豬源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

何金嬌，毛雪飛，孫國鵬，馬萌萌，張 靈，吳云舟

(1.新鄉(xiāng)學院 生命科學與基礎醫(yī)學學院，河南 新鄉(xiāng)453003；2.東北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱150030)

大腸桿菌()是獸醫(yī)臨床上最常見的導致動物細菌感染的病原菌之一，亦是人及動物的腸道共生菌，其發(fā)病率和死亡率位于仔豬之首。隨著我國養(yǎng)豬的規(guī)模化發(fā)展，大腸桿菌病逐漸由條件性疾病演變?yōu)槌０l(fā)性疾病，嚴重阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展。在疾病的防治過程中，抗生素的大量使用導致了菌株耐藥性的產(chǎn)生，目前出現(xiàn)了一種細菌耐多種藥物的情況，而且大腸桿菌的耐藥性也越來越嚴重。大腸桿菌耐藥性機制的產(chǎn)生以及如何減少細菌耐藥性，已經(jīng)成為人們越來越關心的問題。目前，國內外對細菌耐藥性的研究不僅僅停留在表型上，已經(jīng)開始對耐藥基因進行分子水平的研究。從分子層面研究細菌耐藥性，能夠更深入的揭示細菌的耐藥機制和傳播途徑，更好的控制耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播，為臨床獸醫(yī)用藥和新藥的研發(fā)提供科學基礎和理論依據(jù)。本研究對河南省新鄉(xiāng)市某規(guī)?；i場進行大腸桿菌的分離鑒定、耐藥性分析和耐藥基因檢測等初步研究，為深入研究耐藥性及其機制、指導臨床合理用藥和防治豬源大腸桿菌病提供了一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

2018年9～12月份從河南省新鄉(xiāng)市某規(guī)?；i場采集腹瀉豬的肛門棉拭子。大腸桿菌標準菌株(ATCC 25922)購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 主要試劑及引物

氨芐西林、萬古霉素、復方新諾明、氯霉素、四環(huán)素、慶大霉素和左氧氟沙星等藥敏紙片，伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基均購自杭州微生物試劑有限公司；細菌DNA提取試劑盒和革蘭氏染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；DL2000 DNA marker、Taq DNA聚合酶等，購自TaKaRa公司。

以GeneBank中查找的相關序列為模板，通過primer 5.0軟件設計大腸桿菌16S rRNA，查找文獻獲得磺胺類1、喹諾酮類(6') --、-內酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類(3')-Ⅱ、多肽類-1、氯毒素基因的引物，送至上海英駿生物技術有限公司進行合成。序列如表1所示。

1.3 細菌的分離純化

將無菌條件下采集的肛門拭子接種于營養(yǎng)肉湯中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，涂布于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，挑取紫黑色并帶有金屬光澤的單個菌落，通過平板劃線法將其再次接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基中進行純化。從中挑取紫黑色并帶有金屬光澤的單菌落，然后通過平板劃線法接種于麥康凱培養(yǎng)基，觀察是否全是粉紅色菌落。從中挑取特征明顯的菌落劃線于麥康凱培養(yǎng)基進行再次純化，經(jīng)革蘭氏染色后于光學顯微鏡下觀察細菌的染色情況和形態(tài)特征。

1.4 細菌的生化鑒定

制備生化鑒定培養(yǎng)基，將疑似大腸桿菌分離菌株接種于葡萄糖培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基、細菌微量生化鑒定管(三糖鐵瓊脂實驗)進行鑒定。以大腸桿菌質控菌株ATCC25922作為對照。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 分離菌株的分子鑒定

在無菌條件下，將本實驗所分離的各株大腸桿菌疑似菌株接種于LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h。然后按照細菌DNA基因組提取試劑盒說明書，提取大腸桿菌的基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

為了進一步確定分離菌株的類型，以基因組DNA為模板，采用表1中的相關上游和下游引物，擴增16S rRNA，并將ATCC25922作為陽性對照。PCR反應體系10 μL：Taq DNA 聚合酶 0.5 μL、10×PCR Buffer 1 μL、dNTPs 1 μL、上、下游引物各為1 μL、基因組DNA 1.5 μL、ddHO補至10 μL。反應條件為： 94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min、退火溫度為56 ℃、72 ℃延伸1 min，20個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。并將擴增后的16S rRNA送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.6 藥敏試驗

利用K-B法，對大腸桿菌進行藥物敏感性試驗。將鑒定后的大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基進行活化，然后將0.5麥氏濁度大腸桿菌純培養(yǎng)物均勻地涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基上，室溫下放置數(shù)分鐘后，再用無菌鑷子夾取藥敏紙片，均勻貼在LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18 h后觀察并測量抑菌圈大小。以ATCC25922作標準質控菌株。判定標準：抑菌圈直徑≥20 mm時，為極度敏感；15 mm≤抑菌圈直徑≤20 mm時，為高度敏感；10 mm≤抑菌圈直徑≤15 mm時，為中度敏感；0 mm≤抑菌圈直徑≤10 mm時，低度敏感；抑菌圈直徑=0 mm時，為不敏感或耐藥。

1.7 耐藥基因檢測

以基因組DNA為模板，分別采用已合成的上游和下游引物，對分離鑒定后大腸桿菌的耐藥基因進行PCR檢測。PCR反應體系10 μL：Taq DNA 聚合酶 0.5 μL、10×PCR Buffer 1 μL、dNTPs 1 μL、上、下游引物各為1 μL、基因組DNA 1.5 μL、ddHO補至10 μL。反應條件為： 94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min、退火1 min、72℃延伸1.5 min ，30個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。檢測的耐藥基因及其退火溫度如表1所示。

2 結果與分析

2.1 細菌生長情況

混合菌涂布后，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上可以觀察到帶有紫色金屬光澤，直徑約為1 mm左右的邊緣整齊光滑的菌落(圖1A)。然后再通過平板劃線法將初步篩選到的菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基上，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上可以觀察到圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤、直徑約為1 mm左右的呈紅色或粉紅色凸起的菌落(圖1B)。挑取經(jīng)兩次純化培養(yǎng)后的菌株，進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下可觀察到試驗菌株為革蘭氏陰性菌，形態(tài)呈卵圓形短小桿菌，可初步鑒定為疑似大腸桿菌(圖2)。

圖1 純化菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of purified strains

圖2 分離菌株的革蘭氏染色(40×)Fig.2 Gram staining of isolated strains (40×)

2.2 細菌的生化鑒定結果

將各分離菌株進行生化試驗，通過觀察發(fā)現(xiàn)分離的15株大腸桿菌疑似菌株均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，呈陽性。且不產(chǎn)生HS，呈陰性，符合大腸桿菌的生化特性。

2.3 菌株的分子鑒定

分離的大腸桿菌疑似菌株經(jīng)形態(tài)學、生化特性鑒定后的分離菌株，進行特異性16S rRNA的PCR擴增，擴增產(chǎn)物的凝膠電泳檢測結果如圖3所示，所擴增出的片段均為大小約為1 450 bp的片段，符合目的基因片段的長度大小，與設計引物目的基因片段大小相似，測序結果與16S rRNA(登錄號：NR_024570.1)經(jīng)DNAMAN比對分析同源性為99.04%。進一步確認了所分離的菌株為大腸桿菌。

圖3 純化菌株的16S rRNA的PCR鑒定M. DL2000 DNA marker; 1. PCR鑒定;2～3. 陰性對照;4. 陽性對照Fig.3 PCR identification of 16S rRNA of purified strainsM. DL2000 DNA marker; 1. PCR identification;2～3. Negative control; 4. Positive control

2.4 藥敏試驗結果

由表2可知，15株大腸桿菌對氨芐西林、萬古霉素、復方新諾明、氯霉素、四環(huán)素的耐藥率均達到了100%，對慶大霉素的耐藥率達到了60.0%，對左氧氟沙星的耐藥率達到了26.7%，其中標準質控菌株則對所測試的抗生素大部分表現(xiàn)敏感?？傮w來看，該規(guī)模化豬場分離出的15株大腸桿菌無一株完全敏感，對β-內酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類、多肽類和氯霉素類具有普遍的耐藥性，臨床上應盡量少使用或不使用這5種藥物，對喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素均具有較高的敏感性。

大腸桿菌多重耐藥指數(shù)(MARI)的公式為A/BC，其中A是細菌總抗菌藥物耐藥值，B是檢測時所使用的抗菌藥物的數(shù)目，C是所進行檢驗的菌株數(shù)，MARI取值范圍為0～1，MARI的數(shù)值越大，說明多重耐藥的水平越高。在此次試驗中，A為73、B為7、C為15，MARI為0.695。說明此次試驗中分離菌株的多重耐藥性較高，應引起養(yǎng)殖廠的重視。

表2 15株大腸桿菌對7種抗菌藥物的藥敏試驗結果Table 2 Susceptibility results of 15 strains of E. coli against 7 antimicrobial drugs

2.5 耐藥性基因的PCR擴增

15株大腸桿菌分離菌株耐藥基因的PCR檢測結果匯總如表3所示，檢出率最高的為氯霉素類的floR基因(100%)，其次是β-內酰胺類的基因(80.0%)，四環(huán)素的基因(26.7%)，表明這些耐藥基因可能是導致大腸桿菌對相應抗生素產(chǎn)生耐藥的原因。

由于大腸桿菌在對某一種藥物產(chǎn)生抗性繼而發(fā)生基因突變時，突變的方向是不確定的，所產(chǎn)生的抗性基因是多種多樣的，因此所帶有的抗性基因并不是唯一的。在此次試驗中對復方新諾明、萬古霉素、左氧氟沙星、慶大霉素藥物出現(xiàn)了100%抗性，而未檢驗出相應的1、-1、(6')--、(3')-Ⅱ基因，可能是因為檢測的大腸桿菌所含的抗性基因為2、3、-2、-3、(3)-Ⅱ、中的一種，而不是此次試驗所檢測的1、-1、(6')--、(3')-Ⅱ基因。

表3 大腸桿菌分離菌株的耐藥基因分布率Table 3 Distribution of drug resistance genes of E. coli isolates

3 討 論

細菌耐藥性(AMR)已成為當代醫(yī)學和制藥公司面臨的一個嚴重問題。耐藥菌感染數(shù)量的增加已經(jīng)嚴重威脅全球公共健康，其發(fā)病率和致死率均很高。任何治療劑的成功使用都會受到從首次使用時起對該抗菌藥物可能產(chǎn)生的耐受性或耐藥性的影響?？股刈鳛?0世紀最重要的醫(yī)學發(fā)現(xiàn)之一，在食源性動物疾病治療中發(fā)揮了不可替代的作用。據(jù)統(tǒng)計，2010年，牛、雞和豬每生產(chǎn)1 kg，動物的全球平均年抗菌藥物消費量分別為45 mg/kg、148 mg/kg和172 mg/kg。2010年至2030年，全球抗菌藥物消費量將增長67%，對中國來說，抗菌藥物消費量的增長將達到99%。

此外我國豬源性食品總消費量和人均消費量居世界首位。豬源性食品的質量安全和養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展與我們的健康密切相關。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，使用抗生素的過程中不僅殺滅了致病菌，也破壞了原有的正常菌群，長期使用造成了藥物殘留及耐藥性的產(chǎn)生。大腸桿菌是人類和動物腸道中的主要棲居菌，從個體出生后即進入腸道，并終生攜帶。其耐藥性的不斷出現(xiàn)，以及耐藥基因的交叉出現(xiàn)必然會導致以后疾病防治的困難。因此，為了避免新耐藥菌株的產(chǎn)生，研制抗生素替代品已成為必然，否則必將導致大腸桿菌的耐藥情況越來越嚴峻，對人類與動物的健康造成巨大威脅。

陳慧敏等從河南省不同地區(qū)采集腹瀉死亡仔豬分離鑒定出8株致病性大腸桿菌，通過K-B法測定8株大腸桿菌對21種抗菌藥物的耐藥性。李金朋等研究表明，大腸桿菌對氨芐西林、氨曲南、慶大霉素、卡那霉素、利福平和克林霉素耐藥，其中92.41%的大腸桿菌表現(xiàn)為多重耐藥。張炳亮等研究表明，23株致病性大腸桿菌對抗生素類藥物均有不同程度的耐藥性，其中對青霉素、紅霉素、四環(huán)素、卡那霉素、多西環(huán)素、氟哌酸、氨芐西林等7種抗生素的耐藥性較強，且均在70%以上。而此次實驗大腸桿菌的MARI為0.695，說明大腸桿菌的多重耐藥性已較為嚴重。

耐藥基因可通過質粒、整合子、轉座子等移動元件在不同細菌間傳播，也可在動物、人和環(huán)境間傳播。細菌一旦獲得耐藥基因，就可以使相應的抗菌藥失效，而當其獲得多種耐藥基因時，就會使該細菌引起的疾病變得難以救治。本試驗從河南省新鄉(xiāng)市某規(guī)模化豬場中分離了15株大腸桿菌，檢測出氯霉素類基因(100%)，β-內酰胺類基因(80.0%)，四環(huán)素基因(26.7%)。與張明亮等對豫北地區(qū)大腸桿菌耐藥基因的檢測結果β-內酰胺類基因(100%)，彭珂楠等對四川地區(qū)大腸桿菌耐藥基因檢測結果氯霉素類基因(81.82%)結果相近，說明大腸桿菌對氯霉素類及β-內酰胺類抗生素產(chǎn)生抗性已經(jīng)是一個較為普遍的現(xiàn)象。從產(chǎn)生抗性的機理方面來說，β-內酰胺類耐藥基因，通過表達β-內酰胺酶消減了β-內酰胺類抗菌藥的殺菌作用；四環(huán)素類耐藥基因，與細菌的核糖體結合，從而干擾細菌蛋白質的翻譯來發(fā)揮抗菌藥的作用；氯霉素類耐藥基因通過特異/非特異的外排泵基因編碼的外排泵系統(tǒng)使細菌獲得耐藥性。

本研究從大腸桿菌耐藥率的方面揭示了新鄉(xiāng)市養(yǎng)豬場抗生素的使用情況，對養(yǎng)豬場抗生素的使用提供了一定的理論基礎及方向。通過對大腸桿菌攜帶耐藥基因的基因型進行分析鑒定，為新鄉(xiāng)市大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生的分子機理研究提供了參考，也為該病的臨床治療奠定了基礎。