恩諾沙星在馬口魚體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)

何欣， 柳愛春， 白俊慧， 童朝明

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

馬口魚(Opsariichthysbidens)屬鯉形目、鯉科、馬口魚屬，別名桃花魚[1]。和其他常見的養(yǎng)殖魚類品種相比，馬口魚魚肉味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，特別是脂肪中人體必需脂肪酸含量豐富，如DHA含量達(dá)20.72%，EPA含量達(dá)7.34%[2]，深受消費(fèi)者的喜愛。因其生長(zhǎng)較快、病害較少、繁殖力較強(qiáng)、人工養(yǎng)殖條件下喂食配合飼料生長(zhǎng)良好，目前馬口魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)已形成一定的規(guī)模，主要的養(yǎng)殖方式為水庫(kù)網(wǎng)箱養(yǎng)殖、池塘養(yǎng)殖、池塘循環(huán)流水養(yǎng)殖等[3-4]。

隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，集約化程度不斷提高，馬口魚的病害問(wèn)題已逐漸成為影響整個(gè)馬口魚養(yǎng)殖發(fā)展的重要因素。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，馬口魚養(yǎng)殖中目前主要的疾病是各類寄生蟲病，如魚怪(Ichthyoxenusjaponensis)、扇棘單睪吸蟲(HaplorchistaichuiKatsuta)等[5-6]，而細(xì)菌性疾病較少，所以目前國(guó)內(nèi)外對(duì)使用抗生素治療馬口魚細(xì)菌性疾病的研究報(bào)道較少，因此，有必要開展抗生素在馬口魚體內(nèi)的代謝研究。

恩諾沙星是一種廣譜、高效、低毒的抗菌藥物，其直接作用于細(xì)菌的核質(zhì)體，抑制細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶,使酶不能在DNA雙鏈上引入切口，破壞細(xì)菌的代謝和增殖[7]。根據(jù)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》(農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào))中的規(guī)定，恩諾沙星可用于牛、羊、豬、兔、家禽等各類食用養(yǎng)殖動(dòng)物，其中在水產(chǎn)動(dòng)物中肌肉和脂肪中的最高殘留限量為100 ng·kg-1，肝臟和腎臟中的最高殘留限量為200 ng·kg-1。

本研究采用口服連續(xù)給藥的方式，研究馬口魚血漿、肌肉和肝臟中恩諾沙星的代謝動(dòng)力學(xué)規(guī)律，為恩諾沙星在馬口魚養(yǎng)殖中的合理用藥方法及休藥期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物與主要試劑

鹽酸恩諾沙星可溶性粉，濃度≥98%，國(guó)邦公司；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，濃度≥99%，德國(guó)Dr.E公司；恩諾沙星內(nèi)標(biāo)氘代恩諾沙星，德國(guó)Dr.E公司；超純水采用MILL-Q超純水儀制備，用水符合GB/T 6682—2008一級(jí)水的標(biāo)準(zhǔn)；甲醇，色譜純，Thermo公司；乙腈，色譜純，Thermo公司；甲酸，色譜純，Thermo公司。無(wú)水硫酸鈉，分析純，經(jīng)高溫灼燒4 h后，置于密閉容器中備用；肝素鈉，上海哈靈生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀Waters Acquity UPLC，并配有電噴霧離子源(ESI)，Waters公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；渦旋混合器，IKA MS 3 digital；超聲儀，Ultrasonic cleaner；離心機(jī)，5 000 r·min-1，F(xiàn)ulgor TDL-5A；氮吹儀，OA-SYS N-EVAP 112；均質(zhì)機(jī)；分液漏斗；微孔濾膜；玻璃離心管，10 mL；塑料離心管，50 mL。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇

健康馬口魚，400尾。體重為(45±15)g，采自浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站外塘(30 m×60 m)，體態(tài)正常，無(wú)明顯外傷。經(jīng)隨機(jī)抽取檢測(cè)，馬口魚體內(nèi)未檢出恩諾沙星。試驗(yàn)前在杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院室內(nèi)水循環(huán)養(yǎng)殖水池中馴養(yǎng)14 d，水池高1 m，半徑0.6 m，水溫(22±2)℃。馴養(yǎng)期間投喂不含恩諾沙星的普通飼料。

1.4 給藥方式與劑量

將3.31 g鹽酸恩諾沙星用水溶解后，添加6 g飼料黏合劑與15 kg飼料拌勻后陰暗處晾干。連續(xù)投喂給藥5 d，每天的投喂量為魚體重的5%，相當(dāng)于每尾馬口魚每天10 mg·kg-1的恩諾沙星的劑量。

1.5 樣品采集與保存

采樣時(shí)間點(diǎn)分別為給藥后1、2、4、8、12、24、48、72、120、168、240、360和720 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)采集24尾馬口魚，將24尾隨機(jī)分為3組，每組8尾，尾椎取血至少2 mL至肝素鈉處理過(guò)后的塑料離心管中，分離血漿。去鱗、去皮，沿脊背取肌肉，置于研磨機(jī)中研磨均勻。取肝臟樣品置于研磨機(jī)中研磨均勻。樣品于-20 ℃冰箱保存，待測(cè)。

1.6 組織中恩諾沙星濃度測(cè)定方法

1.6.1 前處理方法

前處理方法參照《農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008，水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，并作適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取(5.00±0.01)g的樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入50 μL 1 000 ng·mL-1的氘代恩諾沙星內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋30 s，避光靜置10 min，加入10 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋混勻后加入20 mL酸化乙腈，超聲提取15 min，4 000 r·min-1離心10 min后取上清液于50 mL比色管中，殘?jiān)尤?0 mL酸化乙腈重復(fù)提取一次，合并提取液用乙腈定容至50 mL，準(zhǔn)確量取10.0 mL，40 ℃氮?dú)獯蹈伞?/p>

殘?jiān)尤?.0 mL甲醇溶解，再加入2.0 mL正己烷凈化，取甲醇層于2 mL離心管中以13 000 r·min-1離心5 min，過(guò)0.2 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.6.2 色質(zhì)譜條件

流速為0.4 mL·min-1；色譜柱為Waters BEH C18，2.1 mm×100 mm(1.7 μm)；柱溫為35.0 ℃，進(jìn)樣量2 μL；離子源及掃描方式為ESI+；檢測(cè)方式為MRM；電噴霧電壓為3.0 kV；脫溶劑溫度為500 ℃；碰撞氣為0.16 mL·min-1。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用3p97藥動(dòng)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，選取最適合的房室模型，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 恩諾沙星的色譜圖

按照1.6節(jié)色質(zhì)譜條件，恩諾沙星保留時(shí)間為6.61 min左右，陽(yáng)性樣品色質(zhì)譜如圖1所示。

圖1 陽(yáng)性樣品的恩諾沙星色譜

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與定量限

移取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液并稀釋成質(zhì)量濃度分別為20.00、50.00、100.00、150.00和200.00 ng·mL-1的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，同樣加入恩諾沙星內(nèi)標(biāo)配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。恩諾沙星濃度為20.00～200.00 ng·mL-1，濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，定量限(LOQ，S/N>10)為20.00 ng·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖2所示。

圖2 恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.1.3 加標(biāo)回收率

向空白血漿、肌肉和肝臟中加入恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品。馬口魚各組織中加標(biāo)不同濃度恩諾沙星的平均回收率如表1所示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%，符合檢測(cè)要求。

表1 馬口魚各組織中加標(biāo)不同濃度恩諾沙星的回收率

2.2 恩諾沙星的藥代動(dòng)力學(xué)特征

2.2.1 藥時(shí)曲線

經(jīng)過(guò)測(cè)定，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)馬口魚血漿、肌肉、肝臟中恩諾沙星的濃度如表2所示。

表2 給藥后不同時(shí)間馬口魚各組織中恩諾沙星的濃度

2.2.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及藥動(dòng)學(xué)方程

經(jīng)過(guò)3P97藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件的分析，投喂恩諾沙星后馬口魚體內(nèi)的血漿、肌肉和肝臟中的恩諾沙星呈一室開放模型，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如表3所示。動(dòng)力學(xué)方程為C血液=2.528 4×(e-0.044 1t-e-0.310 7t)；C肝臟=2.072 0×(e-0.013 2t-e-0.151 1t)；C肌肉=1.970 2×(e-0.016 5t-e-0.105 8t)。

表3 恩諾沙星在馬口魚各組織中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.3 恩諾沙星在馬口魚體內(nèi)的吸收與代謝殘留分析

恩諾沙星目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛使用，因此，本實(shí)驗(yàn)中采用連續(xù)給藥方式，連續(xù)5 d給予每尾馬口魚恩諾沙星10 mg·kg-1的劑量，馬口魚血漿中氟苯尼考濃度從1 h的5.089 4 mg·kg-1上升到4 h的峰值11.483 5 mg·kg-1，隨后開始下降，從第10 d起，檢出含量低于檢出限。肝臟中氟苯尼考濃度從1 h的3.277 2 mg·kg-1隨后上升，8 h達(dá)到峰值10.087 8 mg·kg-1，之后開始下降，但在24 h后再次出現(xiàn)另一個(gè)峰，隨后持續(xù)下降，至720 h檢出含量低于檢出限。馬口魚肌肉中恩諾沙星濃度從1 h開始緩慢上升至12 h的峰值9.782 1 mg·kg-1，隨后開始下降至360 h檢出含量低于檢出限。

馬口魚屬于鯉形目、鯉科，目前該科魚屬的藥代研究較少，張雅斌等[8]研究了恩諾沙星在鯉魚中的血藥濃度測(cè)定，在25 ℃時(shí)，通過(guò)單次口灌10 mg·kg-1劑量的恩諾沙星，鯉魚血藥濃度1 h即可到達(dá)峰值3.52 mg·kg-1，72 h后的含量約為0.19 mg·kg-1。李改娟等[9]研究了沒食子酸對(duì)恩諾沙星在福瑞鯉(Cyprinuscarpio)體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及殘留的影響，在26 ℃下，單次口服2 mg·kg-1劑量的恩諾沙星，在肝臟和肌肉中的達(dá)峰時(shí)間和濃度分別為1 h、5.48 mg·kg-1和8 h、1.31 mg·kg-1。李春雨等[10]對(duì)兩組鯉分別進(jìn)行腹腔注射，口灌恩諾沙星后，應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定了其組織中的藥物濃度，研究了恩諾沙星在鯉(Cyprinuscarpio)體內(nèi)的吸收、分布與消除等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明，在19～20 ℃單次口灌5 mg·kg-1劑量的恩諾沙星，肝臟的達(dá)峰含量為2.506 5 mg·kg-1，肌肉中的含量為0.380 3 mg·kg-1。

恩諾沙星是水產(chǎn)常見用藥，李春雨等[10]的研究結(jié)果表明，恩諾沙星在鯉魚體內(nèi)血漿、肌肉和肝臟中的消除半衰期分別為168.287 1、57.931和76.137 3 h。而恩諾沙星在牙鲆血液和肝臟中的消除半衰期分別為48.343和10.821 h[11]。恩諾沙星及其代謝物在西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)血液、肝臟和肌肉中的消除半衰期分別為32.046、354.987和252.194 h[12]。夏季，俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedtii)血液、肌肉和肝臟中恩諾沙星的半衰期分別為286.166、398.751和201.441 h[13]。本研究中，在(22±2)℃水溫下，馬口魚連續(xù)5 d口服10 mg·kg-1劑量的恩諾沙星，血液、肝臟和肌肉中的達(dá)峰時(shí)間分別為4、8和12 h。吸收半衰期分別為2.230 1、4.587 0和6.551 0 h，消除半衰期分別為15.726、52.399和42.081 h。這些數(shù)據(jù)表明，與另一水產(chǎn)養(yǎng)殖常見用藥氟苯尼考相比，恩諾沙星在魚體內(nèi)的消除速率較慢，半衰期較長(zhǎng)，更加需要注重藥物殘留問(wèn)題。

藥動(dòng)學(xué)研究中藥物的肝腸循環(huán)作用(hepato-enteral circulation)是一常見現(xiàn)象，即膽汁排泄后的藥物經(jīng)膽汁排入十二指腸后部分藥物可再經(jīng)小腸上皮細(xì)胞被重新吸收，在藥動(dòng)學(xué)上表現(xiàn)為藥時(shí)曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，該現(xiàn)象在喹諾酮類藥物中的報(bào)道較多。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)了恩諾沙星在肝臟內(nèi)的藥時(shí)曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，表明恩諾沙星在馬口魚體內(nèi)可能存在肝腸循環(huán)作用。

2.4 藥效及休藥期研究

恩諾沙星藥物屬于濃度依賴型抗菌藥物，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的細(xì)菌性疾病的治療效果與PKPD參數(shù)有關(guān)，如峰濃度(Cmax)/最小抑菌濃度(MIC)。一般認(rèn)為Cmax/MIC>8時(shí)，藥物即可起到良好的治療效果，當(dāng)Cmax/MIC=10時(shí)可發(fā)揮最大治療效果。研究表明，恩諾沙星對(duì)嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的MIC均為0.048 8 μg·mL-1，對(duì)遲緩愛德華氏菌的MIC為3.125 μg·mL-1[14]。

本實(shí)驗(yàn)表明，在22 ℃，當(dāng)用10 mg·kg-1的劑量連續(xù)5 d混飼給藥后，恩諾沙星在馬口魚血液肝臟和肌肉中的Cmax分別為11.483 5、10.087 8和9.782 1 μg·g-1，所以為能夠滿足治療的需要，在魚類嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌引起的疾病的急癥發(fā)作期實(shí)際用藥時(shí)，10 mg·kg-1恩諾沙星的劑量即可滿足治療效果，而治療遲緩愛德華氏菌引發(fā)的疾病時(shí)，可以適當(dāng)加大使用劑量，達(dá)到最優(yōu)的治療效果。

休藥期也叫消除期，指動(dòng)物從停止給藥到許可上市間隔時(shí)間的長(zhǎng)短，主要影響因素有種屬、環(huán)境等。我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的品種眾多，使用的漁藥種類及各種藥物的制劑類型也較多，極有必要結(jié)合水產(chǎn)養(yǎng)殖的制劑水平和用藥方式開展休藥期研究。根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告《動(dòng)物源性食品中獸藥最高殘留限量》(農(nóng)牧發(fā)〔2002〕235號(hào))的規(guī)定，恩諾沙星在魚肌肉中的含量不得高于0.1 mg·kg-1，按此標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)的環(huán)境為22 ℃，在360 h，即15 d后，馬口魚各組織中的恩諾沙星含量均小于0.1 mg·kg-1，休藥期至少為330 ℃·d。

3 小結(jié)

應(yīng)用液相色譜技術(shù)測(cè)定了連續(xù)5 d口服10 mg·kg-1劑量的恩諾沙星后，不同時(shí)間點(diǎn)恩諾沙星在馬口魚體內(nèi)各組織中恩諾沙星的含量，建立藥時(shí)曲線，并通過(guò)3p97藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，探討恩諾沙星在馬口魚體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)規(guī)律。結(jié)果表明，在(22±2)℃水溫下，血液、肝臟和肌肉中的達(dá)峰時(shí)間分別為4、8和12 h。吸收半衰期分別為2.230 1、4.587 0和6.551 0 h，消除半衰期分別為15.726、52.399和42.081 h，藥時(shí)曲線下總面積分別為151.027、328.660和307.200 μg·mL-1·h，為能夠滿足治療的需要，在魚類嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌引起的疾病的急癥發(fā)作期實(shí)際用藥時(shí)，10 mg·kg-1的恩諾沙星劑量即可滿足治療效果，而治療遲緩愛德華氏菌引發(fā)的疾病時(shí)，可以適當(dāng)加大使用劑量，達(dá)到最優(yōu)的治療效果。恩諾沙星在馬口魚體內(nèi)的建議休藥期至少為330 ℃·d。