微生物菌劑對(duì)切花玫瑰白粉病的防效及產(chǎn)質(zhì)量的影響

董瓊娥, 楊順安, 羅 聰, 張振榮, 莫明和, 童江云*

(1.昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650118； 2.昆明市晉寧區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心， 云南 昆明 650607； 3.云南大學(xué) 省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南 昆明 650091)

0 引言

【研究意義】切花玫瑰為薔薇科薔薇屬多年生落葉灌木，是重要的鮮切花材料，也是世界第一大切花，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，切花玫瑰占中國花卉生產(chǎn)的80%以上[1]。切花玫瑰白粉病是一種世界性病害，全球均有發(fā)生。近年來，隨著切花玫瑰品種結(jié)構(gòu)優(yōu)化、種植區(qū)域和規(guī)模擴(kuò)大，白粉病在溫室設(shè)施栽培中頻發(fā)，危害呈加重趨勢(shì)[2-3]。王麗花等[1]報(bào)道，溫室條件下栽培的月季白粉病發(fā)病率在60%～80%，可使產(chǎn)品減產(chǎn)30%以上。為了控制白粉病的發(fā)生，種植戶頻繁使用化學(xué)農(nóng)藥，不但耗費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力，還對(duì)環(huán)境造成污染。目前人們通過改變?cè)耘鄺l件、廣泛使用殺菌劑及培育抗病品種，在一定程度上減輕白粉病的危害，但白粉病病原菌會(huì)不斷產(chǎn)生新的生理小種[4]，使植株抗性消失、病原菌抗藥性增強(qiáng)。因此，開展玫瑰白粉病微生物菌劑篩選對(duì)切花玫瑰生產(chǎn)意義重大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生物防治在作物病害管理方面具有巨大的潛力，已發(fā)現(xiàn)一些生物防治方法如使用微生物拮抗劑、植物制劑和生物制品等對(duì)玫瑰白粉病真菌有效[5]。KUMAR等[6]使用不同生態(tài)友好方法對(duì)玫瑰白粉病進(jìn)行防治發(fā)現(xiàn)，在溫室條件下，枯草芽孢桿菌的防效為74.12%，蠟蚧輪枝菌的防效為70.55%，哈茨木霉的防效為67.33%。王麗花等[1]研究表明，通過在月季植株根部土壤澆施枯草芽孢桿菌Y1336菌液，對(duì)月季白粉病有較好的防治效果，且能明顯提高月季切花的產(chǎn)量和質(zhì)量?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】植物益生菌主要來源于土壤及植物，在作物增產(chǎn)、耕地土壤修復(fù)、改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、增加植物抗逆性、防治土傳病害、提高肥料利用率等方面效果顯著，日本、歐盟等發(fā)達(dá)國家一直在開展此方面的研究，并已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境保護(hù)等方面取得了很好的經(jīng)濟(jì)及生態(tài)效益。在花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展越來越注重品質(zhì)、農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境因農(nóng)藥不合理使用而承受巨大壓力及大健康產(chǎn)業(yè)背景下，具有綠色、健康、可持續(xù)等特點(diǎn)的微生物防治菌劑的研發(fā)、篩選和應(yīng)用顯得尤為必要且很重要。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)切花玫瑰白粉病病原菌的鑒定及田間藥效試驗(yàn)，研究短小芽孢桿菌、短短芽孢桿菌和哈茨木霉菌3種微生物菌劑對(duì)切花玫瑰白粉病的防治效果及產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，以期為切花玫瑰白粉病綠色防治提供科學(xué)依據(jù)，從而促進(jìn)切花玫瑰產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2020年6—10月在昆明市晉寧區(qū)寶峰街道古城村委會(huì)玫瑰田進(jìn)行，試驗(yàn)地土種為粉泥田，質(zhì)地屬于砂壤土，土壤pH 4.96，水溶性鹽分總量9.4 g/kg，有機(jī)質(zhì)含量30.78 g/kg，堿解氮223 mg/kg，有效磷40.5 mg/kg，速效鉀507 mg/kg。土壤養(yǎng)分含量豐富。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試驗(yàn)作物 選擇栽培面積大、抗白粉病能力相對(duì)較弱的切花玫瑰品種芬得拉(1年生)作為試驗(yàn)品種。試驗(yàn)玫瑰為溫室大棚栽培，水肥一體化設(shè)備供水、供肥。

1.2.2 試驗(yàn)藥劑 玫瑰白粉病常規(guī)防治農(nóng)藥25%乙嘧酚磺酸酯，購于市場(chǎng)；5億CFU/g短小芽孢桿菌、10億CFU/g短短芽孢桿菌和2億CFU/g哈茨木霉菌，由云南大學(xué)云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 白粉病病原菌的采集及鑒定 用無菌工具分別采集試驗(yàn)地玫瑰葉片上白粉病孢子及染病葉片于無菌離心管中，快速帶回實(shí)驗(yàn)室，參照《中國真菌志》[7]方法在無菌操作臺(tái)上對(duì)白粉病孢子及菌絲形態(tài)進(jìn)行顯微觀察。同時(shí)對(duì)采集的病原菌進(jìn)行分子特征鑒定，用真菌DNA提取試劑盒提取真菌基因組DNA，用引物ITS4、ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送擎科生物公司進(jìn)行ITS r DNA基因測(cè)序，獲得的DNA序列提交Gen Bank核酸數(shù)據(jù)庫，通過Blast序列同源比對(duì)，利用MEGA 5.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.3.2 田間藥效試驗(yàn) 昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院前期實(shí)驗(yàn)室切花玫瑰白粉病防治盆栽試驗(yàn)表明，5億CFU/g短小芽孢桿菌、10億CFU/g短短芽孢桿菌、2億CFU/g哈茨木霉菌各300倍稀釋液對(duì)切花玫瑰白粉病的防治效果較好。據(jù)此，田間試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，處理1：5億CFU/g短小芽孢桿菌300倍稀釋液；處理2：10億CFU/g短短芽孢桿菌300倍稀釋液；處理3：2億CFU/g哈茨木霉菌300倍稀釋液；處理4(CK2)：藥劑對(duì)照，25%乙嘧酚磺酸酯600倍稀釋液(白粉病常規(guī)防治農(nóng)藥)；處理5(CK1)：清水空白對(duì)照。每處理3次重復(fù)，各處理間設(shè)保護(hù)行，小區(qū)面積為6.8 m2，隨機(jī)排列。各試驗(yàn)田間管理、水肥管理、環(huán)境調(diào)控等處理措施保持一致。試驗(yàn)于白粉病初發(fā)期(零星葉片發(fā)病)，按各藥劑的稀釋倍數(shù)稀釋后均勻噴霧于玫瑰整個(gè)植株，2020年9月11日第1次噴施，9月26日第2次噴施，噴液量為635 L/hm2。

1.4 調(diào)查指標(biāo)及方法

1.4.1 藥害情況 分別于每次噴藥后10 d對(duì)各處理藥害情況進(jìn)行調(diào)查，主要調(diào)查內(nèi)容包括葉片顏色異常、形狀畸形或有損傷，花朵畸形、損傷等藥害特征。

1.4.2 防效計(jì)算 在第2次用藥后16 d，采用3點(diǎn)取樣法取玫瑰葉片，每小區(qū)50片，每處理共150片葉進(jìn)行病級(jí)分級(jí)，統(tǒng)計(jì)病葉率并計(jì)算病情指數(shù)和防效。白粉病調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0級(jí)：無病斑；1級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積小于5%；3級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積為5.1%～10%；5級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積為10.1%～25%；7級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積為25.1%～50%；9級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積大于50%。

病情指數(shù)=100×∑(該級(jí)病葉數(shù)×病級(jí)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值)

防治效果=[(空白對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/ 空白對(duì)照病情指數(shù)]×100%

1.4.3 產(chǎn)量及品質(zhì) 2020年10月25日第1次采收時(shí)，應(yīng)用5點(diǎn)采樣法對(duì)所有試驗(yàn)玫瑰的葉色、花色進(jìn)行調(diào)查，后期幾次采收因時(shí)間間隔較短，葉色和花色變化不明顯而不予調(diào)查。6次采收完成統(tǒng)計(jì)總產(chǎn)量和各級(jí)花的產(chǎn)量。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照云南省地方標(biāo)準(zhǔn)《鮮切花質(zhì)量等級(jí)》(DB53/T 105—2003)進(jìn)行分級(jí)，主要以葉色、花色、花枝長(zhǎng)度為依據(jù)，其中A級(jí)：花枝高75～80 cm；B級(jí)：花枝高70～75 cm；C級(jí)：花枝高60～65 cm；D級(jí)：花枝高50～55 cm。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2007及 SPSS對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 切花玫瑰白粉病病原菌的鑒定

采集分離獲得切花玫瑰白粉病病原菌，將其命名為RPM。序列提交Gen Bank核酸數(shù)據(jù)庫，獲得的序列編號(hào)為MT093354。經(jīng)過形態(tài)和分子鑒定，確定病原菌株RPM為氈毛叉絲單囊殼菌(Podosphaerapannosa)。該病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1，其與Podosphaerapannosa的同源性為99%。

2.2 不同處理切花玫瑰白粉病的防治效果

從表1看出，處理3對(duì)切花玫瑰白粉病的防治效果最好，防效達(dá)90.00%，顯著高于其他處理，其中，與處理4(CK2，常規(guī)藥劑)相比，防效提高9.1百分點(diǎn)；病情指數(shù)低于其他4個(gè)處理。處理1、處理2的防治效果分別為77.18%和78.35%，顯著低于處理4；病情指數(shù)高于處理4，但差異不顯著。表明，短小芽孢桿菌、短短芽孢桿菌和哈茨木霉菌3種微生物菌劑中，哈茨木霉菌能有效防治切花玫瑰白粉病，其防治效果優(yōu)于常用藥劑25%乙嘧酚磺酸酯。

表1 不同處理切花玫瑰白粉病的防治效果

2.3 不同處理切花玫瑰的產(chǎn)量及品質(zhì)

田間調(diào)查結(jié)果表明，5個(gè)處理的切花玫瑰葉色均為濃綠色，花色均為米白色，不同處理間葉色和花色無明顯差異。從表2看出，處理1、處理2、處理3的鮮切花總產(chǎn)量及AB級(jí)花占比均高于處理4(CK2，藥劑對(duì)照)和處理5(CK1，清水對(duì)照)，且處理3與其他處理相比差異顯著。處理3比CK2和CK1的切花總產(chǎn)量分別提高7.2%和15.0%，AB級(jí)花占比分別提高14.0%和48.0%。表明，短小芽孢桿菌、短短芽孢桿菌和哈茨木霉菌均能提高切花玫瑰產(chǎn)量和質(zhì)量，尤其以哈茨木霉菌的效果最優(yōu)。

表2 不同處理切花玫瑰的小區(qū)產(chǎn)量及A、B級(jí)花占比

3 討論

通過對(duì)切花玫瑰白粉病病原菌進(jìn)行分子和形態(tài)鑒定，確定其為Podosphaerapannosa(P.Pannosa)，序列提交Gen Bank核酸數(shù)據(jù)庫，獲得的序列編號(hào)為MT093354。切花玫瑰白粉病病原菌P.pannosa為薔薇科(Rosaceae)植物專性寄生菌[4,8]，LEUS等[9]在李上采集的2個(gè)白粉病分離物被鑒定為P.Pannosa，但對(duì)玫瑰沒有感染力，CHO等[10]首次報(bào)道P . pannosa引起檸檬桉白粉病。表明，P.pannosa存在多種不同的菌株，具有不同的宿主特異性。開展不同宿主P.pannosa微生物防治菌劑的研究，可以為P.pannosa引起的病害防治提供借鑒。

短小芽孢桿菌和短短芽孢桿菌在防治切花玫瑰白粉病中防效分別為77.18%和78.35%，與常用藥劑25%乙嘧酚磺酸酯相比防效都稍差，但在提高切花玫瑰產(chǎn)量和品質(zhì)方面都優(yōu)于25%乙嘧酚磺酸酯。有研究表明，短小芽孢桿菌具有抗逆促生作用，菌株HR10對(duì)黑松有良好的促生效果；短小芽孢桿菌對(duì)苗木猝倒病病原菌有抑制作用，抑菌率可達(dá)85.58%[11-13]。從短桿菌肽S發(fā)現(xiàn)以來，許多研究者對(duì)短短芽孢桿菌進(jìn)行研究，得到了具有抑制芒果炭疽病、防治蔬菜病原霉菌、抑制食源性致病菌、抑制番茄灰霉菌等作用的菌株[14-18]。由此可知，短小芽孢桿菌、短短芽孢桿菌對(duì)作物真菌病害具有廣泛的抑制作用，如何提高二者在切花玫瑰白粉病防治中的效果還有待進(jìn)一步研究。

木霉屬真菌及其次生代謝產(chǎn)物在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、大量營養(yǎng)元素和寡/微量營養(yǎng)元素的吸收和利用效率、激活植物次生代謝和植物保護(hù)等方面的有益作用，使其在環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在該研究中，哈茨木霉在防治切花玫瑰白粉病與提高切花玫瑰產(chǎn)量和品質(zhì)方面均表現(xiàn)出良好的效果，對(duì)白粉病的防治效果達(dá)90.00%，與清水空白對(duì)照相比，鮮切花總產(chǎn)量提高15.0%，且A、B級(jí)花占較高，達(dá)48.0%。哈茨木霉可通過觸發(fā)葡萄藤中的防御機(jī)制對(duì)葡萄霜霉病起到誘導(dǎo)保護(hù)作用[19]，對(duì)煙草疫霉菌亦有較好的生防作用[20]，對(duì)玫瑰白粉病的防效為67.33%[6]，木霉接種可提高番茄果實(shí)品質(zhì)[21]。哈茨木霉在防治真菌病害和促進(jìn)作物生長(zhǎng)方面具有重要的作用，但值得注意的是，微生物菌劑用于防治作物病害應(yīng)以預(yù)防為主，在發(fā)病前或發(fā)病初期使用，可減少用量、降低成本，提高防治效果，同時(shí)可有效提高產(chǎn)品品質(zhì)。哈茨木霉菌在不同地區(qū)、不同品種切花玫瑰白粉病防治上的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

以常規(guī)農(nóng)藥防治處理(25%乙嘧酚磺酸酯)為比較對(duì)象，開展短小芽孢桿菌、短短芽孢桿菌、哈茨木霉菌3種微生物菌劑對(duì)切花玫瑰白粉病的防治效果研究結(jié)果表明，3種微生物菌劑對(duì)切花玫瑰白粉病的防效為77.18%～90.00%，微生物菌劑處理切花玫瑰的產(chǎn)量及品質(zhì)較25%乙嘧酚磺酸酯處理均有不同程度提升。其中，以2億CFU/g哈茨木霉菌300倍液的防效最高，切花玫瑰產(chǎn)質(zhì)量提升效果最明顯，哈茨木霉菌的防效、切花產(chǎn)量和AB級(jí)花占比較25%乙嘧酚磺酸酯處理分別提高9.1百分點(diǎn)、7.2%和14.0%。因此，切花玫瑰生產(chǎn)中可利用哈茨木霉菌代替常用農(nóng)藥對(duì)白粉病進(jìn)行防治，實(shí)現(xiàn)切花玫瑰的綠色生產(chǎn)，且明顯提高鮮切花產(chǎn)量和品質(zhì)，有效減少農(nóng)藥用量，提升耕地質(zhì)量和提高生態(tài)環(huán)境保護(hù)效益。