湖北省漢族人群MTHFRC677T 基因多態(tài)性分析

代依林，劉璐，丁文成，紀(jì)騰

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1.婦產(chǎn)科；2.藥學(xué)部，武漢 430030)

葉酸是一種水溶性維生素，在DNA合成、修復(fù)及甲基化過程中起著重要的作用，人體不能自行合成，只能通過外界攝入。5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，可催化5，10-亞甲基四氫葉酸成為5-甲基四氫葉酸，為DNA和蛋白質(zhì)提供甲基供體。研究報(bào)道MTHFR基因第677位堿基對(duì)上的丙氨酸替代纈氨酸突變，影響血漿同型半胱氨酸(Hcy)的代謝，導(dǎo)致同型半胱氨酸血癥[1-2]。MTHFR C677T 基因多態(tài)性與多種臨床疾病有關(guān)，包括心血管疾病、癌癥、 妊娠不良結(jié)局及胎兒發(fā)育異常、男性不育等[3-4]。因此，MTHFR C677T篩查對(duì)于降低遺傳缺陷、提高出生人口素質(zhì)以及從遺傳學(xué)角度為國家制定公共衛(wèi)生政策提供數(shù)據(jù)支持具有重要意義。筆者在本研究通過對(duì)湖北省漢族人群中MTHFR C677T基因多態(tài)性分布進(jìn)行特征性研究，了解該省漢族人群的遺傳特點(diǎn)，評(píng)估其葉酸代謝能力，為其制定個(gè)體化的葉酸補(bǔ)充方案提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2016年1月—2018年1月來我院進(jìn)行健康體檢或常規(guī)孕期體檢的湖北省漢族人群(依據(jù)身份證籍貫及民族信息為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行納入)，排除腦梗死、高血壓、糖尿病、冠心病患者及重復(fù)就診對(duì)象(通過就診卡號(hào)以及身份證號(hào)進(jìn)行篩選)。其中納入男1756例，年齡20～72 歲，平均年齡(31.7±6.2)歲；女10 074例，年齡18～60歲，平均年齡(29.6±4.83)歲。無重復(fù)納入的研究對(duì)象。本研究通過本院倫理委員會(huì)審查同意(批準(zhǔn)文號(hào)：TJ-IRB20220659)。

1.2主要儀器及試劑 PCR擴(kuò)增儀(型號(hào)：T100，美國伯樂)、 BaiO?BE-2.0生物芯片識(shí)讀儀(型號(hào)：BSE01011，上海百傲科技股份有限公司)、BaiO?e-Hyb 全自動(dòng)雜交儀(型號(hào)：BSE03011，上海百傲科技股份有限公司)；MTHFR C677T 基因檢測(cè)試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)、血液DNA提取試劑盒(QIAGEN，貨號(hào)：51104)。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1DNA提取 檢查對(duì)象均通過肘靜脈(肘正中靜脈或貴要靜脈)采集靜脈血(無需空腹)2 mL，置于EDTA抗凝管中。按人血液DNA提取試劑盒說明書要求，提取200 μL抗凝血基因組DNA作為后續(xù)擴(kuò)增模板。

1.3.2DNA擴(kuò)增 應(yīng)用MTHFR C677T 基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：MTHFR 22 μL，DNA模板1 μL，反應(yīng)液A 2 μL，共25 μL；反應(yīng)條件：預(yù)處理50 ℃ 5 min，預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 25 s，退火56 ℃ 25 s，延伸72 ℃ 25 s，其中變性、退火、延伸三個(gè)步驟共循環(huán)35次，最后延伸72 ℃ 5 min。

1.3.3基因檢測(cè) 應(yīng)用MTHFR C677T 基因檢測(cè)試劑盒中提供的雜交顯色試劑盒，取DNA擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，加入到雜交緩沖液190 μL。在全自動(dòng)雜交儀上完成雜交，在生物芯片識(shí)讀儀上讀取MTHFR基因芯片結(jié)果，應(yīng)用配套基因芯片圖像分析軟件V2.0分析基因芯片結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)基因頻率在人群中的分布進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 結(jié)果見表1。本研究納入湖北省漢族人群的MTHFR C677T基因型頻率沒有出現(xiàn)波動(dòng)，未出現(xiàn)遺傳漂變，群體處于遺傳平衡狀態(tài)，MTHFR C677T基因多態(tài)性分布符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.851，P>0.05)，提示納入樣本具有區(qū)域群體代表性。

表1 湖北省漢族人群MTHFR C677T基因Hardy-Weinberg遺傳平衡分析

2.2湖北省漢族人群不同性別組MTHFR基因多態(tài)性分布 結(jié)果見表2和表3。結(jié)果顯示，MTHFRC677TT基因型在男性中占比更高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.711，P=0.056)。MTHFRC677位點(diǎn)上等位基因頻率，男性和女性之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.711，P=0.10)。

表2 湖北省漢族人群MTHFR C677T位點(diǎn)基因型頻率分布

表3 湖北省漢族人群MTHFR C677T位點(diǎn)等位基因頻率分布

2.3湖北省漢族人群各年齡組MTHFR基因多態(tài)性分布 結(jié)果見表4。以年齡分組后，各年齡層基因型構(gòu)成存在差異，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.591，P=0.166)。在≤45歲，CT型為優(yōu)勢(shì)基因，在各年齡段分層里無明顯差別，表4顯示，>45歲CC型頻率最高，但>45歲各基因型構(gòu)成與≤45歲比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.140，P=0.343)。表5與表6所示，按性別分組后重新分層，發(fā)現(xiàn)在男性中各年齡段中均是以CT型為優(yōu)勢(shì)基因型，最高可達(dá)53.66%(χ2=10.695，P=0.555)；在女性中發(fā)現(xiàn)，各年齡層基因型構(gòu)成存在差異，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.306，P=0.081)，但≤45歲CT基因型頻率最高，>45歲為CC基因型頻率最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.819，P=0.033)。

表4 湖北省漢族人群各年齡層MTHFR C677T位點(diǎn)基因型頻率分布

表5 湖北省漢族女性各年齡層MTHFR C677T位點(diǎn)基因型頻率分布

2.4湖北省漢族人群與其他省份(或市)漢族人群MTHFR基因型頻率分布比較 參照“1.1”項(xiàng)納排標(biāo)準(zhǔn)，納入云南省2476例、河南省2652例、浙江省1896例、北京市3945例、吉林省833例、廣東省13 336例。湖北省漢族人群MTHFR C677T位點(diǎn)基因型分布與云南省[5]、河南省[6]、浙江省[7]、北京市[8]、吉林省[9]、廣東省[10]等地區(qū)之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中純合突變基因型(TT)頻率高于云南省、浙江省、廣東省，低于河南省、吉林省、北京市(P<0.05)(表7)。湖北省人群的 MTHFR C677T 突變等位基因頻率高于云南省、浙江省、廣東省，低于河南省和吉林省和北京市(P<0.05)，見表8。

表6 湖北省漢族男性各年齡層MTHFR C677T位點(diǎn)基因型頻數(shù)和頻率分布

表7 不同省份(或市)漢族人群MTHFR C677T位點(diǎn)基因型頻率分布

3 討論

葉酸是一種水溶性B族維生素，是細(xì)胞增殖、組織修復(fù)、機(jī)體發(fā)育過程中不可或缺的重要物質(zhì)[11]。葉酸不能在人體內(nèi)自行合成，需從外界攝取。MTHFR是葉酸代謝過程的關(guān)鍵酶，催化5，10-亞甲基四氫葉酸成為5-甲基四氫葉酸，為一系列生命活動(dòng)提供甲基供體。編碼MTHFR的基因位于染色體1p36.3，共有12個(gè)外顯子，mRNA全長(zhǎng)7150 bp，共編碼氨基酸657個(gè)[12]。其中，MTHFR 基因677位點(diǎn)存在多態(tài)性，當(dāng)該位點(diǎn)突變(C677T)時(shí)，引起MTHFR酶活性降低，抑制血漿內(nèi)同型半胱氨酸代謝，導(dǎo)致低葉酸血癥和高同型半胱氨酸血癥，從而引起心血管疾病、腦卒中[13]、婦科疾病[14]、胎兒生長(zhǎng)受限[15]等一系列臨床疾病。

表8 不同省份(或市)漢族人群MTHFR C677T位點(diǎn)等位基因頻率分布

本研究結(jié)果顯示，湖北省人群MTHFRC677位點(diǎn)上基因型頻率以CT最高，CC次之，TT最低；其中不同性別MTHFRC677位點(diǎn)上CC、CT、TT基因型頻率也有差異，TT基因型在男性中占比更高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以年齡分組后可以看出，在45歲以下，CT為優(yōu)勢(shì)基因型，在各年齡段分層里無明顯差別，>45歲雖然CC型頻率最高，但各基因型構(gòu)成頻率與≤45歲比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再按性別分組后重新分層，發(fā)現(xiàn)在男性各年齡段中均是以CT為優(yōu)勢(shì)基因型，最高可達(dá)53.66%；在女性中發(fā)現(xiàn)，各年齡層基因型構(gòu)成存在差異，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.081)，但≤45歲CT基因型頻率最高，>45歲為CC基因型頻率最高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)。不同地區(qū)基因型頻率和等位基因頻率也有差異，湖北省人群純合突變基因型(TT)頻率高于云南省、浙江省、廣東省，低于河南省、吉林省、北京市，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T基因頻率高于云南省、浙江省、廣東省，低于河南省、吉林省和北京市，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該差異和我國葉酸缺乏的趨勢(shì)分布大體一致。以上結(jié)果為以后針對(duì)不同年齡、不同性別的需要補(bǔ)充葉酸的患者制定個(gè)性化葉酸補(bǔ)充方案提供新依據(jù)。

一般人群葉酸補(bǔ)充的有效且安全劑量為 0.4～1.0 mg·d-1[16]，體內(nèi)代謝葉酸同時(shí)受多種因素影響，根據(jù)以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果，補(bǔ)充葉酸時(shí)，需考慮MTHFR C677T基因型的差異，TT基因型漢族人群可平衡膳食改善葉酸營養(yǎng)狀況，在安全劑量?jī)?nèi)適當(dāng)增加補(bǔ)充葉酸劑量，以及延長(zhǎng)補(bǔ)充葉酸的時(shí)間；同時(shí)也需考慮所在地域(生活方式、飲食習(xí)慣等)影響。本研究中列出的北方三省TT基因型頻率以及T基因頻率均高于南方三省，應(yīng)在適合本地區(qū)飲食習(xí)慣的基礎(chǔ)上增加富含葉酸的食物，如綠葉蔬菜、動(dòng)物肝臟、豆制品等。不同的年齡及不同性別的人群也應(yīng)分類補(bǔ)充葉酸，育齡期婦女備孕期間可進(jìn)行葉酸的合理補(bǔ)充以達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的，老年人補(bǔ)充葉酸也可一定程度地降低心血管事件發(fā)生概率。綜上所述，補(bǔ)充葉酸應(yīng)做到個(gè)性化補(bǔ)充，充分發(fā)揮補(bǔ)充葉酸的作用。

湖北省漢族人群MTHFR基因多態(tài)性分布具有明顯的地區(qū)特異性，>50%的人群存在不同程度的葉酸代謝障礙，并且不同年齡、不同性別葉酸代謝水平也表現(xiàn)出一定的差異性，因此一般人群常規(guī)劑量0.4 mg·d-1不能滿足大部分人群的生理需求，所以在補(bǔ)充葉酸時(shí)，應(yīng)充分考慮MTHFR基因多態(tài)性的影響。針對(duì)葉酸代謝障礙的高風(fēng)險(xiǎn)人群，根據(jù)其基因型、性別、年齡、臨床表現(xiàn)，以及日常飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣等特點(diǎn)制定個(gè)性化的葉酸補(bǔ)充方案，從而達(dá)到減少相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、降低遺傳缺陷、提高出生人口素質(zhì)的目的。