基于氣相色譜-離子遷移譜分析海鴨蛋腌制過程中蛋清揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化

李明潔，凌 逍，李祥雨，夏 寧,*，滕建文，韋保耀，黃 麗，李偉麗

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西朗盛食品科技有限公司，廣西 南寧 530000）

海鴨蛋是廣西沿海地區(qū)極具特色的地方食品資源，產(chǎn)自于以海邊灘涂魚、蝦、蟹、貝類、藻類等為主食的海鴨，由于具有豐富的營養(yǎng)及特殊的風(fēng)味，其鮮蛋產(chǎn)量及其加工產(chǎn)業(yè)規(guī)模占據(jù)全國海鴨蛋市場的半壁江山。目前廣西海鴨蛋的主要初加工形式是進(jìn)行紅泥鹽腌，該法腌制后的鴨蛋品質(zhì)優(yōu)良，主要體現(xiàn)出蛋黃口感松沙、色澤鮮艷、出油較多且風(fēng)味咸香濃郁的蛋黃有利于產(chǎn)品的深加工等特點。海鴨蛋在腌制過程中通常以蛋黃的品質(zhì)和風(fēng)味判斷腌制結(jié)束的終點，而忽略蛋清在腌制過程中品質(zhì)及風(fēng)味的變化，這也是咸蛋清腥味較重且含鹽量高的主要原因。

目前國內(nèi)外對鴨蛋腌制過程中的研究主要集中在腌制過程中理化性質(zhì)的變化，包括蛋黃硬化率、出油率、水分遷移規(guī)律以及微觀結(jié)構(gòu)等影響，蛋清的含鹽量、黏度、水分含量以及pH值等。海鴨蛋在腌制前后風(fēng)味發(fā)生巨大變化，目前對鴨蛋在腌制過程中的風(fēng)味研究主要集中在蛋黃風(fēng)味的變化，包括咸蛋黃的特征風(fēng)味、咸蛋黃腥味的來源、咸蛋黃熟制前后風(fēng)味的變化規(guī)律等，但是針對咸蛋清腌制過程中風(fēng)味物質(zhì)變化的研究相對較少，難以全面對咸鴨蛋腌制過程中風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行分析。

氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一種將GC與IMS聯(lián)合起來的風(fēng)味分析技術(shù)，由于其預(yù)處理簡便、靈敏度高、可以常壓工作等優(yōu)勢，能夠?qū)Φ乩順?biāo)志性產(chǎn)品的鑒別、分級、摻假鑒別、貨架期判斷及產(chǎn)品加工工藝的優(yōu)化等進(jìn)行快速分析。在對蛋品的風(fēng)味物質(zhì)研究上，可以利用其對新鮮雞蛋的貯藏時間進(jìn)行分類評估，建立模型對其貯藏時間進(jìn)行擬合，區(qū)分出雞蛋的貨架期；也可以對蛋黃和蛋清中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測，判斷蛋清中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為酯類化合物等。在利用GC-IMS對揮發(fā)性風(fēng)味進(jìn)行分析時常佐以構(gòu)建模型及聚類分析等多元統(tǒng)計學(xué)方法，如利用正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）對海鱸魚肉的蒸制過程進(jìn)行區(qū)分并確定海鱸魚肉不同過程的特征風(fēng)味物質(zhì)，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和熱圖分析對不同加工方式的黑棗進(jìn)行區(qū)分，利用PCA對豬肉的不同部位進(jìn)行區(qū)分等。

因此，本實驗利用感官評價和GC-IMS技術(shù)對海鴨蛋在紅泥腌制過程中的咸蛋清的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行鑒別、定性檢測及相對定量的研究，結(jié)合PCA和OPLSDA等多元統(tǒng)計分析方法，找出不同腌制階段的特征風(fēng)味物質(zhì)及異味物質(zhì)的來源，為腌制過程中產(chǎn)品品質(zhì)變化的控制和預(yù)警提供相關(guān)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅泥腌制海鴨蛋（采用紅泥與飽和食鹽水質(zhì)量比為1∶1的泥鹽水，腌制溫度為25～30 ℃），購于廣西北海市蛋品廠。

2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮（均為色譜純） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；FlavourSpecGC-IMS儀 德國多特蒙德分析傳感器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

每5 d取紅泥腌制的海鴨蛋10 枚，分離出咸蛋清，混勻。取1 mL咸蛋清置于5 mL離心管中，常溫孵化30 min后進(jìn)行感官評價。準(zhǔn)確稱取3.0 g置于20 mL頂空瓶中進(jìn)行GC-IMS的測定。每個樣品平行測定3 次。

1.3.2 感官評價

邀請15 名有豐富感官評定經(jīng)驗的人員組成感官評估小組，年齡在23～26 歲之間，其中女性9 名，男性6 名。感官評價采用10 分制原則，評定項目包括咸蛋清的顏色以及腥味，具體感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 咸蛋清腥味感官評定表Table 1 Criteria for sensory evaluation of color and off-flavor of salted duck egg white

1.3.3 GC-IMS測定條件

自動進(jìn)樣條件：孵育溫度60 ℃；孵育時間20 min；孵化器轉(zhuǎn)速500 r/min；采用頂空不分流模式自動進(jìn)樣；進(jìn)樣針溫度85 ℃；進(jìn)樣量500 μL。

GC條件：采用弱極性毛細(xì)管色譜柱FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm）；柱溫45 ℃；載氣為氮氣（≥99.999%）。載氣流量梯度，初始流速2 mL/min，持續(xù)5 min，然后在20 min內(nèi)增加到70 mL/min，停留5 min，總GC運(yùn)行時間為30 min。

IMS條件：漂移管溫度45 ℃；漂移氣為氮氣（≥99.999%），漂移氣流速150 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

樣品中的揮發(fā)性成分采用Library Search軟件進(jìn)行定性處理，LAV軟件對物質(zhì)進(jìn)行采集，通過Reporter插件導(dǎo)出GC-IMS二維譜圖，用Gallery Plot插件對比指紋圖譜的差異。采用Origin 2021軟件對樣品進(jìn)行PCA、SIMAC14.1軟件對樣品進(jìn)行OPLS-DA，SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及顯著性分析，＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評價結(jié)果

從圖1可以看出，腌制前20 d咸蛋清的顏色無顯著性差異且分值低于3 分，屬于無色透明狀態(tài)，25 d后，咸蛋清顏色由無色透明轉(zhuǎn)向渾濁較黃且均存在顯著性差異。與此同時咸蛋清的風(fēng)味也發(fā)生巨大變化，腌制前20 d咸蛋清腥味差異不大，25 d后咸蛋清腥味較為濃郁，說明咸蛋清在腌制25 d時品質(zhì)發(fā)生巨大變化，顏色明顯加深且腥味明顯濃郁。顏色的轉(zhuǎn)變可能是蛋黃腌制成熟后有出油現(xiàn)象，油脂滲透到咸蛋清中，導(dǎo)致咸蛋清的顏色和風(fēng)味都發(fā)生巨大轉(zhuǎn)變。

圖1 海鴨蛋腌制過程中顏色和腥味的感官評價Fig. 1 Sensory evaluation scores of color and off-flavor of sea duck eggs during salting

2.2 海鴨蛋腌制過程中咸蛋清揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-IMS圖譜

在GC-IMS中，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別通過氣相色譜柱和離子遷移管，發(fā)生雙重分離，其中氣相保留時間、離子遷移時間和保留指數(shù)用于對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。按照取樣時間點，將腌制過程分為8 個階段，每個階段橫坐標(biāo)表示離子相對遷移時間，在1.1～1.7之間，縱坐標(biāo)表示風(fēng)味物質(zhì)在色譜中的氣相保留時間，范圍主要在100～800 s之間。譜圖上每個斑點表示一種化合物，顏色越紅，說明該化合物信號越強(qiáng)，對應(yīng)濃度越大。由圖2可知，在0～20 d圖譜中斑點數(shù)量較少且顏色較淺，此時海鴨蛋清中風(fēng)味物質(zhì)較少且含量較低，當(dāng)腌制到25 d時風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量明顯增多，對應(yīng)信號強(qiáng)度也在增強(qiáng)，直至腌制結(jié)束揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds，VOCs）數(shù)量和信號強(qiáng)度都保持在一個較高水平。在25 d時液態(tài)的蛋黃已經(jīng)凝固，蛋清黏度下降并體現(xiàn)出更濃郁的不良風(fēng)味，此時感官判斷鴨蛋基本達(dá)到腌制成熟的初期，但是在以蛋黃品質(zhì)為腌制結(jié)束的標(biāo)準(zhǔn)中，為了追求咸蛋黃的飽滿度，會適當(dāng)延長腌制時間，過長的腌制時間會增加產(chǎn)品的劣變率，利用GC-IMS可以將產(chǎn)品的劣變程度與具體的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)部分聯(lián)系起來，為識別產(chǎn)品的劣變程度提供可以參考的理論依據(jù)。

圖2 海鴨蛋在腌制過程中咸蛋清VOCs的GC-IMS圖譜Fig. 2 GC-IMS spectra of VOCs of sea duck egg white during salting

2.3 海鴨蛋腌制過程中咸蛋清VOCs的鑒定分析

通過GC-IMS鑒定出腌制過程中咸蛋清的VOCs種類如表2所示，共發(fā)現(xiàn)可以定性的化合物43 種，主要為醛類11 種、酮類10種、醇類9 種、酯類6 種、酸類5 種、雜環(huán)化合物1 種以及烯烴化合物1 種。這些VOCs的碳鏈主要集中在C～C之間，且由于濃度不同會產(chǎn)生單體和二聚體。使用面積歸一化法對結(jié)果進(jìn)行相對定量分析，酮類和酯類是咸蛋清腌制過程中主要的風(fēng)味化合物，其次為酸類、醛類和醇類。

新鮮的海鴨蛋中酮類化合物相對含量最高，達(dá)到71.84%，在腌制過程中，其相對含量逐漸降低，酮類化合物的來源多種多樣，但它們最常見的形成方式是脂質(zhì)的氧化和美拉德反應(yīng)；酯類化合物與此相反，在未腌制狀態(tài)下為14.69%，5 d后相對含量驟升為65.54%，并在后續(xù)腌制過程中保持在一個較高水平，直到腌制25 d后，其他揮發(fā)性化合物含量都持續(xù)增加后，其相對含量仍然保持在35.49%，顯然對咸蛋清的風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)；酸類化合物的相對含量在20～25 d之間由1.95%驟升至13.84%，表明酸類化合物在咸鴨蛋腌制成熟初期變化明顯，也許是區(qū)分咸鴨蛋成熟的重要標(biāo)志；醛類化合物在腌制過程的相對含量也由4.99%穩(wěn)步上升為10.59%。

由表2可知，酮類化合物中2-丁酮含量最高，單體和二聚體總相對含量高達(dá)52.21%，其具有醚香、果香和清香。隨著腌制時間的延長，2-丁酮含量持續(xù)降低，與此同時具有奶油香和乳香的3-羥基-2-丁酮含量持續(xù)升高，到腌制成熟時單體和多聚體占比之和達(dá)到15.42%。3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二酮通常存在于發(fā)酵食品和飲料（如葡萄酒）中，可通過微生物發(fā)酵作用產(chǎn)生，它們也可以通過美拉德反應(yīng)形成。

酯類化合物的相對含量在腌制過程中一直處于一個較高的水平，直到腌制25 d以后，其他種類化合物含量都持續(xù)上升到較高水平，酯類相對含量占比降低到35.49%，而在酯類化合物中乙酸乙酯占比最高，在腌制5 d后相對含量高達(dá)62.40%，直到腌制完全成熟后，相對含量降低為32.79%，在衛(wèi)慧萍等對咸蛋黃風(fēng)味物質(zhì)的檢測中，也發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯的含量占總揮發(fā)性物質(zhì)的一半左右，這說明乙酸乙酯是咸鴨蛋中重要的揮發(fā)性成分，其可能帶來咸鴨蛋特有的果香和酒香。

酸類化合物中相對含量較高的異丁酸和丙酸在腌制的前20 d沒有顯著變化，但到了腌制的后期，即腌制成熟后異丁酸的相對含量達(dá)到6.24%，丙酸相對含量高達(dá)4.64%。異丁酸在大部分食品中都體現(xiàn)出對食品風(fēng)味的不良影響，如酸敗味，黃油味等異味；而丙酸具有辛辣、豆子、酸敗味，這些物質(zhì)或許是咸蛋清中腥臭味的重要來源，其在腌制后期的出現(xiàn)或許對鴨蛋品質(zhì)劣變的預(yù)警具有重要意義。

醛類化合物的相對含量在腌制過程中逐漸升高，特別是正丁醛和異戊醛。正丁醛的相對含量在腌制成熟后高達(dá)3.79%，通常情況下醛類物質(zhì)在低濃度下具有草香氣息，而在高濃度下帶有酸敗味、辛辣味。其中己醛是不飽和脂肪酸過氧化物降解的主要產(chǎn)物，具有魚腥味或杏仁味的苯甲醛來自亞油酸的氧化降解，這些化合物或許來源于咸蛋黃中油脂的氧化降解。

咸蛋清中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)除了可能來源于咸蛋黃中滲透出的油脂，還可能來源于游離氨基酸的氧化降解。游離氨基酸除了有助于味覺的呈現(xiàn)外，還可以通過Strecker降解有助于揮發(fā)性成分的生成，氨基酸與-二羰基化合物反應(yīng)，失去一分子CO而降解成為少一個碳原子的醛類及氨基酮，形成各種不同的特殊醛類（Strecker醛）。如3-甲基-1-丁醇主要由亮氨酸以及異亮氨酸降解得到，己醛和2-甲基丁醛可以由異亮氨酸氧化降解得到，噻吩等含硫化合物主要由半胱氨酸降解得到以及蛋氨酸可以氧化降解為吡嗪等。

如圖3所示，腌制時間0～5 d期間，乙酸乙酯和糠醛相對含量驟升，3-戊酮相對含量驟降，異戊醛開始出現(xiàn)；腌制時間達(dá)到10 d時，羥基丙酮相對含量顯著升高；腌制時間達(dá)到15 d時，異丁酸乙酯顯著升高，正己醛、3-甲基-3-丁烯-1-醇相對含量達(dá)到最大；丁酸在腌制時間達(dá)到20 d時相對含量最高，35 d后反而降低；當(dāng)腌制時間到達(dá)25 d時，同時出現(xiàn)了很多揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，如3-羥基-2-丁酮、2-甲基戊醛、1-辛烯-3-醇、-蒎烯、2-甲基-1-丁醇，有一部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量驟升，如四氫呋喃、2-己酮、正丁醛、正丁醇、丙酸，然而醋酸異丙酯在腌制25 d后相對含量反而下降；當(dāng)腌制時間達(dá)到30 d時，很多化合物含量達(dá)到峰值，如2-甲基戊醛、1-辛烯-3-醇、-蒎烯、正丁醛、正丁醇、丙酸、乙酸丁酯、1-戊烯-3-酮；正丙醇在腌制時間達(dá)到35 d時出現(xiàn)。

表2 海鴨蛋在腌制過程中揮發(fā)性物質(zhì)分析Table 2 Analysis of volatile components in sea duck egg white during salting

續(xù)表2

圖3 不同腌制時間下咸鴨蛋清VOCs的指紋圖譜Fig. 3 Gallery plot of VOCs in sea duck egg white during salting

在腌制過程中，咸蛋清的VOCs發(fā)生巨大變化，不同腌制時間標(biāo)志性揮發(fā)化合物也有所不同，根據(jù)這些化合物的差異，可以利用GC-IMS區(qū)分出不同的腌制階段，在腌制過程中風(fēng)味物質(zhì)的存在與轉(zhuǎn)化也為進(jìn)一步探究咸鴨蛋的腌制機(jī)理提供可參考依據(jù)。

2.4 運(yùn)用多元統(tǒng)計學(xué)分析咸蛋清腌制過程中揮發(fā)性標(biāo)志化合物

2.4.1 蛋清腌制過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的PCA

利用指紋圖譜很難直觀的通過腌制過程中咸蛋清的揮發(fā)性成分對腌制過程進(jìn)行分類，因此采用PCA將具有相似揮發(fā)性成分的組別聚集在一起，同時區(qū)分開揮發(fā)性成分差異大的組別。在化學(xué)計量學(xué)研究中，這種無監(jiān)督的方法是建立模型分析數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)，因為它只基于樣本之間的差異，不需要任何監(jiān)督信息驅(qū)動聚類，對大量、多維的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，可用于分析樣本的歸類趨勢和異常。

如圖4所示，PC1解釋了56.3%的方差，PC2解釋了14.1%的方差，即這2 個因子可解釋原變量70%以上的信息，這2 個PC對分析結(jié)果具有一定的代表性。在PC1上0、5、10、15、20 d與25、30、35 d之間的區(qū)分度很大，同時在PC2上25、35 d與30 d之間的區(qū)分度略大，這與前面的分析結(jié)果吻合。腌制25 d后出現(xiàn)很多VOCs，同時化合物的含量也劇增，所以25 d前后風(fēng)味差異很大；在25～35 d間，很多化合物信號強(qiáng)度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，并在30 d時達(dá)到峰值，所以25 d和35 d的信號強(qiáng)度較為接近，這也是它們與30 d在PC2上有所區(qū)分的重要原因。

圖4 腌制過程中咸蛋清樣品PCA結(jié)果Fig. 4 Principal component analysis plot for sea duck egg white during salting

2.4.2 蛋清腌制過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的OPLS-DA

區(qū)分不同組別間的特征化合物需要進(jìn)行OPLS-DA模型的分析，OPLS方法則能夠移除變量中與分類變量不相關(guān)的變量，使有差異的變量集中在PC1中，模型變得簡單和易于解釋，通常OPLS-DA是將組別進(jìn)行兩兩比較，觀察不同組別之間的差異，并采用變量重要性投影（variable importance in project，VIP）值找出區(qū)分組別的標(biāo)志性物質(zhì)（通常認(rèn)為是VIP值大于1的物質(zhì)）。

圖5 腌制過程中咸蛋清樣品的OPLS-DA模型Fig. 5 OPLS-DA models for sea duck egg white during salting

表3 8 組OPLS-DA模型的得分值Table 3 Scores of OPLS-DA models for eight sea duck egg white samples

通過OPLS-DA模型確定的標(biāo)志性化合物包括乙酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、正丙醇、異丁酸、醋酸異丙酯、2,3-丁二酮、3-甲基-3-丁烯-1-醇、丙酸、2-甲基丁醛、乙酸丙酯、正丁醛、2-丁酮、異丙醇、異戊醛、異丁酸乙酯、四氫呋喃、2-戊酮、正丁醇、異戊醇與反式-2-戊烯醛。

2.4.3 熱圖和聚類分析

為了進(jìn)一步可視化標(biāo)志性化合物對分類的貢獻(xiàn)作用，利用根據(jù)OPLS-DA模型獲得的特征化合物峰體積進(jìn)行聚類熱圖分析，結(jié)果見圖6。根據(jù)咸蛋清腌制過程中篩選出的20 種特征揮發(fā)性標(biāo)志物（VIP＞1），可以將咸蛋的腌制過程分為3 個時期，分別為腌制前（0 d）、腌制中期（5、10、15、20 d）以及腌制后期（25、30、35 d）。在腌制前中期，醋酸異丙酯、2-丁酮表達(dá)為正相關(guān)，2-甲基丁醛在腌制中期表現(xiàn)正相關(guān)，其他大多數(shù)標(biāo)志性化合物都在腌制后期表達(dá)為正相關(guān)。在腌制到達(dá)35 d時，正丙醇和四氫呋喃相關(guān)性最高，這2 種化合物或可對產(chǎn)品的劣變起到預(yù)警作用。

圖6 腌制過程中咸蛋清特征風(fēng)味物質(zhì)的熱圖和聚類分析Fig. 6 Heatmap obtained from cluster analysis of characteristic flavor substances in sea duck egg white during salting

3 結(jié) 論

以紅泥腌制的海鴨蛋為原料，通過咸蛋清腌制過程中顏色和風(fēng)味的感官評定分析以及GC-IMS指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)咸蛋清在腌制到25 d時揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)驟增，并在30 d時數(shù)量和含量都達(dá)到峰值。進(jìn)一步利用PCA和OPLSDA模型將咸蛋清腌制過程中共出現(xiàn)的43 種化合物篩選出20 種特征揮發(fā)性化合物，也證明了這些物質(zhì)在咸蛋清的不同腌制時期確實具有重要代表性。其中異丁酸和丙酸體現(xiàn)不良風(fēng)味，正丁醛在含量較高時體現(xiàn)酸敗味，這幾種物質(zhì)可能是咸蛋清中腥臭味的來源，這些VOCs的前體物質(zhì)可能是脂肪酸和游離氨基酸，在腌制過程中通過氧化降解和美拉德反應(yīng)進(jìn)行積累而形成咸鴨蛋獨特的風(fēng)味。咸蛋清在腌制過程中的變化緩慢、細(xì)微，利用GCIMS可以有效區(qū)分咸蛋清的腌制階段，并根據(jù)其中的特征物質(zhì)對產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行判斷，為預(yù)警產(chǎn)品的劣變提供一定的參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)。