTCP、BCRP、P-gp mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），OATP1b2、MRP3 mRNA 表達水平升高但差異無統(tǒng)計學意義，OATP1a1 mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05）。PMW組大鼠肝臟組織中OATP1a1、OATP1b2、BSEP、NTCP、P-gp mRNA 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），MRP2、BCRP mRNA 水平均顯著降低（P＜0.05），MRP3 mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 PMW和PME對大鼠大鼠肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)運體mRNA表達的影響（, n=10）

由結(jié)果可知PMW 和PME 給藥組均可顯著降低外排轉(zhuǎn)運體MRP2、BCRP mRNA表達水平，升高攝取轉(zhuǎn)運體OATP1a1、OATP1b2 mRNA 表達水平。對于其他轉(zhuǎn)運體的影響，2 個給藥組存在差異，PME可顯著降低外排轉(zhuǎn)運體BSEP、P-gp mRNA 的表達水平，下調(diào)攝取轉(zhuǎn)運體NTCP的表達。而PMW 可顯著升高NTCP、BSEP、P-gp，對MRP3 影響不大。與PMW 組比較，PME 給藥組表現(xiàn)出更明顯的大鼠肝損傷癥狀，并伴有膽紅素代謝異常及膽汁淤積，可能與促進膽紅素、膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運而抑制其代謝物外排有關(guān)。

4 結(jié)論與討論

ANIT是用于制備膽汁淤積模型的典型藥物，可誘導(dǎo)肝損傷，致使肝細胞變性、壞死，同時還導(dǎo)致膽管上皮細胞腫脹壞死，造成膽管阻塞，產(chǎn)生顯著的高膽紅素血癥和膽汁淤積，最終導(dǎo)致一系列血清生化指標發(fā)生明顯變化[15]。由于其致肝損傷作用顯著，因此本研究選取其作為血清生化的陽性對照，于PME 和PMW 組給藥第40 天開始給藥，持續(xù)到第42 天。ALT 與AST 主要分布在肝臟的肝細胞內(nèi)，肝細胞壞死時ALT 和AST 水平升高，其升高的程度與肝細胞受損的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指標[16]。ALP 是一種磷酸單酯酶，正常情況下，體內(nèi)ALP 來源于肝臟和骨組織，主要作為阻塞性黃疸、肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查指標，阻塞性黃疸、原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌、膽汁淤積性肝炎都會使ALP 水平偏高[17]。因而臨床上常用這3 個指標作為判斷肝損傷及肝損傷類型的標準。當患者出現(xiàn)膽汁淤積時，不僅上述3 個血清生化指標會發(fā)生變化，TBA 和TBIL 也會發(fā)生明顯的變化。TBA 是結(jié)合型膽汁酸，健康人的周圍血液中含量極微，當肝細胞損害或肝內(nèi)、外阻塞時，TBA 就會升高，是一項比較敏感和有效的肝功能試驗之一[18]。TBIL 是直接膽紅素和間接膽紅素的總和，TBIL 的升高即是黃疸，主要用來診斷肝臟疾病或膽道異常[19-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PMW 和PME 給藥后，PMW 組大鼠血清中僅ALT 和ALP 水平顯著升高（P＜0.05），而PME組大鼠血清中ALT、TBA和ALP水平均顯著升高（P＜0.01），說明何首烏的2種提取物均對大鼠產(chǎn)生了一定的肝損傷作用，并且PME 組大鼠可能發(fā)生了膽汁淤積。有文獻報道，王濤等[21]證明高劑量PMW 可導(dǎo)致大鼠ALP 和TBA 水平明顯升高，同時可見肝細胞小灶性壞死，認為在不誘發(fā)嚴重肝損傷的前提下PMW 即可引起大鼠膽汁淤積，這與本研究結(jié)論相一致。此外，LPS 誘導(dǎo)后的大鼠給予PME后TBIL水平明顯降低，ALP水平明顯升高[22]。TBIL作為膽紅素異常的判斷標準，在本研究中并未觀察到明顯變化，推測這可能與本研究中正常大鼠給藥后機體的代償調(diào)節(jié)作用有關(guān)，使得這一指標的變化在短時期內(nèi)未能顯現(xiàn)出來。另有研究人員發(fā)現(xiàn)，PME 給藥可使大鼠出現(xiàn)輕微肝細胞變性，但經(jīng)過LPS 誘導(dǎo)后的大鼠則表現(xiàn)為肝臟嚴重局灶壞死[22]。本研究病理結(jié)果顯示，2 種何首烏提取物都會不同程度地引發(fā)肝損傷，并且PME 組表現(xiàn)得更為嚴重，這與文獻報道相符。

本研究中轉(zhuǎn)運體mRNA 表達結(jié)果顯示，PME 對肝臟外排型轉(zhuǎn)運體（MRP2、BSEP、BCRP 和P-gp）mRNA 的表達水平均具有下調(diào)作用，對攝取型轉(zhuǎn)運體（OATP1a1 和OATP1b2）及肝血竇側(cè)的外排型轉(zhuǎn)運體（MRP3）mRNA 的表達水平具有上調(diào)作用（圖3）。因此推測，PME 長期給藥后可能會導(dǎo)致膽紅素和膽汁酸等內(nèi)源性小分子在肝內(nèi)發(fā)生蓄積，引起肝損傷。PMW 對肝臟外排型轉(zhuǎn)運體的基因表達既有上調(diào)也有下調(diào)作用，對攝取型轉(zhuǎn)運體及肝血竇側(cè)的外排型轉(zhuǎn)運體的基因表達具有上調(diào)或不變的作用（圖3），這與王濤等[23]的研究結(jié)果相一致，雖然PMW 對肝臟上的轉(zhuǎn)運體有不同程度的調(diào)控作用，但其抑制或激活作用無明顯的傾向性。

圖3 PME和PMW對轉(zhuǎn)運體的影響

因此，經(jīng)過長期誘導(dǎo)后，2 種提取物均可導(dǎo)致大鼠發(fā)生肝損傷，其作用機制與影響膽紅素和膽汁酸相關(guān)轉(zhuǎn)運體相關(guān)，PME 和PMW 引發(fā)肝損傷程度存在差異，原因可能是對具體轉(zhuǎn)運蛋白的作用不同所致。本研究初步推測了PME 和PMW 引發(fā)肝損傷的作用機制，為臨床安全用藥提供了數(shù)據(jù)支撐。