多元法分析高能電子束輻照對白芷揮發(fā)性成分的影響

舒曉燕，周 鑫，蔣 維，任 玲，謝曉婷，侯大斌

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621000）

白芷為傘形科植物白芷（(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. H.）或杭白芷（(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var.(Boiss.)Shan et Yuan）的干燥根，主產(chǎn)于四川、浙江、河南、河北等，是食藥兩用材料。其具有豐富的藥用和食用價值，主要成分為香豆素和揮發(fā)油類。白芷揮發(fā)性成分種類、數(shù)量繁多，主要含有十二碳醇、十五烯醇、萜品烯等，它是白芷活性物質(zhì)之一，藥理研究表明其具有抑制黑色素、鎮(zhèn)痛和抗過敏等作用。同時揮發(fā)性成分為白芷提供獨特的香氣成分，使白芷具有香白芷稱譽，在護膚品、香料等方面也具有巨大的開發(fā)和利用潛力。為進一步開發(fā)利用白芷揮發(fā)油，可采用電子鼻（electronic nose，E-nose）與頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對揮發(fā)性成分進行定性識別，并定量分析，2 種技術(shù)已普遍應用于食品、脂質(zhì)微粒自氧化及環(huán)境檢測中，是較為成熟的分析風味物質(zhì)的手段。

高能電子束系高能電子加速器（10 MeV）發(fā)射出的電子束，與傳統(tǒng)Coγ射線輻照一樣具有殺菌滅蟲、保鮮、改性等作用，且處理時間更短、效率更高、輻照均勻，不產(chǎn)生放射性廢物，廣泛應用于食品、藥品、醫(yī)療器械等行業(yè)。目前還未有高能電子束輻照處理白芷，關(guān)于揮發(fā)性成分變化的相關(guān)研究。本實驗利用高能電子束輻照處理白芷樣品，采用電子鼻結(jié)合HSSPME-GC-MS對其香氣及其呈香成分進行分析鑒別，采用偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）揮發(fā)性成分、電子鼻與GC-MS之間的關(guān)聯(lián)性，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析（clustering analysis，CA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）比較樣品輻照前后及不同輻照劑量處理白芷揮發(fā)性成分的異同，探明高能電子束輻照對白芷揮發(fā)性成分的影響規(guī)律，為白芷利用高能電子束輻照應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

白芷購于四川省中興藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地四川省遂寧市。經(jīng)西南科技大學藥用植物研究室侯大斌教授鑒定為傘形科植物白芷（(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. H.）的干燥根。

1.2 儀器與設備

GJ-2高能電子加速器（10 MeV） 四川省眉山市彭州區(qū)潤祥輻照有限公司；PEN3電子鼻 德國Airsense公司；SPME萃取手柄、65 μm PDMS/DVB SPME萃取頭賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Saturn2100 GC-MS聯(lián)用儀 美國瓦里安技術(shù)中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將白芷樣品平整裝入PET/PE復合材料袋，輻照劑量設置為0（對照）、1、3、5、7、10 kGy，雙面輻照。樣品經(jīng)粉碎，過篩，密封保存，備用。

1.3.2 電子鼻檢測

稱取1.0 g白芷粉末裝入15.0 mL頂空瓶中，室溫下插入電子鼻探頭吸取頂端空氣進行測定。測試條件：載氣為高純空氣，進氣流速600.0 mL/min；預采樣時間5.0 s，數(shù)據(jù)采集時間為120.0 s，采樣周期為1.0 s，自動沖洗時間為100.0 s。電子鼻各傳感器信息見表1。

表1 PEN3型便攜式電子鼻傳感器性能描述Table 1 Performance description of PEN3 portable electronic nose sensors

1.3.3 HS-SPME法提取風味物質(zhì)

選用65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭在GC進樣口活化30 min，活化溫度250 ℃。活化后插入裝有1.0 g白芷粉末的頂空瓶中，60 ℃水浴萃取30 min，然后將纖維萃取頭插入GC進樣口解吸3 min。

1.3.4 GC-MS條件

GC條件：初始溫度80 ℃，保留1 min后，以6 ℃/min速率升溫至180 ℃，再以10 ℃/min速率升溫到220 ℃，保留8 min，進樣口溫度250 ℃，SPME不分流，載氣（氦氣）流速1.0 mL/min。

MS條件：電子電離源；電離電壓70 eV；離子源溫度260 ℃；質(zhì)量掃描范圍30～600 u。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 PCA和LDA

取穩(wěn)定后第68～70秒的電子鼻傳感器數(shù)值信息，使用電子鼻系統(tǒng)自帶軟件Winmuster對數(shù)據(jù)進行PCA和LDA。

1.4.2 GS-MS數(shù)據(jù)分析

用標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST98進行匹配對照解析，選用匹配度80%以上結(jié)果；采用峰面積歸一化法計算相對含量。GC-MS采用Excel處理數(shù)據(jù)、Origin 8.5.1繪圖、Simca13.0進行PCA、CA、PLS-DA。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻測定結(jié)果

2.1.1 輻照前后白芷電子鼻特征氣味雷達指紋圖分析

電子鼻是根據(jù)一系列傳感器，結(jié)合多元統(tǒng)計學方法獲取樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的完整信息。提取10 個傳感器的特征值，選取68～70 s其中1 s繪制高能電子束不同劑量輻照處理的白芷電子鼻特征氣味雷達指紋圖，結(jié)果見圖1。

圖1 輻照前后白芷特征氣味雷達指紋圖Fig. 1 Characteristic odor radar fingerprints of Angelicae Dahuricae Radix before and after irradiation

雷達指紋圖反映了對白芷氣味最敏感的電子鼻傳感器，即7號傳感器（表征為硫化物）和9號傳感器（表征為芳香成分），推測白芷氣味中的主要物質(zhì)可能為硫化物和芳香類物質(zhì)。由圖1可知，各輻照組（1～10 kGy）白芷樣品特征氣味高度重合，未區(qū)分出其差異，但與對照組（0 kGy）差異較大。輻照處理后，7號傳感器響應值仍最大，9號傳感器響應值未發(fā)生變化，表明白芷輻照后主要揮發(fā)性成分未發(fā)生改變；但6號傳感器響應值增大，其表征為甲烷成分，即高能電子束輻照會使白芷氣味增加甲烷物質(zhì)。

2.1.2 PCA結(jié)果

PCA是將可能有相關(guān)性的變量以正交變換的方法轉(zhuǎn)為線性不相關(guān)變量，通過降維原始數(shù)據(jù)，找到最大貢獻率的因子，提取原始數(shù)據(jù)中最大的幾個特征向量為PC，并且通過二維圖體現(xiàn)樣品間的差異。

圖2 不同輻照劑量處理后白芷氣味PCA圖Fig. 2 PCA plot of Angelicae Dahuricae Radix odor after irradiation at different doses

由圖2可知，PC1和PC2的貢獻率分別為89.74%、8.54%，總貢獻率達98.28%，表明可以較好地反映輻照前后白芷揮發(fā)性氣味全部特征信息。各樣品界線清晰，不同處理間的揮發(fā)性氣體存在差異。0～3 kGy處理組在PC1與PC2距離較短，表明這3 個樣品相似度較高；5～10 kGy處理組在PC2及PC1距離較短，此3 個樣品相似度較高；3 kGy與5、10 kGy處理組距離較近，因此，需結(jié)合LDA進一步探究不同樣品揮發(fā)性物質(zhì)的區(qū)別。

2.1.3 LDA結(jié)果

圖3 不同輻照劑量處理后白芷氣味的LDA圖Fig. 3 LDA plot of Angelicae Dahuricae Radix odor after irradiation at different doses

LDA是模式識別中的一種經(jīng)典算法，通過降維數(shù)據(jù)，凸顯類間的差異，減小類內(nèi)的差異，更好地分析樣品間的差異性。如圖3所示，PC1貢獻率為52.87%，PC2貢獻率為36.18%，總貢獻率為89.05%，能很好區(qū)分不同樣品。6 個處理樣品都有各自的香氣區(qū)域，所有的樣品根據(jù)PC1即橫坐標跨度的不同可以完全分開，即不同輻照劑量處理樣品香味物質(zhì)可以區(qū)分開。與PCA相比，LDA的區(qū)分效果更好。結(jié)合圖2、3可以看出，0、1、3 kGy劑量輻照處理后的樣品氣味區(qū)域較為集中，3、5、7、10 kGy輻照處理后的樣品氣味區(qū)域較為集中，說明風味物質(zhì)相似；0～3 kGy和5～10 kGy樣品氣味區(qū)域在PCA縱坐標和LDA橫坐標上存在跨度，推測高于3 kGy劑量輻照對白芷氣味有較大影響。綜合可知，電子鼻能夠區(qū)分經(jīng)高能電子束不同劑量輻照處理的白芷樣品，將6 個實驗組分為0～3 kGy和5～10 kGy兩類，即低于5 kGy的輻照處理對白芷氣味無明顯影響。

2.2 白芷的GC-MS分析

2.2.1 主要香氣成分及相對含量

表2 白芷中揮發(fā)性成分的種類及相對含量Table 2 Types and relative contents of volatile components in Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

為進一步分析高能電子束輻照處理對白芷揮發(fā)性成分產(chǎn)生的影響，利用HS-SPEM-GC-MS聯(lián)用技術(shù)，采用峰面積歸一化法計算相對含量。由表2可知，對照組（0 kGy）的揮發(fā)性成分17 種，其中醛類3 種、醇類2 種、酯類5 種、烴類6 種、其他2 種。由各類成分占比可知，酯、烴類相對含量較高，占45.64%，是白芷主要風味物質(zhì)，這與Zhao Aihong、李偉等對白芷揮發(fā)油的研究結(jié)果相似。烴是碳氫化合物的統(tǒng)稱，可以產(chǎn)生原生的、濃郁的香氣為白芷提供了豐富的香味。其次，醛、醇類成分也占有較大比例，這類化合物一般是脂質(zhì)的降解產(chǎn)物，具有獨特的香氣。

經(jīng)高能電子束1～10 kGy劑量輻照后，白芷的揮發(fā)性成分分別為54、64、59、53、58 種，物質(zhì)種類明顯增多；烴類成分比例仍最大，分別為21.99%、38.45%、23.24%、23.45%、33.86%；酯類成分相對含量下降；隨著輻照劑量增大，醛類物質(zhì)相對含量增加；產(chǎn)生了新物質(zhì)——酮類。研究表明酯類物質(zhì)可轉(zhuǎn)化為醛、酮類，此類物質(zhì)可能引起“輻照味”，其含量越高，即輻照異味愈濃烈，高劑量輻照組與低劑量組樣品氣味有明顯差異。此分析結(jié)果與電子鼻檢測結(jié)果一致，表明“輻照味”的來源極大可能為醛、酮類物質(zhì)，兩者間的具體聯(lián)系還需進一步研究。不同輻照處理樣品中揮發(fā)性物質(zhì)名稱及相對含量見表3。

表3 不同輻照劑量處理下白芷的揮發(fā)性物質(zhì)分析結(jié)果Table 3 Relative contents of volatile substances in Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

由表3可知，輻照前白芷主要成分為2-乙基己基酯乙酸（5.16%）、四甲基吡嗪（6.12%）、正十四碳烷（7.22%）、1-乙烯基-1-甲基-2,4-雙(1-甲基乙烯基)-[1-(1,2,4)]-環(huán)己烷（7.16%）、丁香油烴（7.05%）、正十三烷（6.17%）等烷烴類物質(zhì)，與Chen Qinhua等對白芷揮發(fā)性物質(zhì)的研究結(jié)果一致。樣品經(jīng)高能電子束不同劑量輻照后，2,3-丁二醇、辛醛、十二醛、壬醛、四甲基吡嗪仍能檢出，其中2,3-丁二醇相對含量下降、十二醛相對含量上升；其他13 種成分中，(1)-2,6,6-三甲基雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯在3、5 kGy輻照組中未檢出，在1、7、10 kGy輻照組中檢出，但相對含量較小，可能是高能電子束輻照未完全輻解此物質(zhì)；其余12 種酯、烴類物質(zhì)在輻照組中未檢出，推測高能電子束對酯、烴類物質(zhì)敏感，使其完全輻解。

輻照后白芷揮發(fā)性成分比輻照前更為豐富，可能是白芷中的一些物質(zhì)經(jīng)高能電子束輻照后發(fā)生裂變反應，產(chǎn)生了新的物質(zhì)。1 kGy輻照組中主要物質(zhì)為石竹烯（9.11%），3 kGy輻照組主要為-欖香烯（13.92%），5 kGy為四甲基吡嗪（9.08%），7 kGy為十二醛（11.99%）；10 kGy為十二醇（15.14%）。輻照后樣品中增加了烴類等香氣成分，可能是由于芳香族氨基酸較其他氨基酸對輻照更為敏感，易發(fā)生脫氨基、氧化和脫羧反應。

輻照組產(chǎn)生了酮類物質(zhì)，此類化合物多由不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸降解或微生物氧化產(chǎn)生。由此可推斷其來源可能是2-乙基己基酯乙酸、丁基2-乙基己基酯碳酸、1-乙烯基-1-甲基-2,4-雙(1-甲基乙烯基)-[1-(1,2,4)]-環(huán)己烷、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇三異丁酸酯等酯烴類物質(zhì)，化學結(jié)構(gòu)中的C—O、O—H等化學鍵經(jīng)輻照后斷裂，形成C＝O雙鍵，從而生成酮類化合物。

2.2.2 揮發(fā)性物質(zhì)PCA結(jié)果

根據(jù)因子的特征值、累計貢獻率及碎石圖拐點的變化趨勢等因素確定PC，且根據(jù)特征值大于1分析PC載荷矩陣與特征向量。如表4所示，2 個PC即可完全反映樣品的主要特征信息。

表4 PCA解釋總差異Table 4 Total variance explained

表5 PC載荷矩陣與特征向量Table 5 Principal component loading matrix and eigenvectors

根據(jù)PC與提取的特征向量之間的關(guān)系，可以得到2 個PC與原變量之間的線性關(guān)系，由表5可得回歸方程：

以PC1、PC2的方差貢獻率為權(quán)重系數(shù)，引入綜合評價函數(shù)建立白芷風味物質(zhì)識別評價模型，得到PC=0.513 52 PC1+0.259 81 PC2。利用權(quán)重系數(shù)將高能電子束不同劑量輻照組進行排名分析，計算結(jié)果如表6所示。

表6 白芷綜合評分得分及分類Table 6 Comprehensive scores and classification of Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

由表6可知，0、1、3 kGy輻照劑量組樣品綜合得分均大于0 分，5、7、10 kGy輻照劑量組樣品綜合得分均小于0 分，表明0～3 kGy劑量輻照組白芷樣品的揮發(fā)性成分較為接近；5～10 kGy劑量輻照組樣品揮發(fā)性成分較為接近，與電子鼻分析結(jié)果一致。可以推測高能電子束輻照劑量高于3 kGy時，白芷的揮發(fā)性成分可能會發(fā)生明顯變化。

2.2.3 GC-MS的CA結(jié)果

CA是使用平均聯(lián)接（組間）的譜系圖、重新標度的距離聚類組合，將樣品分成多個類的分析方法，分類更全面具體。以6 類揮發(fā)性成分為變量，對高能電子束不同劑量輻照的白芷樣品揮發(fā)性成分進行CA，結(jié)果見圖4。

圖4 不同劑量輻照白芷的揮發(fā)性成分CA圖Fig. 4 Cluster analysis dendrogram of Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

由圖4可知，當橫坐標距離為10 時，6 個實驗組可以分為2 個類群，分別是0～7 kGy劑量（5 個實驗組）輻照組歸為1 個類群，10 kGy輻照組單獨歸為1 個類群。當類間距為5 時，5 個實驗組被分為3 類，7 kGy輻照組單獨為1 個類群，5 kGy輻照組單獨為1 個類群，0～3 kGy此3 個實驗組為1 個類群，這與PCA結(jié)果一致。

CA可根據(jù)刻度的不同獲得多種分類結(jié)果，而PCA根據(jù)PC得分僅獲得一種分類結(jié)果，將PCA、CA及電子鼻定性分析相結(jié)合，可以較全面地分析高能電子束輻照處理對白芷香氣成分的影響。

2.3 電子鼻與GC-MS的PLS-DA結(jié)果

圖5 揮發(fā)性物質(zhì)電子鼻傳感器PLS-DA（A）和置換檢驗圖（B）Fig. 5 PLS-DA plot of volatile substances using E-nose sensors (A) and permutation test (B)

PLS-DA是對不同處理樣品的特性分別進行訓練，產(chǎn)生訓練集并檢驗訓練集的可信度的多變量統(tǒng)計分析方法。選取電子鼻10 個傳感器與GC-MS檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)進行PLS-DA，結(jié)果見圖5、6。

驗證結(jié)果中的和與縱軸的截距分別為0.258和-0.326，鑒別模型最右端的原始值大于左邊任何一個變量的值，說明所構(gòu)建的PLS-DA有較好的穩(wěn)定性和可靠性。由圖5可知，W3S、W3C、W6S、W2C、W5S傳感器與酯烴類物質(zhì)相關(guān)性較高，此類傳感器能較好的識別酯烴類物質(zhì)，但酯烴類閾值較高，在傳感器中響應值應較小，雷達圖結(jié)果符合PLS-DA結(jié)果。表明電子鼻對白芷揮發(fā)性成分區(qū)分識別度較好。

3 結(jié) 論

基于電子鼻和GC-MS技術(shù)，研究高能電子束輻照處理對白芷樣品中揮發(fā)性成分的影響，并采用PCA、LDA、CA和PLS-DA統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。電子鼻能較好地區(qū)分不同劑量輻照處理后的白芷氣味，GC-MS技術(shù)可在電子鼻的基礎上進一步分析白芷揮發(fā)性成分種類、相對含量的變化，其分析結(jié)果一致。白芷中主要揮發(fā)性成分為酯烴類化合物，高能電子束輻照會使白芷產(chǎn)生新的化合物——酮類物質(zhì)，但不高于3 kGy劑量輻照對白芷揮發(fā)性成分無明顯影響。本實驗為高能電子束輻照對白芷揮發(fā)性成分的影響提供了理論參考，通過研究揮發(fā)性成分的變化可知不高于3 kGy劑量為輻照適宜劑量，但對其具體成分的影響課題組還在進一步研究中。