不同等級(jí)濃香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的比較分析

向港興，陳瑩琪，沈 毅，王 西，張亞東，羅惠波,3，黃 丹,3,*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.四川郎酒股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000）

大曲作為中國(guó)白酒釀造過程中物系、酶系及其菌系的重要載體，為白酒發(fā)酵過程提供了豐富的微生物類群、功能酶及其風(fēng)味物質(zhì)，保證了糖化和發(fā)酵作用同時(shí)進(jìn)行。而酒曲的質(zhì)量是影響白酒風(fēng)味品質(zhì)的重要因素，目前行業(yè)內(nèi)對(duì)大曲的質(zhì)量評(píng)價(jià)還是多依賴于傳統(tǒng)感官指標(biāo)和一些理化指標(biāo)，且主要依據(jù)感官指標(biāo)；大曲的感官評(píng)價(jià)包括外觀、斷面和香味，理化指標(biāo)則有發(fā)酵力、糖化力、液化力、水分、酸度、淀粉含量等，從而將大曲分為多個(gè)等級(jí)。

近年來(lái)，學(xué)者針對(duì)大曲的質(zhì)量指標(biāo)也進(jìn)行了相關(guān)研究，如炊偉強(qiáng)等對(duì)瀘州老窖大曲感官特征與微生物、理化指標(biāo)和生化性能進(jìn)行了關(guān)聯(lián)研究，研究表明優(yōu)級(jí)大曲的液化酶、糖化酶、蛋白酶活力以及水分、酸度均高于普級(jí)大曲；且優(yōu)級(jí)大曲的細(xì)菌、芽孢桿菌、霉菌、酵母菌和各生化性能也高于普級(jí)大曲，但是淀粉含量則低于普級(jí)大曲。明紅梅等對(duì)大曲的傳統(tǒng)感官評(píng)價(jià)指標(biāo)以及生理生化（糖化力、液化力、發(fā)酵力、酯化力、酸度、淀粉、水分）評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)感官質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果和理化指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果均有一定差異。閆宗科等對(duì)鳳型大曲的感官評(píng)定與理化指標(biāo)及培養(yǎng)工藝進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大曲的感官質(zhì)量與理化指標(biāo)之間有一定相關(guān)性。目前，微生物對(duì)大曲質(zhì)量影響的研究還較少，沒有較為深入地研究微生物與大曲質(zhì)量間的關(guān)系。本研究對(duì)生產(chǎn)上常用的優(yōu)級(jí)曲和一級(jí)曲兩種大曲進(jìn)行分析，利用高通量測(cè)序技術(shù)比較兩種等級(jí)大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)差異，并對(duì)大曲理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，分析其與微生物之間的相關(guān)性，以期發(fā)現(xiàn)影響大曲質(zhì)量的微生物因素，為完善大曲評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立統(tǒng)一的大曲質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

兩種等級(jí)的大曲樣品取自四川瀘州某酒廠。各種等級(jí)樣品隨機(jī)取3 個(gè)樣本作為平行樣，分別測(cè)定大曲理化指標(biāo)并提取DNA。大曲樣品的等級(jí)評(píng)定從外觀、斷面和香味3 個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)（表1）。

表1 優(yōu)級(jí)曲和一級(jí)曲感官特征Table 1 Sensory characteristics of superior grade and first grade of Daqu

1.1.2 試劑

氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、可溶性淀粉、己酸、無(wú)水乙醇、葡萄糖（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；硫酸、鹽酸、冰醋酸（均為分析純）成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vortex-M旋渦混勻儀 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；智城恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定

大曲生化、理化指標(biāo)的檢測(cè)參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

1.3.2 樣品總DNA提取

采用Omega.D5625-00土壤DNA提取試劑盒提取樣品中的總DNA，提取步驟參考試劑盒說(shuō)明方法。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，均滿足測(cè)序要求，細(xì)菌16S rRNA基因引物使用338F/806R（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’/5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），真菌引物使用ITS1F/ITS2R（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’/5’GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）。

擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27 次循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在10 ℃直到反應(yīng)停止。

細(xì)菌擴(kuò)增體系：4 μL 5×Fast緩沖液，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL上游引物（5 μmol/L），0.8 μL下游引物（5 μmol/L），0.4 μL FastDNA聚合酶，0.2 μL牛血清白蛋白，10 ng模板DNA ，ddHO補(bǔ)足至20 μL；真菌擴(kuò)增體系：2 μL 10×Fast緩沖液，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL上游引物（5 μmol/L），0.8 μL下游引物（5 μmol/L），0.2 μL r聚合酶，0.2 μL牛血清白蛋白，10 ng模板DNA，ddHO補(bǔ)足至20 μL。

1.3.4 Illumina MiSeq測(cè)序

利用Illumina公司的NovaSeq PE250平臺(tái)對(duì)細(xì)菌和真菌序列進(jìn)行測(cè)序分析（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司），原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistics 26和Microsoft Office Excel 2010對(duì)理化性質(zhì)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析；微生物群落結(jié)構(gòu)分析基于美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行繪制稀釋曲線和堆積柱狀圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同等級(jí)大曲微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

利用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)優(yōu)級(jí)曲和一級(jí)曲兩組曲樣的微生物群落進(jìn)行測(cè)序分析，對(duì)各樣本優(yōu)化后共得到了1 451 173 條有效細(xì)菌序列（平均每個(gè)樣本有120 931 條細(xì)菌序列）和1 453 187 條有效真菌序列（平均每個(gè)樣本有121 099 條有效真菌序列）。利用各樣本在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物Sobs指數(shù)構(gòu)建稀釋曲線（圖1），隨著測(cè)序深度的增加，曲線趨于平緩，表明測(cè)序量充足，能夠覆蓋所有樣本中的微生物群落。

用標(biāo)準(zhǔn)化的序列進(jìn)行多樣性分析，得到了細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)見表2。總體來(lái)說(shuō)，優(yōu)級(jí)曲中的物種豐富度和多樣性均高于一級(jí)曲，且所有大曲中細(xì)菌物種的豐富度和多樣性普遍高于真菌物種。從這個(gè)結(jié)果也可得出，大曲中細(xì)菌微生物類群比真菌微生物類群更加豐富，并且高質(zhì)量大曲相比于低質(zhì)量大曲有更加豐富的微生物區(qū)系。

圖1 細(xì)菌（a）和真菌（b）稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves of bacterial (a) and fungal diversity (b)

表2 不同大曲微生物群落α多樣性指數(shù)Table 2 α-Diversity indexes of microbial communities in different grades of Daqu

2.2 不同等級(jí)大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析

通過Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)曲樣的細(xì)菌和真菌物種進(jìn)行分析，得到屬水平上的物種組成情況。在屬水平上，根據(jù)平均相對(duì)豐度，將樣品中相對(duì)豐度小于0.01的物種歸為一類（others），如圖2a所示，優(yōu)級(jí)曲和一級(jí)曲兩組曲樣中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為高溫放線菌屬（）、魏斯氏菌屬（）、乳酸桿菌屬（）、克羅彭斯特菌屬（），這與其他學(xué)者的研究結(jié)果較為一致。

圖2 不同等級(jí)大曲細(xì)菌（a）和真菌（b）群落在屬水平的組成情況Fig. 2 Microbial community composition in different grades of Daqu at the genus level

其中高溫放線菌屬的相對(duì)豐度最高，是樣品中的第一優(yōu)勢(shì)菌屬，在優(yōu)級(jí)曲和一級(jí)曲中占比分別為21.17%和30.23%。高溫放線菌屬是大曲中重要的核心功能細(xì)菌微生物，在多種香型白酒釀造大曲中均大量存在，有較強(qiáng)的耐高溫特性，能夠適應(yīng)大曲高溫的發(fā)酵環(huán)境，具有產(chǎn)高溫淀粉酶、蛋白酶和脫氫酶等能力。魏斯氏菌屬在兩組大曲中的相對(duì)豐度分別為13.48%和12.60%，屬于乳酸細(xì)菌，能夠代謝產(chǎn)乳酸、乙酸等有機(jī)酸類物質(zhì)，有助于乳酸乙酯的生成和酒體風(fēng)味的形成，是大曲和白酒釀造過程中的主要微生物之一。乳酸桿菌屬在兩組大曲中占比為11.35%和7.83%，也是白酒釀造過程中的重要功能微生物，具有較強(qiáng)的耐酸性，能夠產(chǎn)生乳酸和乳酸乙酯等多種代謝物質(zhì)，對(duì)酒體中酸類和酯類等風(fēng)味物質(zhì)的協(xié)調(diào)有著重要作用；也有研究發(fā)現(xiàn)，窖泥中的微生物更傾向于代謝乳酸來(lái)產(chǎn)己酸，因此大曲中魏斯氏菌屬、乳酸桿菌屬等產(chǎn)乳酸的微生物，在進(jìn)入窖池之后的后期代謝活動(dòng)可能有利于己酸的生成，對(duì)濃香型白酒的主體香味物質(zhì)己酸乙酯的生成有重要作用?？肆_彭斯特菌屬是一級(jí)曲中第二大優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度占比為14.54%，而在優(yōu)級(jí)曲中占比則相對(duì)較低低，為4.19%，在劉婷等對(duì)不同環(huán)境條件下生產(chǎn)的特香性大曲之間的差異研究中，發(fā)現(xiàn)克羅彭斯特菌屬為其中主要的細(xì)菌屬；任愛容等研究茅臺(tái)鎮(zhèn)不同主釀區(qū)醬香型大曲發(fā)現(xiàn)該菌屬也為優(yōu)勢(shì)菌屬，結(jié)合研究報(bào)道，該菌屬在多種香型白酒釀造大曲均為優(yōu)勢(shì)菌屬，有研究推測(cè)其可能與大曲的產(chǎn)香機(jī)理有著緊密的聯(lián)系，但是其在白酒釀造過程中的具體作用報(bào)道較少，還有待進(jìn)一步的研究。其他報(bào)道中為優(yōu)勢(shì)菌屬的芽孢桿菌屬（）在兩組曲樣中占比僅為2.33%和1.17%；葡萄球菌屬（）占比為4.58%和2.34%，在兩組大曲中占比均不高。芽孢桿菌屬是大曲中重要的功能微生物，能夠產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶等多種酶類，與酯類、吡嗪、芳香族類、有機(jī)酸等白酒中重要風(fēng)味物質(zhì)的生成有緊密聯(lián)系，并且有助于減少白酒中的異雜味，以提升白酒的風(fēng)味品質(zhì)，在白酒釀造過程中發(fā)揮重要作用。葡萄球菌屬在自然環(huán)境中廣泛存在，但是對(duì)其在白酒釀造過程中發(fā)揮的作用還未明確。在本研究中，兩組曲樣也檢出了一定量的泛菌屬（），分別為2.23%和3.12%，有研究表明該菌屬在大曲發(fā)酵開始階段只在曲房空氣中大量存在，也有研究發(fā)現(xiàn)該菌屬為醬香型大曲中的優(yōu)勢(shì)菌屬。而未分類奈瑟球菌科（unclassified_f__Neisseriaceae）在優(yōu)級(jí)曲中占比較高，為3.80%，在一級(jí)曲中占比則低于1%，有研究表明其具有產(chǎn)脂肪酸的功能。

由圖2b可知，兩組大曲中真菌物種種類少于細(xì)菌，其中嗜熱真菌屬（）、未分類曲霉科（unclassified_f__Aspergillaceae）、嗜熱子囊菌屬（）為兩組樣品中占比較高的優(yōu)勢(shì)物種。在優(yōu)級(jí)曲和一級(jí)曲兩組曲樣中嗜熱真菌屬相對(duì)豐度為34.22%和44.14%，嗜熱子囊菌屬相對(duì)豐度為32.87%和8.42%，嗜熱真菌屬和嗜熱子囊菌屬是白酒釀造過程中重要的真菌微生物，已被多次報(bào)道在白酒釀造大曲和酒醅中大量存在，該類真菌產(chǎn)生的纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶等酶類具有較高的熱穩(wěn)定性和活力，能夠降解代謝原料中的大分子多糖和蛋白質(zhì)，對(duì)白酒釀造過程中微生物的生長(zhǎng)繁殖和生香物質(zhì)的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。霉菌中未分類曲霉科相對(duì)豐度分別為20.58%和36.95%，曲霉屬（）在優(yōu)級(jí)曲中相對(duì)豐度較高為5.37%，一級(jí)曲中相對(duì)豐度則為1.18%，根霉屬（）在優(yōu)級(jí)曲組中相對(duì)豐度為1.11%，而在一級(jí)曲中則低于1%，霉菌是大曲中重要的功能真菌微生物，能產(chǎn)糖化酶、液化酶、酯化酶等多種酶類，有利于大曲原料的降解發(fā)酵，被視作糖化降解動(dòng)力的主要來(lái)源，其生長(zhǎng)代謝繁殖情況也在一定程度上反映了大曲的質(zhì)量特征。在一級(jí)曲中、相對(duì)豐度高于優(yōu)級(jí)曲，分別為2.50%和1.29%，在優(yōu)級(jí)曲中則低于1%。在本研究中，酵母在兩組樣品中的相對(duì)豐度均很低，除了屬于酵母目的、unclassified_p__Ascomycota、，其余如伊薩酵母屬（）、假絲酵母屬（）、絲孢酵母菌屬（）、復(fù)膜孢酵母屬（），雖然也可以在樣品中被檢測(cè)出，但是其相對(duì)豐度均低于1%，酵母菌是白酒釀造過程中產(chǎn)酒產(chǎn)香的主要微生物，但是在濃香型大曲中酵母菌的相對(duì)豐度較低，研究表明，在大曲發(fā)酵前期由于溫度較低，酵母菌大量生長(zhǎng)繁殖，隨著發(fā)酵溫度逐漸升高，其他耐熱真菌、霉菌開始大量繁殖，酵母菌的生長(zhǎng)則受到抑制，優(yōu)勢(shì)地位逐漸被取代。

通過對(duì)兩組大曲在屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，曲樣中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌微生物種類和相對(duì)豐度差異不大，其中不同的是一級(jí)曲中克羅彭斯特菌屬遠(yuǎn)高于優(yōu)級(jí)曲樣品，而優(yōu)級(jí)曲樣品中未分類奈瑟球菌科則明顯高于一級(jí)曲。對(duì)于真菌微生物而言，兩組大曲中的優(yōu)勢(shì)真菌物種沒有明顯差異，但是不同大曲中優(yōu)勢(shì)真菌物種相對(duì)豐度有較大差異；在優(yōu)級(jí)曲中嗜熱子囊菌屬和曲霉屬遠(yuǎn)高于一級(jí)曲樣品，未分類曲霉科則是一級(jí)曲高于優(yōu)級(jí)曲。由此可以看出，兩種等級(jí)的大曲中優(yōu)勢(shì)微生物物種一致，但是相對(duì)豐度有著一定差異，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)微生物中克羅彭斯特菌屬和真菌優(yōu)勢(shì)微生物中的嗜熱子囊菌屬和霉菌均有較大的差異，這可能也是導(dǎo)致大曲質(zhì)量存在差異的原因。

2.3 不同等級(jí)大曲差異微生物分析

為了進(jìn)一步分析不同等級(jí)大曲微生物的差異，利用LEfSe分析解析兩組大曲中的差異微生物，并結(jié)合Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)兩組樣品的差異微生物的相對(duì)豐度進(jìn)行評(píng)估，獲得優(yōu)級(jí)曲和一級(jí)曲中具有顯著差異的物種，兩組大曲中細(xì)菌差異微生物結(jié)果如圖3所示。

圖3 細(xì)菌LEfSe多級(jí)物種層級(jí)樹圖（a）、LDA柱形圖（b）和兩組比較秩和檢驗(yàn)條形圖（c）Fig. 3 Bacterial LEfSe multi-level species hierarchical tree diagram (a),LDA histogram (b), and bar graph of rank sum test between two groups (c)

從圖3a、b可以看出，在屬水平兩組大曲中共檢測(cè)出9 種差異微生物，線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞3，其中優(yōu)級(jí)曲中差異物種為泰氏菌屬（）、腸球菌屬（）、乳球菌屬（）、、嗜蛋白菌屬（）、紅球菌屬（）、變形桿菌屬（），一級(jí)曲中差異微生物為沙雷氏菌屬（）、g__unclassified_c__Alphaproteobacteria。且優(yōu)級(jí)曲的紅球菌屬、變形桿菌屬、乳球菌屬、嗜蛋白菌屬、腸球菌屬的相對(duì)豐度顯著高于一級(jí)曲（＜0.05）（圖3c）。一級(jí)曲中的沙雷氏菌屬極顯著高于優(yōu)級(jí)曲（＜0.01），雖然其并未在白酒釀造中體現(xiàn)出功能，但有可能通過微生物的相互作用影響大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)；g__unclassified_c__Alphaproteobacteria菌屬顯著高于優(yōu)級(jí)曲。兩組大曲差異細(xì)菌微生物中乳球菌屬雖然相對(duì)豐度低于1%，但是具有水解蛋白和產(chǎn)生特征風(fēng)味物質(zhì)的能力，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品中（干酪、酸奶、酸奶油），雖然在白酒釀造過程中的研究報(bào)道較少，但是其產(chǎn)酯、酸、酮等風(fēng)味物質(zhì)的能力在白酒釀造過程中發(fā)揮的作用也值得關(guān)注。

圖4為兩組曲樣中真菌物種LEfSe分析和差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，可知在屬水平上，兩組大曲中檢測(cè)出差異物種共有9 種（LDA＞3）。其中優(yōu)級(jí)曲差異微生物為嗜熱子囊菌屬（）、g__unclassified_p__Ascomycota、根霉屬（）、假絲酵母屬（）、；一級(jí)曲中的差異微生物為耐干霉菌屬（）、、、未分類曲霉科（g__unclassified_f__Aspergillaceae）。優(yōu)級(jí)曲中的嗜熱子囊菌屬、g__unclassified_p__Ascomycota、根霉屬、假絲酵母屬、相對(duì)豐度均顯著高于一級(jí)曲，而一級(jí)曲中的耐干霉菌屬、未分類曲霉科的相對(duì)豐度顯著高于優(yōu)級(jí)曲。

圖4 真菌LEfSe多級(jí)物種層級(jí)樹圖（a）、LDA柱形圖（b）和兩組比較秩和檢驗(yàn)條形圖（c）Fig. 4 Fungal LEfSe multi-level species hierarchical tree diagram (a),LDA histogram (b), and bar graph of rank sum test between two groups (c)

兩組大曲中的差異微生物分析結(jié)果表明，細(xì)菌差異微生物均是樣品中相對(duì)豐度較低的一類物種，除了乳球菌屬，其他微生物在白酒釀造過程中的功能暫未見報(bào)道；而真菌差異微生物不同的是，其中嗜熱子囊菌屬、未分類曲霉科是樣品中的優(yōu)勢(shì)真菌物種，且大部分差異真菌微生物均在白酒釀造過程中發(fā)揮重要的作用，如嗜熱子囊菌屬、未分類曲霉科、根霉屬、假絲酵母屬等。因此可以推測(cè)，正是這些真菌微生物，特別是嗜熱子囊菌屬、未分類曲霉科在制曲過程中大量生長(zhǎng)繁殖，并產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，最終導(dǎo)致了大曲質(zhì)量之間的差異。

2.4 不同等級(jí)大曲理化、生化指標(biāo)的差異

大曲理化指標(biāo)如水分、酸度等在一定程度上能夠很好地反映出大曲的質(zhì)量，也是目前大曲質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，生化指標(biāo)則反映大曲中酶系的功能組成以及微生物的生長(zhǎng)繁殖情況。利用SPSS軟件采用單因素方差分析，比較兩種等級(jí)大曲的理化指標(biāo)差異，分析結(jié)果見表3。

表3 不同大曲樣理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of different grades of Daqu

從表3可以看出，兩組曲樣的水分、總酸含量、pH值均有顯著差異，大曲中水分含量主要受到曲房溫度、濕度以及微生物生長(zhǎng)特別是絲狀微生物的影響，而較低水分含量不利于微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)，兩組大曲的水分均低于13%，其中優(yōu)級(jí)曲水分顯著低于一級(jí)曲；總酸含量是微生物生長(zhǎng)過程中代謝產(chǎn)酸以及脂肪、淀粉和蛋白質(zhì)降解生成酸類物質(zhì)的總和，能夠在一定程度上表征大曲發(fā)酵過程中微生物的生長(zhǎng)代謝情況，優(yōu)級(jí)曲的總酸含量顯著高于一級(jí)曲，pH值則顯著低于一級(jí)曲，且兩組總酸含量均在0.9～1.3 mmol/10 g之間，達(dá)到了一級(jí)曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。糖化力和液化力大小反映了大曲中糖化酶和液化酶的酶活力大小，其主要由霉菌和芽孢桿菌產(chǎn)生，有研究表明絲狀真菌能夠提高大曲的糖化力，其中優(yōu)級(jí)曲液化力大小、糖化力大小均顯著低于一級(jí)曲（＜0.05）。酯化力反映了大曲中酯化酶催化酸類和醇類物質(zhì)生成酯類化合物能力的大小，發(fā)酵力則是體現(xiàn)了大曲中微生物發(fā)酵產(chǎn)酒的能力，也在一定程度上反映了微生物的生長(zhǎng)代謝情況?？芍瑑?yōu)級(jí)曲的酯化力顯著高于一級(jí)曲樣品，發(fā)酵力也大于一級(jí)曲，但是沒有顯著差異。

2.5 大曲理化指標(biāo)與微生物的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步解析大曲理化指標(biāo)與微生物之間的關(guān)系，利用冗余分析（redundancy analysis，RDA）兩者之間的相關(guān)性。由于很多理化因子之間存在著較強(qiáng)的共線性關(guān)系，因此首先通過方差膨脹因子（variance inflation factor，VIF）分析，篩選去除共線性較強(qiáng)（VIF＞10）的理化因子，最終保留了酸度、pH值和發(fā)酵力作為重要理化變量用于后續(xù)的RDA。

圖5 細(xì)菌（a）、真菌（b）與理化指標(biāo)的RDAFig. 5 Redundancy analysis of bacteria (a) and fungi (b) versus physicochemical indicators

圖5展示了大曲微生物中相對(duì)豐度前10的細(xì)菌和真菌物種與大曲理化指標(biāo)之間的關(guān)系。細(xì)菌中的魏斯氏菌屬、乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬和真菌中的嗜熱子囊菌屬與pH值和發(fā)酵力呈正相關(guān)，魏斯氏菌屬、乳酸桿菌屬等這類產(chǎn)酸微生物在大曲中大量存在，可能也是導(dǎo)致優(yōu)級(jí)曲pH值顯著低于一級(jí)曲的原因，而高溫放線菌屬、克羅彭斯特菌屬與pH值呈負(fù)相關(guān)，可能的原因是這兩類微生物都屬于放線菌，更適應(yīng)于在中性或微堿性的環(huán)境中生存，因此在一級(jí)曲中這兩類微生物的相對(duì)豐度均遠(yuǎn)高于優(yōu)級(jí)曲；而對(duì)大曲發(fā)酵力而言，由于不管是酵母菌的乙醇發(fā)酵還是細(xì)菌乙醇發(fā)酵，乙醇的產(chǎn)生都是通過丙酮酸脫羧成乙醛后被還原為乙醇，即乙醇和CO具有伴生關(guān)系，因此大曲發(fā)酵力是以大曲中微生物產(chǎn)CO的量表征。但是，在發(fā)酵力測(cè)定條件下，大曲微生物仍然存在有氧呼吸，即微生物存在三羧酸循環(huán)代謝途徑，該過程盡管沒有乙醇的合成，但卻存在CO生成。同時(shí)，異性乳酸或同型乳酸發(fā)酵條件下也會(huì)有CO的生成。因此分析結(jié)果顯示這幾類微生物與發(fā)酵力呈正相關(guān)，并不意味這幾類微生物與乙醇的合成呈正相關(guān)。

3 結(jié) 論

對(duì)優(yōu)級(jí)曲和一級(jí)曲兩種等級(jí)大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)與理化指標(biāo)進(jìn)行了比較分析，并結(jié)合數(shù)理分析法研究了微生物與理化指標(biāo)之間的關(guān)系。通過對(duì)兩種等級(jí)大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明兩種大曲的優(yōu)勢(shì)物種基本一致，但是物種間的相對(duì)豐度有較大差異；經(jīng)LEfSe分析并結(jié)合Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種等級(jí)的大曲之間的細(xì)菌差異微生物均為樣品中的低豐度物種，而真菌差異微生物中的、未分類曲霉科為大曲中優(yōu)勢(shì)物種，且相對(duì)豐度具有顯著差異；理化分析結(jié)果表明，兩種等級(jí)的大曲理化性質(zhì)除了發(fā)酵力外均有顯著差異，結(jié)合RDA發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬、嗜熱子囊菌屬、曲霉屬與總酸含量和發(fā)酵力呈正相關(guān)。這些結(jié)果說(shuō)明了不同等級(jí)大曲的優(yōu)勢(shì)微生物相對(duì)豐度存在較大差異，且理化指標(biāo)之間也存在顯著差異，特別是嗜熱子囊菌屬和未分類曲霉科在兩種等級(jí)大曲中的相對(duì)豐度差異顯著，與大曲的理化性質(zhì)息息相關(guān)，而大曲中這些優(yōu)勢(shì)真菌微生物的顯著差異可能就是影響大曲質(zhì)量的重要微生物因素。前述結(jié)論表述了對(duì)大曲質(zhì)量有重要影響的微生物類群，為進(jìn)一步完善大曲評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立濃香型大曲質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供了理論參考。