一株乳酸菌的分離鑒定及在香蕉飲料發(fā)酵中的應(yīng)用

徐鑫龍， 郝之奎， 王震豪， 車謙， 趙鵬淵， 張杭琪， 杜樂樂， 李文潔， 王丹華， 梁金溪， 廖祥儒， 李建宋*

(1.臺州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究所，浙江 臺州 318000； 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

香蕉(Musaspp.)富含葡萄糖、果糖、果膠、纖維素、維生素及鐵、鈣等礦物質(zhì)，因營養(yǎng)豐富、口感美好而深受眾人喜愛[1-3]。醫(yī)學(xué)研究[4]顯示，香蕉具有清熱、通便、解毒、降壓、降疲勞、緩抑郁等功效。香蕉果皮雖厚，但果實容易機械損傷、裂口或經(jīng)滲透等方式被污染變腐[5]。香蕉對溫度敏感，難久藏，以香蕉為原料開發(fā)營養(yǎng)價值更高的發(fā)酵飲料，對促進香蕉深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義[6-7]。

目前，香蕉等水果的發(fā)酵多采用傳統(tǒng)的果蔬發(fā)酵工藝，即糖加水果的發(fā)酵方法，該方法為自然接種，有害微生物難以控制，且伴隨著亞硝酸鹽的生成，極易產(chǎn)生有毒物質(zhì)，無法有效控制安全隱患[8]。用乳酸菌純種發(fā)酵工藝可有效降低亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的產(chǎn)生，顯著提高發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)[9]，篩選植物源益生菌并建立果蔬發(fā)酵工藝有著更大優(yōu)勢。

本研究從美人蕉根際土壤中采集土樣，利用加入溴甲酚紫指示劑的MRS培養(yǎng)基篩選產(chǎn)酸菌株，從形態(tài)、生理生化研究和16S rRNA基因序列分析鑒定產(chǎn)酸菌株，以香蕉為原料利用該植物乳桿菌進行發(fā)酵工藝優(yōu)化，并對香蕉發(fā)酵飲料制造的可行性進行深入探討?，F(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣本采自江南大學(xué)清苑門口觀賞植物美人蕉(CannaindicaL.)根部土壤5～10 cm處；香蕉來源于市場采購的新鮮香蕉；酵母粉、牛肉浸膏、胰蛋白胨及葡萄糖等試劑為普通分析純；細菌基因提取試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

主要設(shè)備有旋轉(zhuǎn)式恒溫搖床(上海蘇坤實業(yè)有限公司)、超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、紫外分光光度計(UV-2000，美國UNICO公司)、電子天平(CP214奧豪斯儀器有限公司)、XP基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)、pH計(STARTER3100，美國OHAUS公司)、數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)、L-800氨基酸自動分析儀(日本日立公司)、高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國安捷倫公司)和高速離心噴霧干燥機(GEA Niro公司)。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g·L-1，酵母粉5.0 g·L-1，牛肉浸膏10.0 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，乙酸鈉5.0 g·L-1，檸檬酸氫二銨2.0 g·L-1，K2HPO42.0 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.58 g·L-1，MnSO4·4H2O 0.25 g·L-1，吐溫80 1 g·L-1，pH 6.2～6.6。固體MRS培養(yǎng)基另加瓊脂粉(1.5%)。

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：取1.6 g溴甲酚紫加入100 mL無水乙醇中，溶解后備用。

PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰酶水解酪蛋白5.0 g·L-1，胰蛋白胨5.0 g·L-1，酵母提取物10.0 g·L-1，鹽溶液40.0 mL·L-1。鹽溶液成分：NaCl 2.0 g·L-1，無水CaCl20.2 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.48 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，NaHCO310.0 g·L-1。

碳水化合物基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母粉2.5 g·L-1，吐溫80 0.1 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，1.6%的溴甲酚紫乙醇溶液1.0 mL·L-1，碳水化合物溶液50 mL·L-1，調(diào)pH至6.5。碳水化合物溶液：取L-鼠李糖、海藻糖、D-半乳糖、L-山梨糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-山梨醇、D-果糖、纖維二糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、棉籽糖、肌酸、肌醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖各10 g溶于1 L水中。

檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基：脫脂奶粉10.0 g·L-1，胰酶水解酪蛋白2.5 g·L-1，葡萄糖5.0 g·L-1，瓊脂15.0 g·L-1，溶液A 10.0 mL·L-1，溶液B 10.0 mL·L-1，用藥品配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)pH至6.5，115 ℃滅菌15 min后冷卻至45 ℃，然后加入溶液A和溶液B，混合均勻后倒平板，30 ℃避光干燥24 h備用。溶液A：高鐵氰化鉀10.0 g溶于100 mL蒸餾水中備用。溶液B：檸檬酸鐵1.0 g和枸櫞酸鈉1.0 g溶于40 mL蒸餾水中備用。

1.3 菌株篩選與應(yīng)用

1.3.1 菌株篩選

土壤樣本采集：江南大學(xué)清苑門口觀賞植物美人蕉處，清除地表土5～10 cm后采樣，取1 g土樣置入100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下在60 r·min-1的搖床中富集培養(yǎng)24 h。用滅菌水梯度稀釋至10-4、10-5、10-6，分別取不同梯度稀釋液100 μL涂布，于30 ℃恒溫箱倒置培養(yǎng)，至菌落長出。挑選黃色產(chǎn)酸的菌落，在含有0.15%溴甲酚紫的MRS固體培養(yǎng)基上進一步純化，直至獲得純培養(yǎng)物。

1.3.2 菌株鑒定

菌株形態(tài)學(xué)觀察。接種于MRS固體培養(yǎng)基上，30 ℃條件下，培養(yǎng)24 h后，觀察菌落和顯微特征。

菌株生理生化特征研究。參照《伯杰細菌鑒定手冊》及相關(guān)文獻[10-12]對獲得的菌株進行生理生化特性研究，以確定菌株種屬劃分。

菌株16S rRNA基因序列檢測。按照說明書提取基因組并以細菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增細菌16S rRNA基因。在50 μL反應(yīng)體系中加入DNA模板1 μL，27F引物1 μL，1492R引物1 μL，2×EasyTaqPCR Supermix 25 μL，加水22 μL。95 ℃預(yù)變性5 min后，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35次循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物利用3%瓊脂糖電泳檢測。

測序結(jié)果使用數(shù)據(jù)庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov研究同源性。根據(jù)比對結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，找出與數(shù)據(jù)庫同源性最高的已知菌種，推測待定菌株可能的屬或種。

1.3.3 菌株生長特性

生長溫度的影響。使用MRS培養(yǎng)基、1%接種量研究溫度對菌株的影響，溫度梯度為20、25、30、35和40 ℃，60 r·min-1搖床培養(yǎng)，16 h后600 nm處測定吸光度(D)。

pH的影響。使用MRS培養(yǎng)基、1%接種量研究起始pH對菌株的影響，起始pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在30 ℃溫度條件下60 r·min-1搖床培養(yǎng)，116 h后600 nm處測定D。

生長曲線和產(chǎn)酸能力的測定。用MRS培養(yǎng)基、1%接種量，在30 ℃條件下60 r·min-1搖床培養(yǎng)，每2 h采樣并于600 nm處測定D，參照相關(guān)文獻[13]研究菌株產(chǎn)酸能力。

1.3.4 香蕉發(fā)酵飲料研制

工藝流程：新鮮香蕉→去皮→切片護色(0.1%檸檬酸浸泡15 min)→打漿→過濾→調(diào)配→滅菌(95 ℃，5 min)→冷卻→接種→發(fā)酵→調(diào)配→成品。

發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗。為研究水和蜂蜜的添加量對香蕉發(fā)酵飲料中氨基酸含量的影響，設(shè)計水和蜂蜜添加量兩因素進行正交試驗。香蕉∶水(V∶V)與蜂蜜量(%)分別為：樣品1，1∶1和1.0%；樣品2，1∶1和1.5%；樣品3，1∶1和2.0%；樣品4，1∶2和1.0%；樣品5，1∶2和1.5%；樣品6，1∶2和2.0%；樣品7，1∶3和1.0%；樣品8，1∶3和1.5%；樣品9，1∶3和2.0%。1%接種量，起始pH 6.5，30 ℃、60 r·min-1發(fā)酵16 h，分別測定發(fā)酵前后氨基酸含量，以確定水和蜂蜜添加量最佳配比。

氨基酸含量的測定。采樣并稱量1 mL置于安瓿管中，加入6 mol·L-1HCl 8 mL，充氮封管，用細沙包圍，120 ℃條件下水解22 h后用4.8 mL 10 mol·L-1NaOH中和，用25 mL容量瓶定容，雙層濾紙過濾，10 000g離心10 min，取400 μL上清液置入液相專用樣品瓶內(nèi)，測定氨基酸含量[14]。

有機酸含量的測定。接種量1%，根據(jù)正交試驗結(jié)果確定的最佳水和蜂蜜比例構(gòu)建發(fā)酵體系，30 ℃條件下發(fā)酵16 h后終止，取樣后10 000g離心5 min，測上清液有機酸含量(乙酸、乳酸、蘋果酸和檸檬酸等)，采用高效液相法[15]。

黃酮含量的測定。1)蘆丁標準曲線的制定(比色法)：0.2 mg·mL-1蘆丁標準品溶液用95%乙醇配制，移液器吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，加入1 mL 4% NaNO3溶液混勻，6 min后加入8%Al(NO3)3溶液混勻，6 min后加入10 mL 12%NaOH溶液，定容后靜置，15 min后測定D(510 nm)。蘆丁濃度作為橫坐標，D作為縱坐標，擬合標準曲線，r>99.999 8。2)黃酮含量的測定：接種量1%，根據(jù)正交試驗結(jié)果確定的最佳水和蜂蜜比例構(gòu)建發(fā)酵體系，30 ℃條件下發(fā)酵16 h后終止，取5.00 mL發(fā)酵液樣品于100 mL三角瓶中，加70%乙醇25 mL，振蕩搖勻，超聲浸浴30 min，6 000g離心10 min，濾液倒入100 mL容量瓶中，20 mL 70%乙醇再浸濾渣后超聲浸浴30 min，3 000g離心5 min后取上清液，合并第一次上清液后加入70%乙醇定容至50 mL容量瓶，制成樣本備用。分別取適量發(fā)酵液，置于25 mL容量瓶中，加入1 mL 4%NaNO3溶液混勻，6 min后加入8%Al(NO3)3溶液混勻，6 min后加入10 mL 12%NaOH溶液，定容后靜置15 min，于510 nm處測定D，代入標準曲線得出的公式中，換算出樣品濃度值，計算樣品中的總黃酮含量。

香蕉飲料的感官評定。在香蕉∶水1∶2、蜂蜜添加量2.0%、接種量1%、30 ℃發(fā)酵16 h條件下，研究果葡糖漿添加量與香蕉飲料感官品質(zhì)之間的關(guān)系，設(shè)果葡糖漿添加量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%。參考國標感官評定法：邀請20位有感官評價經(jīng)驗的人員，從色、香、味及狀態(tài)等方面進行評定，滿分為100分，20位評定人員平均值為最終得分。

感官評分標準：色澤，鮮明柔和，有光澤，無雜色，均勻一致，評0～20分；氣味，有清新的香蕉果香和乳酸味，無異味，評0～30分；滋味，酸甜適口，口感細膩，無不良氣味，評0～30分；組織狀態(tài)，流動性好，均勻不分層，微混濁，無雜質(zhì)，評0～20分。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)特征

菌株菌落形態(tài)如圖1所示，形狀呈圓形，中間凸起，表面光滑，直徑約3 mm，菌落細密，呈灰白色或淺黃色。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌體為圓端直桿菌，單個、成對或短鏈狀，無鞭毛，但能運動，革蘭氏陽性，無芽孢。

圖1 Lactobacillus plantarum SYBC psL的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)特征

2.1.2 生理生化特性

參照《伯杰細菌鑒定手冊》，初步判斷菌株為乳桿菌屬，生理生化鑒定結(jié)果見表1。

表1 Lactobacillus plantarum SYBC psL的生理生化特性

2.1.3 16S rRNA基因分析

圖2是菌株16S rRNA片段PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，在1 500 bp處出現(xiàn)單一熒光條帶，無明顯拖尾。測序結(jié)果BLAST比對，與植物乳桿菌Lactobacillusplantarum16S rRNA基因序列同源性達99%。結(jié)合生理生化研究結(jié)果，確定該菌株為植物乳桿菌，并命名為植物乳桿菌SYBC psL(LactobacillusplantarumSYBC psL)。

圖2 Lactobacillus plantarum SYBC psL 16S rRNA片段PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳

2.2 菌株生長特性的研究

2.2.1 適宜生長溫度和pH

研究結(jié)果(圖3～4)表明，該菌株適宜培養(yǎng)溫度為30 ℃，最適pH為6.5。

圖3 培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響

圖4 初始pH對菌株生長的影響

2.2.2 生長曲線和產(chǎn)酸能力

菌株生長曲線如圖5所示，培養(yǎng)0～4 h為靜止期，4～12 h為指數(shù)生長期，12 h后為平衡期。菌株產(chǎn)酸能力較強，10 h內(nèi)pH由6.5下降至4.2，對數(shù)生長期過程產(chǎn)酸明顯。

圖5 菌株的生長曲線和產(chǎn)酸能力

2.3 菌株在香蕉飲料發(fā)酵中的應(yīng)用

2.3.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

香蕉飲料發(fā)酵前后總氨基酸含量變化如圖6所示，樣品6香蕉與水比例1∶2、蜂蜜2.0%時，發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸產(chǎn)生量最多。發(fā)酵后8種必需氨基酸含量變化情況列于表2，表中看出：除對照外，樣品3的色氨酸最高；樣品9的色氨酸最低；樣品2的蘇氨酸最高，樣品8的蘇氨酸最低；樣品6的賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸最高；樣品2的纈氨酸最高；樣品2的甲硫氨酸最高，樣品8最低。發(fā)酵后樣品6的總氨基酸和必需氨基酸量增長最多，所以香蕉與水比例為1∶2、蜂蜜添加2.0%為最優(yōu)發(fā)酵體系。

圖6 發(fā)酵前后總氨基酸含量的變化

表2 發(fā)酵后必需氨基酸含量的變化情況 單位 mg·L-1

2.3.2 有機酸含量的變化

發(fā)酵后，蘋果酸和檸檬酸含量明顯降低，乳酸含量升高，乙酸增加少許。說明發(fā)酵過程中，該菌以蘋果酸和檸檬酸為原料生產(chǎn)了乳酸和少量乙酸(圖7)。

圖7 發(fā)酵前后有機酸含量的變化

2.3.3 黃酮含量的變化

總黃酮含量發(fā)酵前為34.35 mg·g-1，發(fā)酵后為46.55 mg·g-1，說明經(jīng)過發(fā)酵，總黃酮含量增加了35.5%。黃酮具有抗過敏、消炎等作用，能有效清除體內(nèi)自由基，改善血液循環(huán)，阻止細胞衰老、退化和癌癥的發(fā)生，說明以香蕉為原料通過發(fā)酵研制的香蕉發(fā)酵飲料具有一定的營養(yǎng)保健價值。

2.3.4 香蕉飲料的感官評定

果葡糖漿添加量為10%時的感官評分最高，達86分(圖8)，此時產(chǎn)品清澈透明，呈深黃色，流動性好，酸甜度合適，口感細膩，有香蕉果香，氨基酸、乳酸和黃酮含量明顯提高。

圖8 果葡糖漿添加量對香蕉發(fā)酵飲料感官得分的影響

3 小結(jié)

本研究從美人蕉屬植物根際土壤篩選獲得一株產(chǎn)酸菌株，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征研究和16S rRNA基因序列分析，鑒定為一株植物乳桿菌，命名為LactobacillusplantarumSYBC psL；對菌株生長特性進行研究，其在溫度30 ℃、初始pH 6.5時，菌株生長最快，4 h后進入對數(shù)期，8 h生長速率達到最大，12 h左右達到穩(wěn)定期；以香蕉為原料，將LactobacillusplantarumSYBC psL應(yīng)用于香蕉飲料發(fā)酵，經(jīng)初步研究確定當香蕉與水的比例為1∶2、蜂蜜添加量為2.0%時，氨基酸含量增長最多，乳酸和黃酮含量也明顯升高；果葡糖漿添加量為10%時產(chǎn)品酵素的酸甜度適口，黏度適當，具有較高穩(wěn)定性。