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    納米魚骨在肌球蛋白膠凝過程中鈣賦存形態(tài)的變化及分布

    2022-10-09 01:57:22張夢(mèng)玲熊善柏
    食品科學(xué) 2022年18期
    關(guān)鍵詞:中鈣肌球蛋白魚骨

    高 霞,張夢(mèng)玲,熊善柏,胡 楊,尹 濤,劉 茹

    (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,國(guó)家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心(武漢),長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心,湖北 武漢 430070)

    肌球蛋白是魚糜膠凝過程中最重要的功能性蛋白,對(duì)形成具有良好質(zhì)地的魚糜制品至關(guān)重要。魚糜熱誘導(dǎo)膠凝過程中,在較低溫度(5~40 ℃)下的凝膠化行為與內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(fish endogenous transglutaminase,F(xiàn)TGase)密切相關(guān),F(xiàn)TGase通過催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的谷氨酸與賴氨酸殘基之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),生成ε-(γ-Glu)-Lys異肽鍵,促進(jìn)蛋白質(zhì)分子聚集形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。研究表明,F(xiàn)TGase具有Ca依賴性,生產(chǎn)過程中常需要添加鈣鹽以提高其催化活性進(jìn)而改善魚糜的凝膠性能。近年來,有學(xué)者比較研究了氯化鈣、碳酸鈣、乳酸鈣等化合鈣對(duì)魚糜凝膠性能的影響,發(fā)現(xiàn)溶解性越好的化合鈣對(duì)魚糜凝膠性能的提升作用越大。但是,化合鈣添加量過多會(huì)產(chǎn)生苦味,對(duì)魚糜制品的風(fēng)味產(chǎn)生不良影響。

    魚骨是魚糜加工過程中產(chǎn)生的主要固體副產(chǎn)物,約占整條魚的10%~15%。魚骨中富含鈣、磷等元素,且鈣磷比利于人體吸收,具有較高的生物利用度,是天然的優(yōu)質(zhì)鈣源。目前,工業(yè)生產(chǎn)中大都將魚骨加工成飼料或直接當(dāng)作下腳料丟棄,利用率極低,易造成資源浪費(fèi)甚至引發(fā)環(huán)境污染問題,將其開發(fā)為新型鈣源,對(duì)副產(chǎn)物的高效利用具有重要意義。魚骨中的鈣大都以羥基磷灰石的形式存在,溶解度較低。前期實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),魚骨中鈣的生物利用度隨著魚骨尺寸的減小而升高,納米魚骨(nano fish bone,NFB)中鈣的溶解性較微米魚骨顯著提高。相較于CaCl,NFB中僅有少部分鈣以游離態(tài)存在,其對(duì)FTGase的激活作用弱于CaCl,但是NFB對(duì)魚糜凝膠的提升作用強(qiáng)于CaCl,這可能與NFB中鈣的不同賦存形態(tài)有關(guān)。然而,關(guān)于NFB在肌球蛋白膠凝過程中鈣的賦存形態(tài)如何轉(zhuǎn)化鮮有報(bào)道。

    本實(shí)驗(yàn)以鰱魚骨為原料制備NFB,將其加入肌球蛋白中,研究肌球蛋白膠凝過程中鈣賦存形態(tài)和表面元素的變化,進(jìn)一步采用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察肌球蛋白凝膠的微觀形貌,結(jié)合低場(chǎng)核磁分析肌球蛋白樣品水分分布狀況,探討NFB在肌球蛋白膠凝過程中鈣的賦存形態(tài)變化與分布,為探討NFB提升魚糜凝膠性能的作用機(jī)理提供數(shù)據(jù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鰱(Hyophthalmichthys molitrix),每尾質(zhì)量約1.5 kg,購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場(chǎng)。將鮮活鰱魚置于盛滿水的塑料袋中迅速運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室,去頭、去內(nèi)臟后分別取背脊部肉和魚骨用于提取肌球蛋白和制備NFB,其他樣品置于4 ℃冰箱存放。

    茜素紅染液(分析純) 武漢谷歌生物技術(shù)有限公司;考馬斯亮藍(lán)R-250(分析純) 美國(guó)Amresco公司;氯化鑭及其余試劑均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    AA-6300c原子吸收分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司;Nikon Eclipase CI光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司;X-Max 50能量光譜儀 英國(guó)Oxford公司;Minispec核磁共振分析儀 德國(guó)Bruker公司。

    1.3 方法

    1.3.1 肌球蛋白的提取

    參考高霞等的方法提取肌球蛋白,純化的肌球蛋白用含有NaCl的Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液溶解,使其鹽離子濃度為0.5 mol/L。采用Lowry法測(cè)定肌球蛋白質(zhì)量濃度。

    1.3.2 NFB的制備

    參考Yin Tao等的方法,并稍作修改。將魚脊骨切成長(zhǎng)約3~5 mm的小段,加水漂洗除去血污和部分脂肪。然后,加入3 倍體積水將魚骨浸沒,在120 ℃(反壓蒸煮)下蒸煮1 h,去掉水煮液以脫除油脂,加清水漂洗數(shù)次瀝干。瀝干的魚骨用篩板孔徑為3 mm的絞肉機(jī)進(jìn)行粗破碎,之后加入1 倍體積冰水,用骨泥機(jī)細(xì)磨進(jìn)行微?;幚恚瑮l件為:磨盤轉(zhuǎn)速3 000 r/min,磨盤間隙0.3 mm,研磨次數(shù)2 次。進(jìn)一步將得到的魚骨加去離子水制備成5%的骨液,并用濕法高能球磨機(jī)進(jìn)行球磨。球磨條件為磨盤轉(zhuǎn)速3 000 r/min,磨球填充率85%,磨球直徑0.5 mm,球磨時(shí)間6 h,得到的樣品即為NFB(粒徑~280 nm)。樣品中的總鈣含量參考GB 5009.92—2016《食品中鈣的測(cè)定》方法測(cè)定。

    1.3.3 不同加熱方式肌球蛋白樣品的制備

    研究NFB對(duì)肌球蛋白膠凝過程中原子吸收光譜的影響時(shí),用0.5 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)將肌球蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為1.0 mg/mL,將NFB加入肌球蛋白中至總鈣濃度為40 mmol/L,同時(shí)控制整體的鹽離子濃度為0.5 mol/L。制備好的肌球蛋白樣品立即進(jìn)行加熱處理,加熱條件分別為:不加熱、一段式加熱(在40 ℃加熱60 min,記為S)、二段式加熱(先在40 ℃加熱60 min,再迅速轉(zhuǎn)移至90 ℃加熱30 min,記為S+K)。結(jié)束后,將肌球蛋白樣品用流動(dòng)水冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱保存待用,30 min內(nèi)立即進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)量。

    1.3.4 鈣賦存形態(tài)測(cè)定

    參考邢尚軍等的方法測(cè)定。取肌球蛋白凝膠樣品5 g,加入8 倍體積去離子水,均質(zhì),37 ℃恒溫水浴振蕩60 min,8 000 r/min離心10 min,保留沉淀,傾出上清液,將其定容至100 mL,用原子吸收法測(cè)定提取液中的鈣含量(A)。取30 mL 0.5 mol/L NaCl溶液加入上一步驟保留的沉淀中,均質(zhì),37 ℃恒溫水浴振蕩60 min,8 000 r/min離心10 min,保留上清液并將其定容至100 mL,用原子吸收法測(cè)定提取液中的鈣含量(B)。樣品中總鈣含量(C)的測(cè)定參考GB 5009.92—2016《食品中鈣的測(cè)定》。離子鈣的含量=A-B;螯合鈣的含量=B;不溶性鈣的含量=C-A。

    1.3.5 表面元素測(cè)定

    參考Grehn等的方法,使用能量光譜儀測(cè)定肌球蛋白凝膠的表面元素。樣品的處理步驟同掃描電鏡樣品。將干燥后的肌球蛋白凝膠粘于樣品臺(tái),設(shè)置加速電壓為15 kV進(jìn)行面掃描,獲得樣品表面元素組成及鈣離子分布圖像。

    1.3.6 光學(xué)顯微鏡分析

    將肌球蛋白凝膠進(jìn)行冷凍切片處理,使用考馬斯亮藍(lán)R-250染色5 min,結(jié)束后用蒸餾水沖洗除去多余的染液,晾干。再用茜素紅染液進(jìn)行復(fù)染5 min,結(jié)束后用蒸餾水沖洗,并于烘箱中烘干。將切片置于二甲苯溶液中浸泡5 min,取出晾干,并用中性樹脂封片。采用Nikon Eclipse CI光學(xué)顯微鏡觀察肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu),放大倍數(shù)為200 倍。

    1.3.7 激光共聚焦顯微鏡分析

    參考高霞等的方法,采用激光共聚焦顯微鏡觀察NFB添加前后肌球蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu),并稍作修改。將肌球蛋白凝膠進(jìn)行冷凍切片處理,使用羅丹明B染料(濃度為10mol/L)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記,待測(cè)。

    1.3.8 水分分布測(cè)定

    參考Zhang Huimin等的方法測(cè)定肌球蛋白凝膠的低場(chǎng)核磁自旋-自旋弛豫時(shí)間。取5 g樣品用核磁膜包裹后放入10 mm核磁管中,隨后放入分析儀中。自旋-自旋弛豫時(shí)間T用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill(CPMG)序列進(jìn)行測(cè)量,參數(shù)設(shè)置為:掃描次數(shù)8 次,掃描迭代6 500 ms,回聲1 200,τ值(90°脈沖和180°脈沖之間的時(shí)間)為10 ms。用儀器自帶軟件分析T弛豫時(shí)間。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 NFB-Ca在肌球蛋白膠凝過程中賦存形態(tài)的變化

    NFB中,鈣主要存在于羥基磷灰石與膠原交錯(cuò)互穿的結(jié)構(gòu)中,大部分以不溶性鈣形態(tài)存在。如表1所示,將NFB加入肌球蛋白后,樣品中離子鈣的含量在未加熱條件下僅占1.65%,40 ℃加熱處理顯著提高離子鈣含量(P<0.05),隨后于90 ℃加熱又使部分離子鈣轉(zhuǎn)變成為另外2 種形態(tài)的鈣。螯合鈣含量變化與離子鈣呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。此外,前期實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),NFB中可溶性鈣的含量約為8.88%~14.02%,本實(shí)驗(yàn)中添加NFB的肌球蛋白凝膠中可溶性鈣(離子鈣+螯合鈣)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于8.88%,不溶性鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,推測(cè)NFB中部分可溶性鈣以鹽橋方式參與凝膠形成轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄遭}。Jiang Yang等已證實(shí)加熱會(huì)顯著提高NFB中可溶性鈣的含量。然而,本研究表明與未加熱條件相比,一段式加熱和二段式加熱處理顯著提高了添加NFB的肌球蛋白凝膠中不溶性鈣的含量(P<0.05)。該結(jié)果說明,肌球蛋白膠凝過程中,NFB釋放出的可溶性鈣部分轉(zhuǎn)變成不可溶性鈣。前期研究發(fā)現(xiàn),熱膠凝過程中,肌球蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)變得伸展,并暴露出帶電基團(tuán)(COO),Ca與帶電基團(tuán)(COO)之間形成鹽橋,推測(cè)該鈣橋的形成使Ca被包埋在肌球蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)中,致使不溶性鈣含量增多。

    表1 NFB-Ca在肌球蛋白膠凝過程中賦存形態(tài)的變化Table 1 Changes in occurrence form of NFB-Ca during myosin gelation

    2.2 NFB對(duì)肌球蛋白表面元素的影響

    如表2所示,未加熱條件下,NFB中礦物元素含量最多的是Ca(8.29±0.10)keV和P(5.25±0.25)keV,Na和Mg的含量相對(duì)較低。魚骨的無機(jī)相主要由磷酸氫鈣(CaHPO)和羥基磷灰石(Ca(PO)(OH))構(gòu)成,這解釋了NFB中Ca、P含量較高的原因。一段式加熱和二段式加熱處理顯著提高了NFB表面Ca、P含量(P<0.05),推測(cè)這是由于加熱處理破壞了NFB的晶體結(jié)構(gòu),促進(jìn)了Ca、P向表面遷移。加熱過程中,NFB中的Ca/P無顯著變化(P>0.05)。

    加熱前,相較于肌球蛋白組,添加NFB的肌球蛋白樣品組中Ca含量顯著升高(P<0.05)。40 ℃加熱后,添加NFB的肌球蛋白表面鈣元素較未加熱條件下增長(zhǎng)了約51%,隨后于90 ℃加熱其表面鈣元素進(jìn)一步增多,與未加熱相比提高了約85%。然而,加熱過程中未添加NFB的肌球蛋白樣品表面鈣元素?zé)o顯著變化(P>0.05)。該結(jié)果說明肌球蛋白膠凝過程中表面鈣元素的增加主要來源于NFB的添加,且進(jìn)一步反映加熱可促進(jìn)NFB中Ca的釋放。

    表2 NFB的添加對(duì)肌球蛋白表面元素的影響Table 2 Effect of NFB on surface elements of myosin keV

    能譜結(jié)合電鏡分析是一種監(jiān)測(cè)樣品中元素分布的有效手段。如圖1所示,綠色圓點(diǎn)表示分布在肌球蛋白表面的鈣元素。所有樣品中均存在鈣元素。未加熱時(shí),鈣元素較少且分布不均勻,一段式加熱和二段式加熱處理后,肌球蛋白表面鈣元素逐漸增多,分布的均勻性也有所提升,在加熱過程中,NFB晶體結(jié)構(gòu)被破壞,釋放出部分鈣,膠凝時(shí)肌球蛋白與鈣形成鹽橋,形成了較為均一的凝膠結(jié)構(gòu),使表面鈣元素分布得更加均勻。

    圖1 添加NFB的肌球蛋白在膠凝過程中表面鈣元素的分布狀況Fig. 1 Calcium distribution on the surface of myosin with the addition of NFB during gelation

    2.3 光學(xué)顯微鏡分析

    茜素紅可將鈣鹽染成玫紅色,而考馬斯亮藍(lán)可將蛋白質(zhì)染成亮藍(lán)色,茜素紅與考馬斯亮藍(lán)雙染能夠較好地表征熱膠凝時(shí)肌球蛋白樣品中鈣鹽的分布與凝膠的結(jié)構(gòu)變化。如圖2所示,空白組中(未加NFB),樣品均被染成亮藍(lán)色,未觀察到玫紅色,說明空白組中Ca含量較少;NFB加入后,樣品中均觀察到玫紅色,表明樣品中Ca含量明顯增多,這與表面元素的結(jié)果(表2)一致。

    未加熱條件下,空白組與NFB組中肌球蛋白均以粗絲形式存在。40 ℃加熱處理后,肌球蛋白樣品形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),但是孔隙較大。相較于空白組,NFB組中的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為連續(xù),二段式加熱處理后,NFB組形成了更為致密的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Jia Dan等研究發(fā)現(xiàn),Ca會(huì)誘導(dǎo)肌球蛋白的雙螺旋結(jié)構(gòu)變得伸展,在凝膠化及魚糕化過程中伸展的肌球蛋白進(jìn)一步通過疏水相互作用和二硫鍵發(fā)生聚集,形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

    圖2 經(jīng)染色后的肌球蛋白樣品的光學(xué)顯微鏡圖Fig. 2 Optical microscopic images of stained myosin samples

    2.4 CLSM結(jié)果

    如圖3所示,未加熱條件下,相較于空白組,NFB組中肌球蛋白粗絲排列更為有序,粗絲間隙變小。本研究中蛋白體系pH值為7.5,高于pI 5.5,此時(shí),肌球蛋白帶凈負(fù)電荷,根據(jù)Arfat等報(bào)道,推測(cè)NFB釋放的Ca與肌球蛋白所帶負(fù)電荷形成鹽橋,促進(jìn)了肌球蛋白粗絲之間發(fā)生交聯(lián),使粗絲間隙減小。一段式加熱和二段式加熱處理后,相較于空白組,NFB組凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為均勻,粗糙程度有所改善。加熱過程中,Ca誘導(dǎo)肌球蛋白構(gòu)象改變,同時(shí)暴露疏水性氨基酸殘基、巰基等功能性基團(tuán),這有利于蛋白質(zhì)之間通過疏水相互作用、二硫鍵形成聚集體,進(jìn)而形成均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

    圖3 NFB加入后肌球蛋白在不同加熱方式下的激光共聚焦圖像Fig. 3 CLSM images of myosin with the addition of NFB during gelation

    2.5 NFB對(duì)肌球蛋白水分分布的影響

    低場(chǎng)核磁技術(shù)是一種安全、非破壞性的檢測(cè)手段,被廣泛地用來監(jiān)測(cè)食品中水分的分布與流動(dòng)性。如圖4所示,肌球蛋白膠凝過程中存在2 個(gè)水分分布峰,分別位于65.79~403.7 ms和464.16~1 873.82 ms附近。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,這2 個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)不易流動(dòng)水(T)和自由水(T)。表3為膠凝過程中肌球蛋白T弛豫時(shí)間的變化??瞻捉M中,隨著加熱的進(jìn)行,T向低弛豫時(shí)間移動(dòng),表明水分子的流動(dòng)性降低,推測(cè)這是由于加熱過程中形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖3)將水分子束縛其中。與空白組相比,加入NFB顯著降低了T弛豫時(shí)間(P<0.05),表明自由水的流動(dòng)性降低。根據(jù)Ahmad等報(bào)道,推測(cè)NFB釋放的Ca與熱處理使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化,暴露出水分子結(jié)合位點(diǎn),這有利于提高蛋白質(zhì)的水合作用,降低自由水流動(dòng)性;此外,加入NFB后形成更致密的微觀結(jié)構(gòu)(圖2、3)也有利于增強(qiáng)對(duì)水分子的束縛能力,降低水分子流動(dòng)性。

    圖4 NFB對(duì)肌球蛋白加熱過程中水分分布的影響Fig. 4 Effect of NFB on LF-NMR spetrum of myosin under different heating conditions

    表3 NFB對(duì)肌球蛋白T2弛豫時(shí)間的影響Table 3 Effect of NFB on T2 relaxation time of myosin

    3 結(jié) 論

    NFB中含有較多的Ca、P元素,加入肌球蛋白后,NFB-Ca仍以不溶性鈣形態(tài)為主(>95%),加熱處理促進(jìn)了Ca元素向表面遷移。隨著加熱的進(jìn)行,樣品中部分可溶性鈣以鹽橋方式參與形成肌球蛋白凝膠,促進(jìn)形成較為致密的凝膠結(jié)構(gòu),有利于增強(qiáng)對(duì)水分子的束縛,降低自由水的流動(dòng)性,同時(shí)提高了表面Ca元素的分布均勻性。綜上,肌球蛋白膠凝過程中NFB-Ca賦存形態(tài)發(fā)生改變,部分離子鈣通過參與形成鹽橋的形式轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄遭},促進(jìn)肌球蛋白形成均勻致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),增強(qiáng)了對(duì)水分子的束縛能力。

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