口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)純度、免疫持續(xù)期、攻毒保護的研究

陳 婷，張起偉，辛俊寶，代創(chuàng)科，黎倩倩，倪春霞

(楊凌金海生物技術有限公司，陜西 楊凌 712100)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的多發(fā)于豬、牛、羊等偶蹄目動物的一種急性、烈性、熱性、高度接觸性傳染的疾病。世界動物衛(wèi)生組織已將其列為A類傳染病之首，對畜牧業(yè)發(fā)展和人類食品衛(wèi)生安全造成巨大威脅。注射口蹄疫疫苗是目前預防豬、牛、羊感染口蹄疫最便捷、最有效的手段。絕大多數(shù)地區(qū)、國家仍采取以免疫滅活疫苗為主的防控措施。

口蹄疫滅活疫苗是一種以細胞培養(yǎng)技術為載體制備口蹄疫病毒液，并將病毒液徹底滅活，獲得口蹄疫抗原的疫苗制備方式。因此，滅活疫苗的安全性、免疫效果的穩(wěn)定性、對動物的保護率是評定口蹄疫疫苗質量的重要指標。

為了解口蹄疫滅活疫苗免疫動物后的免疫效果、免疫安全性及免疫持續(xù)期，準確掌握口蹄疫滅活疫苗對牛的保護情況，本文選用口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)免疫接種6～9月齡口蹄疫陰性牛，監(jiān)測免疫后的NSP抗體水平，評估疫苗免疫的安全性及純度。同時，持續(xù)測定免疫后動物的口蹄疫O型、A型抗體水平，評估疫苗的免疫效果及抗體水平持續(xù)期，并對免疫牛進行攻毒保護，評估疫苗免疫的可靠性。

1 材料和方法

1.1 疫苗種類

口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)，廠家：楊凌金海生物技術有限公司。

1.2 實驗動物

6～9月齡口蹄疫抗體陰性牛(ELISA)，共16頭，其中12頭用于免疫，4頭作為對照。

1.3 試劑盒選擇

口蹄疫O型、A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒購于蘭州獸研科技有限公司(原中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所)，口蹄疫非結構蛋白3ABC抗體檢測試劑盒購于北京金諾百泰生物技術有限公司。

1.4 動物免疫接種

隨機抽取口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)三瓶，測定疫苗146s抗原含量、總蛋白含量及內毒素含量，混勻后用于免疫。對免疫組牛進行兩次免疫，免疫牛舌背面皮內各分20點注射滅活疫苗，每點注射0.1 mL，共2 mL。一次免疫28 d后對免疫牛進行二次免疫。方法同一次免疫。免疫時間從第一次免疫后開始計算。

1.5 疫苗免疫純度及安全性測定

在免疫期間持續(xù)觀察、記錄免疫牛的身體狀況，并在免疫不同階段(免疫后5 d、28 d、56 d)對牛采血，使用口蹄疫非結構蛋白3ABC抗體檢測試劑盒對血清進行口蹄疫非結構蛋白(NSPs)抗體測定。

1.6 疫苗免疫持續(xù)期抗體水平測定

使用口蹄疫O型、A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒(免疫后5 d、28 d、56 d、85 d、110 d)牛血清進行口蹄疫O型、A型抗體水平測定。

1.7 攻毒保護測試

攻毒測試在本單位動物房生物安全三級防護區(qū)進行，選用OHM/02株、A/XJNC/2010株強毒對免疫后110 d免疫牛及對照牛做攻毒測試。免疫組牛分兩組，分別于舌上皮下兩側分兩點分別注射強毒OHM/02株(10ID50/0.2 mL)、A/XJNC/2010株(10ID50/0.2 mL)，連續(xù)觀察10 d，計算疫苗對免疫牛的保護率。

2 結 果

2.1 疫苗純度及安全性檢測結果

免疫用疫苗質量測定如表1，第一次免疫用疫苗146s抗原平均含量為21.7 μg/頭份，總蛋白均值138 μg/mL, 內毒素含量含量均小于0.25 EU/頭份，二次免疫用疫苗146s抗原平均含量為21.9 μg/頭份，總蛋白均值129 μg/mL, 內毒素含量含量均小于0.25 EU/頭份，符合注射要求。免疫后持續(xù)觀察免疫牛、對照牛牛舌、口腔粘膜、乳房和蹄部等可能產生口蹄疫癥狀的部位，在整個免疫階段，免疫牛、對照牛均未出現(xiàn)口蹄疫癥狀。在免疫后5 d、28 d、56 d對牛血清進行口蹄疫非結構蛋白(NSPs)ELISA測定(表2)，免疫牛、對照牛NSPs抗體均為陰性。

表1 免疫用疫苗146s抗原含量、總蛋白含量、內毒素含量檢測結果Table 1 Results of 146s antigen content, total protein and endotoxin content of immune vaccine

表2 免疫組免疫后NSPs抗體水平檢測結果Table 2 The levels of non-structural protein (NSPs) antibodies after the immunization group were immunized

2.2 口蹄疫疫苗免疫持續(xù)期抗體水平檢測結果

免疫前、免疫持續(xù)期牛血清口蹄疫O型、A型抗體水平測定結果如圖1所示，在免疫后28 d口蹄疫O型、A型抗體水平均出現(xiàn)明顯上升?？谔阋逴型抗體在免疫后28 d抗體水平達到最大值，28 d免疫組牛二次免疫后，口蹄疫O型抗體水平持續(xù)保持在較高水平?？谔阋逜型抗體在免疫后56 d抗體水平達到最大值，并在后期保持較高水平?？谔阋逴型抗體效價在免疫28 d后均顯著高于A型抗體效價，并在免疫后28 d呈極顯著差異。根據(jù)試劑盒判定標準，?？贵w效價大于等于1∶128，動物99%以上保護效力，在免疫后28 d，免疫組O型平均抗體水平高于99%以上保護線，并在整個免疫持期維持在較高水平。免疫組A型平均抗體水平在免疫后28 d接近99%以上保護線，在免疫后56 d高于99%以上保護線，并在免疫持續(xù)后期維持在較高水平。

圖1 疫苗免疫持續(xù)期免疫組口蹄疫持續(xù)性O型、A型抗體效價*差異顯著(P<0.05)，**差異極顯著，(P<0.01)。Fig. 1 The titer of type O and type A antibodies of FMD in the immunization group during the maintenance phase of immunized group*means significant difference (P<0.05), **means highly significant difference(P<0.01).

2.3 攻毒保護測試結果

在免疫后110 d對免疫組及對照組牛攻毒保護測試，結果見表3，免疫組牛經O型OHM/02株口蹄疫強毒、A型A/XJNC/2010株強毒攻擊后，均未產生口蹄疫典型臨床癥狀。對免疫組牛保護率為100%。對照組牛經攻毒后，全部產生口蹄疫病癥。

表3 免疫組在免疫110 d后牛O型、A型毒株的攻毒保護結果Table 3 The results of the protective effect of bovine type O and type A viruses after 110 days of immunization

3 討 論

目前，國內外絕大多數(shù)地區(qū)對口蹄疫的防御措施仍以接種口蹄疫滅活疫苗為主，生產的口蹄疫疫苗應盡量減少疫苗質量原因引起的動物不良反應。試驗結果顯示，免疫組牛經口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)免疫接種，在整個免疫階段，免疫牛均未出現(xiàn)口蹄疫典型癥狀，無不良反應。

NSPs抗體是區(qū)分感染口蹄疫病毒動物與口蹄疫疫苗免疫動物的重要指標。盡管國內口蹄疫滅活制備工藝有飛躍性提高，但口蹄疫滅活疫苗仍存在含痕跡量NSPs的風險。這將嚴重影響對口蹄疫感染動物與免疫動物的判斷，同時也影響口蹄疫疫苗的免疫效果。動物經口蹄疫疫苗免疫后，至少檢測兩次動物血清NSPs抗體，用以評價疫苗的純度。本研究免疫牛NSPs抗體水平均為陰性，說明口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)疫苗純度高。

滅活疫苗具良好的免疫原性，高質量的口蹄疫疫苗免疫動物后可引起動物機體產生高濃度的特異性抗體，對免疫動物產生良好的免疫效果。本試驗口蹄疫疫苗免疫持續(xù)期O型、A型抗體水平在免疫后28天均明顯升高且逐步達99%以上保護效力，并在整個持續(xù)期保持較高抗體水平，口蹄疫疫苗免疫持續(xù)期內O型抗體水平高于A型抗體。這表明免疫組牛注射口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)可誘導機體產生較高水平特異性抗體，且O型抗體水平更高。

攻毒保護試驗是衡量口蹄疫疫苗免疫效果的重要指標。本試驗中免疫組牛均未產生口蹄疫典型臨床癥狀。結果表明，口蹄疫疫苗對免疫牛具有良好的保護作用?？谔阋逴型、A型二價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)對牛具有良好的免疫效果。

綜上所述，口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)免疫的安全性及純度良好。免疫持續(xù)期內可誘導免疫牛產生較高濃度特異性抗體，對口蹄疫病毒防御可靠性強，對免疫牛產生攻毒保護，免疫效果良好。