苦蕎中蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的抑制能力

周一鳴，馬思佳，蔣晴怡，周小理,2,*，李云龍

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 美麗中國(guó)與生態(tài)文明研究院上海高校智庫(kù)，上海 201418；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西功能食品研究院，山西 太原 030031）

隨著人們生活質(zhì)量的改善和醫(yī)療水平的提高，全球平均健康預(yù)期壽命穩(wěn)定增長(zhǎng)。然而，糖尿病等代謝類疾病發(fā)生率出現(xiàn)驚人的增長(zhǎng)，已成為許多國(guó)家的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前，糖尿病是僅次于腫瘤和心腦血管病威脅人類健康的第3大疾病。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)的數(shù)據(jù)表明，截至2019年全世界患有糖尿病的成年人總數(shù)已達(dá)4.63億，中國(guó)糖尿病患者人數(shù)已達(dá)1.1億。糖尿病的主要危害在于糖尿病并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡。管理糖尿病的主要策略是減少糖的攝入，抑制碳水化合物的水解，主要通過(guò)抑制碳水化合物水解過(guò)程中起關(guān)鍵作用的兩種淀粉消化酶α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶實(shí)現(xiàn)。

目前，阿卡波糖、二甲雙胍和米格列醇等藥物已經(jīng)在臨床被用于抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，以治療II型糖尿病。但是使用這些藥物往往會(huì)對(duì)腸胃產(chǎn)生很大的副作用，包括惡心、脹氣、腹瀉、腹痛和腸胃氣脹，其主要原因是未被消化的碳水化合物在腸道菌群的作用下異常發(fā)酵而引起。近年來(lái)，隨著人們?cè)絹?lái)越重視天然和健康食品，一些天然來(lái)源的植物或提取物已被研究發(fā)現(xiàn)具有抑制消化酶的作用，并且毒性較低，尤其是聯(lián)合使用兩種或兩種以上天然化合物可以起到協(xié)同治療的效果，減少劑量和毒性，同時(shí)能夠減少耐藥性的誘導(dǎo)。Wu Xiaqing等的研究發(fā)現(xiàn)表兒茶素沒(méi)食子酸酯與阿卡波糖或表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯聯(lián)合對(duì)α-淀粉酶表現(xiàn)為拮抗作用，對(duì)α-葡萄糖苷酶則表現(xiàn)為協(xié)同作用。

苦蕎因其高營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值已顯示出良好的市場(chǎng)潛力。研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎富含淀粉，尤其是抗性淀粉，可以作為糖尿病患者的理想食物。同時(shí)，苦蕎中含有較豐富的黃酮類化合物，包括蘆丁、槲皮素、山柰酚等成分，是降血糖的主要功能因子，其中蘆丁是苦蕎黃酮的主要成分，占黃酮類化合物的70%以上。已有研究指出，苦蕎黃酮的濃度與抑制淀粉消化酶的效率呈正相關(guān)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)苦蕎總黃酮對(duì)淀粉消化酶的抑制效果強(qiáng)于苦蕎水溶性提取物和苦蕎醇溶性提取物，說(shuō)明苦蕎黃酮的降血糖功效往往是多種成分共同發(fā)揮的作用。

苦蕎中黃酮對(duì)淀粉消化酶抑制作用的研究往往局限于單獨(dú)抑制，而缺乏對(duì)聯(lián)合抑制作用的探討，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬苦蕎淀粉體外消化體系，探討苦蕎中的主要黃酮（蘆丁和槲皮素）對(duì)淀粉消化酶的單獨(dú)抑制效果和機(jī)制，以及同時(shí)存在時(shí)對(duì)淀粉消化酶活性的抑制作用，為苦蕎產(chǎn)品的深加工提供一定理論基礎(chǔ)，以期為調(diào)控苦蕎的功能性，最大化苦蕎的降血糖效果指引方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆?。兌取?8%）、槲皮素（純度≥98%）、阿卡波糖、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（純度≥98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；豬胰腺α-淀粉酶（酶活力2 000 U/g） 美國(guó)Adamas-beta公司；α-葡萄糖苷酶（酶活力100 000 U/mL） 上海源葉生物技術(shù)有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；苦蕎淀粉由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

M200 PRO酶標(biāo)儀 奧地利帝肯公司；RF-5301 PC熒光分光光度計(jì) 日本島津株式會(huì)社；PURELAB Classic超純水機(jī) 英國(guó)ELGA公司；SHZ-B水浴恒溫振動(dòng)搖床中國(guó)上海博訊公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的單獨(dú)抑制實(shí)驗(yàn)

對(duì)α-淀粉酶的抑制實(shí)驗(yàn)參照王靜等的方法。將60 μL不同質(zhì)量濃度（0～1 mg/mL）蘆丁或槲皮素和60 μL 2 U/mL α-淀粉酶混合，37 ℃預(yù)孵育10 min。添加2.5 mL 20 mg/mL Tris緩沖鹽溶液、0.4 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 6.9）和0.98 mL超純水，37 ℃、150 r/min恒溫水浴搖床中反應(yīng)3 min。最后加入2 mL 3,5-二硝基水楊酸，在沸水浴中加熱5 min后終止反應(yīng)。反應(yīng)溶液冷卻至室溫后，稀釋至25 mL，在540 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制實(shí)驗(yàn)參照Z(yǔ)hao Chunchao等的方法。將100 μL不同質(zhì)量濃度蘆丁或槲皮素和100 μL 2 U/mL α-淀粉酶混合，37 ℃預(yù)孵育10 min。添加250 μL 3 mmol/L對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、1 mL磷酸鈉緩沖液和0.98 mL超純水，37 ℃、150 r/min恒溫水浴搖床中反應(yīng)10 min。最后，加入NaCO溶液（2 mL、1 mol/L）停止反應(yīng)，在405 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

設(shè)置僅添加酶為空白組，抑制劑和酶都不添加為空白對(duì)照組，添加抑制劑和酶為樣品組，僅添加抑制劑為樣品對(duì)照組。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率：

1.3.2 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

參照陳雨涔等的方法，固定底物質(zhì)量濃度（2 g/mL、2.5 mL），測(cè)定不同質(zhì)量濃度蘆?。?、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）和槲皮素（0、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL）存在時(shí)，對(duì)應(yīng)體系的反應(yīng)速率隨α-淀粉酶活力的變化，判斷抑制劑的可逆性。固定底物濃度（3 mmol/L、250 μL），測(cè)定不同質(zhì)量濃度蘆?。?、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）和槲皮素（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）存在時(shí)，對(duì)應(yīng)體系的反應(yīng)速率隨α-葡萄糖苷酶活力的變化，判斷抑制劑的可逆性。

固定α-淀粉酶（2 U/mL、60 μL）活力，測(cè)定不同質(zhì)量濃度蘆?。?、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）和槲皮素（0、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL）存在時(shí)，對(duì)應(yīng)體系的反應(yīng)速率隨底物質(zhì)量濃度的變化。固定α-葡萄糖苷酶（2 U/mL、100 μL）活力，測(cè)定不同質(zhì)量濃度蘆?。?、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）和槲皮素（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）存在時(shí)，對(duì)應(yīng)體系的反應(yīng)速率隨底物質(zhì)量濃度的變化。

進(jìn)一步以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制Lineweaver-Burk曲線圖，根據(jù)所得直線的相交情況，確定蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

式（2）～（5）中：v為存在或不存在蘆丁和槲皮素時(shí)的酶促反應(yīng)速率；v為最大酶反應(yīng)速率；c為苦蕎淀粉和對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷濃度；c為蘆丁和槲皮素質(zhì)量濃度；K為米氏常數(shù)；K為抑制劑與酶結(jié)合的平衡常數(shù)；K為抑制劑與酶-底物復(fù)合物結(jié)合的平衡常數(shù)。

1.3.3 淀粉消化酶的熒光猝滅分析

參考梁宗瑤等的方法，在3 種溫度（298、304、310 K）下用熒光分光光度計(jì)分別測(cè)定α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光變化，加入不同濃度的蘆丁或槲皮素（0～64 μmol/L）孵育5 min后，繼續(xù)進(jìn)行測(cè)量。激發(fā)波長(zhǎng)280 nm；發(fā)射波長(zhǎng)300～500 nm；激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均5.0 nm。通過(guò)Stern-Vlomer方程可以判斷蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅機(jī)理，如下：

式（6）～（7）中：F和F分別為α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶在不存在或存在蘆丁和槲皮素時(shí)的熒光強(qiáng)度；c為蘆丁和槲皮素的濃度；τ為熒光團(tuán)的平均熒光壽命；K、K和K分別為猝滅速率常數(shù)、猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的主要作用力類型可以通過(guò)Van’t-Hoff方程進(jìn)行判斷，如下：

式（8）～（9）中：T為溫度；R為氣體常數(shù)；ΔG為自由能變化；ΔH為焓變；ΔS為熵變。

1.3.4 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的聯(lián)合抑制實(shí)驗(yàn)

通過(guò)蘆丁和槲皮素單獨(dú)抑制時(shí)的抑制能力曲線計(jì)算出對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度（IC）值。在此基礎(chǔ)上結(jié)合苦蕎加工過(guò)程中蘆丁和槲皮素的變化范圍，將蘆丁與槲皮素按照不同濃度比混合，參考1.3.1節(jié)中酶活性測(cè)定方法，進(jìn)行聯(lián)合抑制實(shí)驗(yàn)，計(jì)算蘆丁與槲皮素聯(lián)合對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。為了評(píng)價(jià)蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用的抑制作用，判斷聯(lián)合作用的效果，利用等效線圖解法和Chou-Talalay藥物聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）進(jìn)行評(píng)價(jià)。CI計(jì)算公式如下：

式中：D、D分別為組合系統(tǒng)中產(chǎn)生一定抑制水平蘆丁和槲皮素的劑量；Dx、Dx分別為單獨(dú)添加的導(dǎo)致相同抑制水平蘆丁和槲皮素的劑量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的單獨(dú)抑制能力

如圖1所示，蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶都表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用。其中，阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照的酶抑制效果最強(qiáng)，對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC值分別為0.047 mg/mL和0.03 mg/mL。但阿卡波糖對(duì)淀粉消化酶的過(guò)度抑制可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸內(nèi)未被消化的淀粉發(fā)生異常發(fā)酵，從而產(chǎn)生胃腸道功能紊亂；而蘆丁和槲皮素相對(duì)溫和的抑制活性，能有效緩解胃腸道不適。由圖1A可知，蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶的IC值分別為0.36 mg/mL和0.22 mg/mL；由圖1B可知，蘆丁和槲皮素對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC值分別為1.3 mg/mL和0.362 mg/mL。槲皮素比蘆丁具有更強(qiáng)的抑制能力，是由于槲皮素C環(huán)上的羥基被一個(gè)糖基取代變?yōu)樘J丁，羥自由基轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔赡軙?huì)發(fā)生空間位阻，削弱蘆丁與酶的結(jié)合作用，從而降低蘆丁的抑制能力。

圖1 蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）的抑制曲線Fig. 1 Inhibitory effects of rutin and quercetin on α-amylase (A) and α-glucosidase (B)

此外，由圖1可知，蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶的抑制效果更強(qiáng)，分別是對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力的3.6 倍和1.6 倍，這可能是由于蘆丁和槲皮素B環(huán)上的羥基有利于與α-淀粉酶的活性位點(diǎn)結(jié)合。

2.2 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析

由圖2可知，不同質(zhì)量濃度的蘆丁和槲皮素都能得到一條通過(guò)原點(diǎn)的直線，且斜率隨著質(zhì)量濃度的增加而減小。由此可知，蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都屬于可逆性抑制作用。

圖2 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的抑制可逆性Fig. 2 Reversible inhibitory effects of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

如圖3A和C所示，蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶抑制的雙倒數(shù)曲線，所有直線與縱軸相交，隨著蘆丁和槲皮素質(zhì)量濃度的增加，K值不斷增加而v值保持不變。因此蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制，通過(guò)與α-淀粉酶的活性中心結(jié)合，占據(jù)底物的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制底物的水解。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制公式可以計(jì)算出蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶的K值分別為806.29、793.92 μg/mL，說(shuō)明槲皮素與α-淀粉酶的結(jié)合更牢固，具有更強(qiáng)的抑制效果，與2.1節(jié)中槲皮素對(duì)α-淀粉酶的抑制能力強(qiáng)于蘆丁的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

如圖3B所示，所有直線都相交于第3象限，K值和v同時(shí)減小，表明蘆丁對(duì)α-葡萄糖苷酶屬于非競(jìng)爭(zhēng)性和反競(jìng)爭(zhēng)性的混合型抑制，其中，K值為9.61 μmol/L，K值為3.38 μmol/L，說(shuō)明蘆丁更傾向于與酶-底物復(fù)合物結(jié)合。如圖3D所示，所有直線都相交于第2象限，K值逐漸升高，同時(shí)v逐漸降低，表明槲皮素對(duì)α-葡萄糖苷酶為競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性的混合型抑制，K值為3.72 μmol/L，K值為9.74 μmol/L，說(shuō)明槲皮素更傾向于與游離的α-葡萄糖苷酶結(jié)合。

圖3 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的雙倒數(shù)圖Fig. 3 Double-reciprocal plots of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

2.3 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的熒光光譜分析

由圖4可知，當(dāng)測(cè)試溫度298 K、激發(fā)波長(zhǎng)280 nm時(shí)，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均在340 nm波長(zhǎng)附近有最大發(fā)射峰（λ）。當(dāng)反應(yīng)體系中加入不同濃度的蘆丁和槲皮素，兩種酶的熒光強(qiáng)度都展現(xiàn)出劑量依賴性的猝滅，且λ發(fā)生不同程度的移動(dòng)。如圖4A和B所示，隨著蘆丁濃度的增加，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的λ分別從340 nm移動(dòng)到335 nm和332 nm；如圖4C和D所示，隨著槲皮素濃度的增加，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的λ分別從342 nm和340 nm移動(dòng)至338 nm。這種現(xiàn)象表明蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶之間存在相互作用，導(dǎo)致氨基酸殘基逐漸暴露在水溶液中，所處環(huán)境極性降低。

圖4 蘆丁和槲皮素與淀粉消化酶熒光光譜圖Fig. 4 Fluorescence spectra of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

2.4 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的結(jié)合性質(zhì)分析

由圖5可知，蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer曲線均具有良好的線性關(guān)系。由表1可知，隨著溫度的升高，蘆丁對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的K值分別降低了2.58×10L/mol和1.97×10L/mol，槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的K值分別降低了1.60×10L/mol和2.12×10L/mol；K值均隨著溫度的升高而降低，且K值為10和10數(shù)量級(jí)，遠(yuǎn)大于生物大分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)2.0×10L/（mol·s），說(shuō)明蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均通過(guò)形成復(fù)合物的方式發(fā)生靜態(tài)猝滅。

圖5 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的Stern-Volmer曲線Fig. 5 Stern-Volmer curves of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

由圖6可知，蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用的雙對(duì)數(shù)曲線圖均具有良好的線性關(guān)系，利用擬合直線的斜率和截距，并結(jié)合靜態(tài)猝滅公式，由此可以計(jì)算得到K值和n。如表1所示，槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的K值均高于蘆丁，說(shuō)明槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合力更強(qiáng)；蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶的K值高于α-葡萄糖苷酶，說(shuō)明蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶具有更強(qiáng)的結(jié)合力。此外，n值近似于1，表明蘆丁和槲皮素在α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶上只存在一個(gè)（或一類）結(jié)合位點(diǎn)。

圖6 蘆丁和槲皮素與淀粉消化酶相互作用的雙對(duì)數(shù)曲線圖Fig. 6 Double logarithm plots of rutin and quercetin with starch-digesting enzymes

通過(guò)Van’t-Hoff方程計(jì)算出ΔH、ΔS及ΔG的變化，可以判斷蘆丁和槲皮素與淀粉消化酶之間的相互作用力。如表1所示，ΔG均為負(fù)值，表明蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合是一種自發(fā)的過(guò)程。蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶反應(yīng)時(shí)，ΔH均為負(fù)值，ΔS均為正值，表明這種結(jié)合是熵驅(qū)動(dòng)的放熱過(guò)程，疏水相互作用力和氫鍵是蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶復(fù)合物穩(wěn)定的主要驅(qū)動(dòng)力。蘆丁和槲皮素與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)時(shí)，ΔH和ΔS均為負(fù)值，表明主要驅(qū)動(dòng)力是氫鍵。

表1 蘆丁或槲皮素與α-淀粉酶或α-葡萄糖苷酶相互作用及熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters for interaction between rutin or quercetin and α-amylase or α-glucosidase

2.5 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的聯(lián)合抑制作用

由2.1節(jié)的結(jié)果（圖1）可知，蘆丁和槲皮素對(duì)于α-淀粉酶的IC比為1.64∶1，蘆丁和槲皮素對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC比為3.6∶1。已有研究發(fā)現(xiàn)苦蕎中蘆丁含量是槲皮素的7 倍，但在加工存儲(chǔ)過(guò)程中約80%的蘆丁會(huì)水解成槲皮素，所以槲皮素含量通常是蘆丁的5 倍。因此，分別以7∶1、1.64∶1和1.64∶8.2，作為蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用抑制α-淀粉酶的濃度比，以7∶1、3.6∶1和3.6∶18作為蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用抑制α-葡萄糖苷酶的濃度比。

圖7 蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用對(duì)α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）的抑制能力Fig. 7 Combined inhibition of rutin and quercetin on α-amylase (A)and α-glucosidase (B)

如圖7所示，蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均具有抑制效果。在相同質(zhì)量濃度下，蘆丁和槲皮素聯(lián)合作用優(yōu)于單獨(dú)抑制的效果，且抑制率隨著二者聯(lián)合質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高。二者濃度比為1.64∶8.2時(shí)對(duì)α-淀粉酶抑制能力最強(qiáng)，IC值為0.055 mg/mL；二者濃度比為3.6∶18時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力最強(qiáng)，IC值為0.091 mg/mL。結(jié)果表明，蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用時(shí)均能夠提高對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果，且槲皮素較多時(shí)，抑制作用更強(qiáng)。

2.6 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶聯(lián)合抑制作用的評(píng)價(jià)

圖8 蘆丁和槲皮素聯(lián)合抑制α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）的IC50等效線圖Fig. 8 IC50 isobolograms for inhibition of α-amylase (A) and α-glucosidase (B) by combined use of rutin and quercetin

由圖8A可知，3 種濃度比下的劑量對(duì)均位于等效線的下方，CI值分別為0.20、0.22和0.24，均小于1，表明蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用對(duì)α-淀粉酶表現(xiàn)出協(xié)同抑制的作用。其中，蘆丁和槲皮素濃度比為7∶1時(shí)CI值最小，具有更好地協(xié)同抑制效果，這可能是由于α-淀粉酶上有多個(gè)活性位點(diǎn)，蘆丁和槲皮素能夠與α-淀粉酶的不同氨基酸殘基發(fā)生特異性結(jié)合，聯(lián)合使用時(shí)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，增加了黃酮-酶復(fù)合物的穩(wěn)定性。

由圖8B可知，3 種濃度比下的劑量對(duì)均位于等效線的下方，CI值分別為0.41、0.36和0.22，均小于1。表明蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出協(xié)同抑制的作用。其中，蘆丁和槲皮素濃度比為3.6∶18時(shí)CI值最小，具有更好的協(xié)同抑制效果，這可能是由于蘆丁和槲皮素都能夠非競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-葡萄糖苷酶活性，與α-葡萄糖苷酶的非競(jìng)爭(zhēng)性位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)了協(xié)同抑制作用。此外，由2.4節(jié)的結(jié)果可知，槲皮素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合力更強(qiáng)，因此槲皮素占比較多時(shí)協(xié)同抑制效果更好。

3 結(jié) 論

通過(guò)探究苦蕎中黃酮的主要成分蘆丁和槲皮素單獨(dú)使用和聯(lián)合使用的抑制效果，結(jié)合抑制動(dòng)力學(xué)、熒光光譜法，更加精準(zhǔn)和全面地分析苦蕎中蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的影響。主要研究結(jié)果表明，蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都具有劑量依賴性的抑制，且對(duì)兩種淀粉消化酶的抑制效果皆為槲皮素優(yōu)于蘆丁。蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶的IC值分別為0.36 mg/mL和0.22 mg/mL，對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC值分別為1.30 mg/mL和0.362 mg/mL。二者對(duì)α-淀粉酶的抑制效果強(qiáng)于α-葡萄糖苷酶。進(jìn)一步判斷抑制機(jī)理可知，蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶以疏水相互作用力和氫鍵結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶的活性，且槲皮素與α-淀粉酶的結(jié)合能力更強(qiáng)，能起到更好的抑制效果；對(duì)α-葡萄糖苷酶均為通過(guò)氫鍵結(jié)合的混合型抑制。同時(shí)，二者與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合只存在一個(gè)（或一類）作用位點(diǎn)。將蘆丁和槲皮素按照不同比例聯(lián)合使用可以增強(qiáng)兩者單用時(shí)的抑制能力，并且對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都具有協(xié)同抑制的作用，當(dāng)二者濃度比為7∶1和3.6∶18時(shí)，對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的CI值分別達(dá)到0.20和0.22，具有最佳的協(xié)同抑制效果。