6種殺菌劑對(duì)食用菌鏈孢霉的體外抑制作用

劉斌， 董照鋒

(1.陜西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，陜西 西安 710000； 2.商洛市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，陜西 商洛 726000)

食用菌以味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而逐漸成為人們餐桌上常見的健康食品。近年來(lái)，隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，食用菌在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的地位和作用越來(lái)越明顯。隨著國(guó)家環(huán)保政策調(diào)整和栽培方式的轉(zhuǎn)變，食用菌產(chǎn)業(yè)步入了規(guī)?；⒐S化、設(shè)施化、標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)展軌道。但鏈孢霉在很多香菇、木耳等食用菌生產(chǎn)基地發(fā)生，其生長(zhǎng)速度快，生活力強(qiáng)，如果處理不及時(shí)幾天內(nèi)就能引起大面積污染，調(diào)查中最高污染率達(dá)75%，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)有不少學(xué)者開展了抑制食用菌鏈孢霉的相關(guān)研究。趙長(zhǎng)江等[1]采用藥劑平板法分析了5種植物源農(nóng)藥對(duì)食用菌鏈孢霉的抑制效果，篩選出乙蒜素和丁子香酚作為其綠色防控的優(yōu)選植物源農(nóng)藥。張希等[2]采用平板涂布法考察了15種中藥材提取物對(duì)3種食用菌致病菌孢子萌發(fā)的影響，認(rèn)為大蒜、徐長(zhǎng)卿、小薊、金銀花、黃柏、土荊皮、石榴皮對(duì)鏈孢霉孢子萌發(fā)有較好的抑制作用。葉慧麗等[3]測(cè)定了4種生物殺菌劑對(duì)食用菌鏈孢霉的抑制作用，40 mg·kg-1中生菌素對(duì)鏈孢霉菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到100%，而對(duì)食用菌菌絲抑制率低于10%。劉釗等[4]開展了6種殺菌劑對(duì)鏈孢霉的抑菌效果試驗(yàn)，認(rèn)為100倍克霉靈和鏈孢克星對(duì)鏈孢霉抑菌作用較好。冀瑞卿等[5]采用生長(zhǎng)速率法和懸滴法測(cè)定了多黏類芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對(duì)食用菌鏈孢霉菌絲和孢子的抑制效果，認(rèn)為兩種生防制劑可分別作為鏈孢霉孢子和菌絲的抑制劑。李寧芳等[6]采用對(duì)比試驗(yàn)分析食用菌鏈孢霉感染的原因，提出了精準(zhǔn)預(yù)防、過(guò)程控制的一般污染和嚴(yán)重污染的控制對(duì)策。朱富春[7]提出了樹立防治意識(shí)、推選優(yōu)質(zhì)菌種、搞好環(huán)境衛(wèi)生、嚴(yán)格栽培操作、合理化學(xué)防治的綜合措施以防控食用菌鏈孢霉的為害。賈含琪[8]從土壤中篩選出一株對(duì)鏈孢霉有良好抑制作用的真菌，將其90%乙醇洗脫物稀釋成有效濃度為45%的制劑，用量為400 μL·mL-1時(shí)可有效抑制危害。為了篩選安全高效的防治藥劑，本研究選取微生物源農(nóng)藥、抗生素類農(nóng)藥和化學(xué)農(nóng)藥3大類6種藥劑開展食用菌鏈孢霉的體外抑制試驗(yàn)，同時(shí)考察其對(duì)食用菌菌絲生長(zhǎng)的影響，以期為食用菌生產(chǎn)中鏈孢霉的化學(xué)防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

430 g·L-1戊唑醇懸浮劑(鹽城利民農(nóng)化有限公司)；100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌粉劑(陜西鼎微生物科技有限公司)；0.15%四霉素水劑(遼寧微科生物工程股份有限公司)；2%春雷霉素水劑、3%多抗霉素水劑(績(jī)溪農(nóng)華生物科技有限公司)；40%多菌靈懸浮劑(江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司)；0.05 mol·L-1HCl(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

供試菌株于2020年春季在商洛市福眾嶺農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司香菇基地采集，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，連續(xù)純化兩代后接種在PDA試管斜面培養(yǎng)基，并置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 處理設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每種殺菌劑的試驗(yàn)濃度參考使用說(shuō)明推薦用量。A：430 g·L-1戊唑醇懸浮劑90 μg·mL-1；B：100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌粉劑500萬(wàn)芽孢·mL-1；C：0.15%四霉素水劑 2.0 μg·mL-1；D：2%春雷霉素水劑100 μg·mL-1；E：3%多抗霉素水劑60 μg·mL-1；F：40%多菌靈懸浮劑 1 000 μg·mL-1；CK：清水對(duì)照。

1.3 試驗(yàn)方法

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[9-10]和孢子萌發(fā)法[11-12]分別測(cè)定6種供試藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制效果。

含藥培養(yǎng)基的制備及菌絲接種：將馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基定量分裝于100 mL三角瓶中，121 ℃滅菌40 min，水浴鍋冷卻至50 ℃，分別加入6種供試藥劑，充分混合均勻后取10 mL注入滅菌的9 cm培養(yǎng)皿中制成試驗(yàn)濃度的藥劑平板，以等量無(wú)菌水培養(yǎng)基作空白對(duì)照。在PDA培養(yǎng)基活化菌株的菌落生長(zhǎng)旺盛處用打孔器取直徑6 mm的菌碟，每皿平板培養(yǎng)基放入1塊菌碟至中心位置，置于25 ℃、90%相對(duì)濕度下培養(yǎng)，分別于20、24 h用十字交叉法測(cè)量各皿菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)擬制率。菌絲生長(zhǎng)擬制率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)÷(對(duì)照菌落直徑-菌碟直徑)]×100%。

孢子懸浮液的制備及接種：50 mL無(wú)菌水加入0.05 mol·L-1HCl 2 mL備用。選取培養(yǎng)2～3 d已產(chǎn)生分生孢子的平板1～2皿，在無(wú)菌條件下加入10 mL上述制備液體，用接種鏟輕刮菌落表面，在已滅菌的口徑7 cm漏斗上加1層擦鏡紙，將孢子懸浮液過(guò)濾在已滅菌的50 mL錐形瓶?jī)?nèi)，并加滅菌的棉塞。取1～2滴孢子懸浮液在顯微鏡下觀察孢子量，以加入適量滅菌水調(diào)節(jié)孢子濃度至每個(gè)視野80～100個(gè)孢子為宜。在藥劑平板培養(yǎng)皿背面用記號(hào)筆畫3個(gè)小圈標(biāo)記孢子懸浮液滴入點(diǎn)位置以便觀察，3個(gè)點(diǎn)呈三角形排列，每點(diǎn)滴1滴孢子懸浮液。以等量無(wú)菌水培養(yǎng)基作空白對(duì)照。將各處理置于25 ℃、90%相對(duì)濕度下培養(yǎng)6～8 h，在對(duì)照組孢子萌發(fā)80%～90%時(shí)將對(duì)應(yīng)處理組全部取出放入4 ℃冰箱冷藏，終止孢子繼續(xù)萌發(fā)并逐一鏡檢，統(tǒng)計(jì)各處理孢子萌發(fā)情況。

孢子萌發(fā)率=(孢子萌發(fā)數(shù)量÷觀察孢子數(shù)量)×100%；孢子萌發(fā)抑制率=[(對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)÷對(duì)照孢子萌發(fā)率]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

6種供試殺菌劑對(duì)食用菌鏈孢霉菌絲抑制率均在60%以上，具有較好的抑菌作用(表1、圖1)。其中，處理F和A抑菌作用較好，20 h抑制率分別為95.5%和90.3%，24 h抑制率分別為95.6%和91.5%，24 h較20 h的抑制率略有增加。處理B、C、D、E在20 h時(shí)的抑制率分別為73.9%、79.5%、62.6%和63.5%，24 h時(shí)抑制率分別為72.0%、81.4%、62.3%和60.6%。20 h和24 h處理F和處理A之間、處理D和處理E之間差異不顯著。處理C和處理B于20 h差異不顯著，與其他處理之間差異顯著。24 h時(shí)所有處理之間差異均極顯著。

表1 6種殺菌劑對(duì)菌絲的抑制作用

圖1 6種殺菌劑對(duì)食用菌鏈孢霉菌絲24 h抑制效果

2.2 6種藥劑對(duì)分生孢子的抑制作用

接種后8 h觀察孢子萌發(fā)情況，CK萌發(fā)率達(dá)到75.1%，處理A、C和F抑制率分別為100%、99.9%和71.5%(表2)，處理A與處理C差異不顯著，而與處理F差異顯著。其他處理對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用較差，與CK無(wú)顯著差異。

表2 6種殺菌劑對(duì)分生孢子的抑制作用

3 小結(jié)與討論

因四霉素外其他5種供試農(nóng)藥是《綠色食品 農(nóng)藥使用準(zhǔn)則》[13]推薦使用的農(nóng)藥，所以本研究未考察6種殺菌劑對(duì)食用菌菌絲的安全性。在2021年12月下旬的栽培試驗(yàn)中，我們通過(guò)栽培基質(zhì)加標(biāo)的方法考察了供試農(nóng)藥對(duì)木耳菌絲生長(zhǎng)的影響，截至2022年3月20日菌包發(fā)菌結(jié)束，供試農(nóng)藥并未對(duì)菌絲產(chǎn)生明顯的影響。在選用食用菌殺菌劑時(shí)，應(yīng)盡量選擇對(duì)孢子萌發(fā)抑制作用強(qiáng)，而對(duì)菌絲抑制率較低的藥劑。

供試6種殺菌劑對(duì)食用菌鏈孢霉菌絲皆有抑制效果，40%多菌靈懸浮劑 1 000 μg·mL-1和430 g·L-1戊唑醇懸浮劑 90 μg·mL-1對(duì)鏈孢霉菌絲抑制效果顯著，其次是0.15%四霉素水劑 2.0 μg·mL-1和100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌粉劑 500萬(wàn)芽孢·mL-1，2%春雷霉素水劑 100 μg·mL-1和3%多抗霉素水劑 60 μg·mL-1的抑制率也達(dá)到60%以上。430 g·L-1戊唑醇懸浮劑 90 μg·mL-1、0.15%四霉素水劑 2.0 μg·mL-1、40%多菌靈懸浮劑 1 000 μg·mL-1對(duì)鏈孢霉分生孢子具有較好的抑制作用，接種后8 h 430 g·L-1戊唑醇懸浮劑 90 μg·mL-1處理的分生孢子無(wú)一萌發(fā)，0.15%四霉素水劑 2.0 μg·mL-1的抑制率高達(dá)99.9%，40%多菌靈懸浮劑 1 000 μg·mL-1的抑制率達(dá)到71.5%。綜上所述，食用菌鏈孢霉宜選用戊唑醇、多菌靈和四霉素進(jìn)行防治，濃度參考推薦使用量。