脯氨酰羥化酶對宰后牦牛肉糖酵解及肉品質的影響

胡 博，辛可啟，余群力,*，宋仁德，張新軍，石紅梅

（1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.青海省玉樹州畜牧獸醫(yī)工作站，青海 玉樹 815000；3.寧夏夏華肉食品有限公司，寧夏 中衛(wèi) 751700；4.甘肅省甘南州畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅 甘南 747000）

牦牛生活在海拔高度為3 000～5 000 m的高原地區(qū)，是一種能夠適應高原低氧嚴寒環(huán)境的珍惜畜種資源。牦牛肉具有高蛋白、低脂肪、氨基酸和礦物質含量豐富等優(yōu)點，得到越來越多消費者的青睞。但受到高海拔地區(qū)惡劣環(huán)境的影響，牦牛生長緩慢，存在肌肉發(fā)育遲緩、脂肪沉積效率差、嫩度差等問題，使牦牛肉行業(yè)的發(fā)展受到限制，故牦牛肉品質的調控就顯得尤為重要。

宰后成熟能顯著提高肉的嫩度、風味和整體接受度，是肉類品質提升的重要手段。動物屠宰放血后，肌肉供氧中斷，內環(huán)境處于缺氧狀態(tài)，肌肉細胞無法通過有氧呼吸滿足機體代謝的能量需求，只能通過糖酵解產生腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）為細胞供能。宰后糖酵解在肌肉細胞的細胞質中進行，糖原在缺氧條件下轉化為丙酮酸并生成少量ATP。糖酵解是影響肉品質的重要生化途徑，劣質肉的產生充分證明了這一點。劣質肉一般被分為兩類：一類肉色蒼白、質地松軟、表面滲水的被稱為PSE肉；另一類肉色較深、質地堅硬、外表干燥的被稱為DFD肉。劣質肉產生的主要原因是宰前應激導致的糖酵解速率異常，而劣質肉的產生每年給肉品工業(yè)帶來巨大的經濟損失，因此調控糖酵解對保證良好的肉品質具有重要意義。

糖酵解在宰后肌肉轉化成肉的過程中發(fā)揮著重要作用，其受到遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)等因素的影響。肌肉宰后最明顯的環(huán)境變化是缺氧，低氧誘導因子-1是適應氧變化機制中的核心分子，脯氨酰羥化酶（prolylhydroxylase，PHD）是低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）降解的限速酶。在常氧環(huán)境下，HIF-1α的402和564位脯氨酸殘基會被PHD羥基化，E3連接酶林希氏蛋白（protein von hippel-lindau，pVHL）識別并結合羥基化的HIF-1α，進而募集泛素蛋白，最終進入26S蛋白酶體被降解。在缺氧細胞中，PHD通過調控HIF-1α的表達量進而影響糖酵解酶活性，介導糖酵解進程。而在宰后牦牛肉中PHD對HIF-1α及糖酵解酶是否具有相同的調控作用尚不明確，故探究PHD對宰后牦牛肉HIF-1α，糖酵解及肉品質的影響具有一定的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛樣本采自青海西寧，選擇發(fā)育正常，健康無病，平均年齡3～4 歲的牦牛5 頭。牦牛進廠后停食，休息24 h，宰前3 h禁水，屠宰過程嚴格按照DB63/T 1785—2020《牦牛屠宰技術規(guī)程》。牛屠宰放血后取其背最長肌，剔除肉樣表面的脂肪和結締組織，分割為100 g左右的肉塊。注射生理鹽水和二甲基乙二酰氨基乙酸（dimethyloxaloylglycine，DMOG），DMOG濃度為100 μmol/L，DMOG是可滲透細胞，競爭型的PHD抑制劑，它可以有效抑制細胞中羥脯氨酸的合成，進而抑制PHD的活性，以此與生理鹽水對照組做比，探究PHD的作用。注射質量體積比為1∶1。樣品注射后在4 ℃、風速3 m/s、相對濕度85%條件下成熟0、3、6、12、24、48、72、120、168 h后取樣，并測定相應指標。對于不便立即測定的指標，將肉樣貯存于-80 ℃待用。

DMOG 北京索萊寶科技有限公司；氯化鉀、氯化鎂、磷酸鉀、乙二胺四乙酸 天津市致遠化學試劑有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 武漢賽維爾生物科技有限公司；肝/肌糖原試劑盒、乳酸試劑盒、己糖激酶（hexokinase，HK）試劑盒、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）試劑盒、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

FA2004B電子天平 上海佑科有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀儀器有限公司；FJ200-SH分散均質機 上海滬析實業(yè)有限公司；DW-86L416G超低溫冰箱 青島海爾生物醫(yī)療有限公司；SP-756P紫外-可見分光光度計 上海光譜有限公司；Testo 205便攜式pH計 杭州德圖儀表有限公司；CR-410色彩色差計日本Konica Minolta公司；BV-2電泳儀 武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 剪切力的測定

參照NY/T 1180—2006《肉嫩度的測定 剪切力測定法》測定。

1.3.2 肉色的測定

先將色度儀預熱30 min后用白板校準，然后在肉樣表面隨機選取3 個不同的點測定L*值和a*值。

1.3.3 蘇木精-伊紅（hemotoxylin and eosin staining，HE）染色

參考Zhang Jiaying等的方法，將肉樣浸沒在含有10%福爾馬林的磷酸緩沖液中進行固定，組織切片經HE染色處理后在光學顯微鏡下拍照。用Image-Pro Plus 6.0對圖像進行分析，每幅圖隨機選取30 個肌細胞，測算肌纖維面積，直徑及間距。

1.3.4 pH值的測定

pH計使用前用標準溶液校準，每塊肉樣隨機選取3 個部位，將便攜式pH計探頭插入肉樣中，待顯示屏上“AUTO HOLD”字樣停止閃爍后記錄讀數(shù)。

1.3.5 糖原、乳酸含量及HK、PFK、PK活性的測定

糖原、乳酸含量及HK、PFK、PK活性的測定均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒，實驗方法按各試劑盒說明書進行。

1.3.6 免疫印跡

參考王婷的方法，稍作修改。取1 g肉樣剪碎，加入10 倍體積的裂解液，冰浴勻漿（10 000 r/min，30 s）多次，置于冰上裂解30 min。將裂解后的勻漿液離心（12 000 r/min，4 ℃，10 min），取上清，BCA法測定蛋白濃度。按照體積比4∶1在蛋白溶液中加入5×還原型上樣緩沖液，煮沸15 min。用12%分離膠和5%濃縮膠進行SDS-PAGE分析。使用300 mA恒定電流將凝膠中解析的蛋白質轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶封閉1 h后加入一抗（GAPDH∶GAPDH小鼠單克隆，1∶2 000；HIF-1α∶多克隆兔抗小鼠，1∶1 000），4 ℃孵育過夜。洗滌后加入二抗（山羊抗兔，1∶3 000）室溫孵育1 h。洗滌后使用E-Gel成像系統(tǒng)對印跡進行成像，并使用Alpha軟件進行條帶密度分析。

1.4 數(shù)據處理

上述各項指標至少重復3 次。采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據分析，Duncan多重檢驗對數(shù)據進行差異顯著性分析（P＜0.05），Origin 9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 牦牛肉成熟過程中HIF-1α表達量及糖酵解酶活性的變化

2.1.1 牦牛肉成熟過程中HIF-1α表達量的變化

圖1 HIF-1α免疫印跡及蛋白表達量Fig. 1 Western blot analysis of HIF-1α expression and protein expression analysis

前人研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α改善了動物機體對低氧環(huán)境的適應性，在低氧應答反應中起重要作用。由圖1可知，隨著成熟時間的延長，兩組的HIF-1α表達量均呈先上升后下降的趨勢，DMOG組在12 h達到最高，而對照組在72 h達到最高，DMOG組的HIF-1α表達量除24、48、72 h外均顯著高于對照組（P＜0.05）。朱宏的研究結果指出食管癌細胞株HIF-1α表達量隨缺氧時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，本研究結果與之存在相似規(guī)律。由于癌細胞和宰后肌肉細胞都處于缺氧環(huán)境中，宰后肌肉細胞隨成熟時間的延長缺氧程度加深，結合高永芳的研究推測HIF-1α表達水平隨成熟時間的變化可能由宰后肌肉缺氧程度的不同引起。PHD是HIF-1α降解的限速酶，當PHD活性被抑制時，其引起的HIF-1α脯氨酸殘基羥基化受到影響，導致HIF-1α無法進一步與pVHL結合發(fā)生降解，因此HIF-1α在細胞內積累，表達量升高?？傊琀IF-1α表達量隨成熟的變化與宰后肌肉缺氧程度有密切關系，同時PHD可引起HIF-1α脯氨酸殘基羥基化，促進HIF-1α降解，使其表達水平下降。

2.1.2 牦牛肉成熟過程中糖酵解酶活性的變化

圖2 宰后成熟過程中糖酵解酶活的變化Fig. 2 Changes in glycolytic enzyme activities during postmortem aging

HK、PFK、PK是糖酵解過程中的限速酶。HK催化葡萄糖進入糖酵解過程的第一步生化反應，使葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸；PFK催化6-磷酸果糖轉化為1,6-二磷酸果糖；PK參與糖酵解過程的最后一步反應，催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸和ATP，它們的活性可以影響宰后糖酵解的進程和速率。由圖2可知，隨著成熟時間的延長，HK、PFK、PK的活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。DMOG組與對照組相比，HK、PFK、PK的活性在3～120 h都顯著高于對照組（P＜0.05）。黨永明等的研究指出：在缺氧細胞中，HK和PFK的活性呈先上升后下降的趨勢，且缺氧組的HK和PFK活性均較對照組高，這與本研究結果存在相似規(guī)律。有多項研究證實HIF-1α的表達水平與HK、PFK、PK的活性存在顯著相關性，推測在宰后成熟過程中，HK、PFK、PK的活性變化可能與PHD引起的HIF-1α表達水平的差異相關。同時，Semenza等的研究指出HIF-1可與編碼HK、PFK、PK基因啟動子區(qū)域的缺氧反應元件共識序列（5’-（A/G）CGTG-3’）結合，促進它們的表達。鑒于PHD在HIF-1α表達中的作用，PHD可能通過HIF-1α調節(jié)HK、PFK、PK的活性。

2.2 牦牛肉成熟過程中糖酵解指標的變化

2.2.1 牦牛肉成熟過程中糖原、乳酸含量的變化

圖3 宰后成熟過程中糖原（a）和乳酸（b）含量變化Fig. 3 Changes in contents of glycogen (a) and lactate (b) during postmortem aging

乳酸是糖酵解途徑的終產物，乳酸的積累會引起肌肉內環(huán)境的變化。由圖3可知，隨著成熟時間的延長，糖原含量逐漸降低，而乳酸含量在72 h前呈上升趨勢，72 h后下降。DMOG組的糖原含量顯著低于對照組（P＜0.05），而乳酸含量顯著高于對照組（P＜0.05），同時DMOG組和對照組0～168 h糖原含量分別降低了52.99%和50.57%，0～72 h乳酸含量分別上升了84.03%和68.14%。糖原和乳酸含量隨成熟時間的變化趨勢與楊雅媛等的研究結果存在相似規(guī)律。宰后肌肉處于缺氧環(huán)境，缺氧會使細胞內HIF-1α的表達量升高，糖酵解增強，糖原更快速地被消耗而乳酸得到積累，含量上升。結合糖酵解酶的研究結果推測：PHD通過HIF-1α調節(jié)糖酵解酶活性介導糖酵解途徑，影響糖酵解速率，糖原的消耗量和乳酸的生成量隨之發(fā)生變化。

表1 宰后成熟過程中肌纖維直徑、間隙及面積Table 1 Changes in gap between muscle fibers and muscle fiber diameter and area during postmortem aging

2.2.2 牦牛肉成熟過程中pH值的變化

圖4 宰后成熟過程中pH值的變化Fig. 4 Changes in pH during postmortem aging

pH值影響宰后肌肉多項食用品質的形成，如嫩度、肉色、風味等。由圖4可知，DMOG組和對照組的pH值隨著成熟時間的延長均呈先減小后增大的趨勢，在3～72 h時，DMOG組的pH值始終顯著低于對照組（P＜0.05）。前期pH值的下降可能是由糖酵解產物乳酸的積累引起的。后期由于糖酵解供能效果較差，細胞內的ATP含量逐漸下降，Ca從肌質網釋放到肌漿中，從而導致鈣激活酶活化，分解肌間蛋白，產生的堿性物質使得pH值上升。由于PHD/HIF-1α通路對宰后肌肉糖酵解進程有加速作用，乳酸的生成量增加，致使pH值降低，從而產生了DMOG組和對照組pH值變化的差異。結果表明，抑制PHD會使HIF-1α表達水平上升，加速糖酵解進程，進而使乳酸的生成量更高，pH值更低。

2.3 牦牛肉成熟過程中肉品質的變化

2.3.1 牦牛肉成熟過程中肌纖維直徑、間隙和面積的變化

圖5 不同成熟時間的HE染色（×200）Fig. 5 Results of HE staining at different time points during postmortem aging (× 200)

肌纖維直徑，間隙和面積可以反映肌原纖維結構的完整性，是評估肉嫩度的重要指標。由圖5和表1可知，肌纖維直徑和面積隨著成熟時間的延長不斷減小，DMOG組的肌纖維直徑和面積始終大于對照組，但在0～120 h差異不顯著；肌纖維間隙隨著成熟時間的延長不斷增加，DMOG組的肌纖維間隙小于對照組，在72、120 h差異顯著（P＜0.05）。這與王莉等對宰后牦牛肉肌纖維直徑、間隙、面積的測定結果具有相似規(guī)律。在宰后成熟過程中，肌動蛋白和肌球蛋白之間的連接蛋白逐漸降解，肌纖維完整的結構被破壞，使原本完整的肌原纖維斷裂成不同肌節(jié)數(shù)目的碎片。碎片化的肌纖維直徑和面積不斷減小，間隙變大，使得肌肉的嫩度得到改善。Xiong Guoyuan等也指出肌原纖維小片化指數(shù)越大，肌纖維結構完整性越差，肌肉嫩度越好。DMOG組的肌纖維直徑，面積都大于對照組，肌纖維間隙小于對照組，但其差異不顯著，說明PHD/HIF-1α通路對牦牛肉宰后成熟過程中肌纖維特性變化的影響有限。

2.3.2 牦牛肉成熟過程中剪切力的變化

圖6 宰后成熟過程中剪切力的變化Fig. 6 Changes in shear force during postmortem aging

剪切力是直接反映嫩度變化的指標。由圖6可知，隨著成熟時間的延長，2 個組的剪切力呈先上升后下降的趨勢，而DMOG組的剪切力在3～72 h顯著高于對照組（P＜0.05）。在宰后成熟早期，肌肉處于高pH值環(huán)境下，肌漿網內的Ca不斷積累，激活肌動球蛋白ATP酶，從而使肌肉發(fā)生痙攣，肌纖維迅速收縮，最終致使嫩度變差。在成熟后期，由于一系列內源蛋白酶的作用，導致肌纖維的結構被破壞，剪切力下降。而在成熟過程中處理組的剪切力始終高于對照組可能是由于pH值的差異引起的。劉佳東的研究指出：牦牛肉的剪切力與pH值呈顯著相關（P＜0.05），同時極限pH值越低，越接近肌球蛋白和肌動蛋白的等電點，肉的嫩度越差。綜上，PHD/HIF-1α通路通過對pH值的調控進而對牦牛肉宰后嫩度的形成產生影響。

2.3.3 牦牛肉成熟過程中肉色的變化

肉的顏色對消費者判斷肉的新鮮程度具有重要意義，通常肉表面的褐變被認為是肉品質的劣變。由圖7可知，隨著成熟時間的延長，L*、a*值都呈先升高后降低的趨勢，但L*值于72 h達到最高值，a*值于48 h達到最高值，DMOG組的L*值在6～168 h顯著高于對照組（P＜0.05），a*值始終顯著高于對照組（P＜0.05）。Farouk等發(fā)現(xiàn)宰后肌肉pH值的變化能夠引起肌原纖維蛋白的變性以及蛋白網絡空間結構的改變。pH值下降，自由水滲出增加，增強了光的反射能力，使L*值增大。在本研究中，由于PHD/HIF-1α通路引起pH值的變化，使之在0～72 h不斷下降，從而引起L*值上升。肌肉的a*值取決于肌紅蛋白的含量及氧化狀態(tài)。宰后初期a*值的升高可能是由于線粒體的呼吸作用產生NADH，NADH增加了肌肉中還原酶的活力，導致a*值上升；隨著宰后成熟的進行，肌肉內部的氧分壓不斷下降，肌紅蛋白更傾向于轉化為褐色的高鐵肌紅蛋白，a*值隨之下降。高永芳的研究指出高海拔牦牛肌肉內的肌紅蛋白含量要高于低海拔牦牛和肉牛，這同時也是牦牛高海拔低氧適應性的體現(xiàn)?？傊?，PHD/HIF-1α通路介導糖酵解途徑引起pH值的變化，進而使L*值增大，而其對a*值的影響可能與肌紅蛋白含量有關，其作用機理需要進一步探究。

圖7 宰后成熟過程中肉色的變化Fig. 7 Changes in color parameters during postmortem aging

3 結 論

在牦牛肉宰后成熟期間，隨著成熟時間的延長，HIF-1α表達量、HK、PFK、PK活性、乳酸含量、L*值、a*值、剪切力均呈先上升后下降的趨勢；糖原含量、肌纖維直徑和面積均呈不斷下降的趨勢；pH值呈先降后升的趨勢；肌纖維間隙呈不斷上升的趨勢。抑制PHD使HIF-1α表達量顯著升高（P＜0.05），PHD通過HIF-1α顯著上調了糖酵解關鍵酶活性，加快了糖原的消耗速率，乳酸的積累速率和pH值下降速率（P＜0.05）。同時，DMOG組的L*值、a*值、剪切力顯著高于對照組（P＜0.05）。通過對PHD的調控，得到其調節(jié)肉品質的機理可能是：PHD通過HIF-1α上調糖酵解酶活性，加速糖酵解進程，引起肌肉內環(huán)境的變化，使肌肉嫩度變差，但肉色得到一定的改善。綜上，PHD/HIF-1α及其級聯(lián)調控對改善牦牛肉品質具有重要作用，本研究進一步完善了宰后成熟的機理，為宰后肉品質的改善提供了新思路。