11株鮭源嗜冷黃桿菌藥物敏感性分析

劉媛媛，宋 健，樊 丹，王 荻，鄧福容，李紹戊，劉 敏

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150038；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所/黑龍江省水生動(dòng)物病害與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070；3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海201306）

【研究意義】細(xì)菌性冷水?。╞acterial cold water disease，BCWD）是一種爆發(fā)頻繁、致死率較高的魚類細(xì)菌性疾病[1-2]，其病原為嗜冷黃桿菌（Flavobacterium psychrophilum）。該菌屬黃桿菌科（Flavobacteriaceae）黃桿菌屬（Flavobacterium），是一種呈全球性地理分布、宿主范圍廣泛的革蘭氏陰性菌，最適培養(yǎng)溫度為15～18 ℃[3-4]。嗜冷黃桿菌是鮭科魚類易感的重要病原菌之一，曾在美國五大湖鮭魚親魚、養(yǎng)殖虹鱒（Oncorhynchus mykiss）幼魚[5-6]和智利虹鱒、大西洋鮭（Salmo salar）和銀鮭（Oncorhynchus kisutch）養(yǎng)殖中造成大量感染和死亡[7]。Gómez 等[8]于2014 年對(duì)嗜冷黃桿菌的疫苗研發(fā)進(jìn)行了探索性研究，但迄今為止未見商品化的疫苗面世。在缺乏高效疫苗的情況下，化學(xué)藥物仍是該病防控的有效方法。但病害防控過程中，藥物的廣泛使用降低了嗜冷黃桿菌的藥物敏感性，并使其耐藥菌株產(chǎn)生的頻率升高[9-10]。因此，系統(tǒng)掌握嗜冷黃桿菌全球性藥敏特性變化趨勢及采取適當(dāng)?shù)闹委煵呗院途珳?zhǔn)用藥具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自21 世紀(jì)初開始，不同國家和地區(qū)的研究者們先后采用K-B 紙片[6,11]、瓊脂稀釋[12]和微量肉湯稀釋[13-14]等方法對(duì)嗜冷黃桿菌分離株藥物敏感性進(jìn)行了分析和研究。嗜冷黃桿菌的智利分離株對(duì)阿莫西林、氟苯尼考敏感，對(duì)惡喹酸等耐藥[16]；美國分離株中24%的菌株對(duì)土霉素耐藥，所有分離株對(duì)氟苯尼考等藥物敏感[17]；英國分離株對(duì)氟苯尼考等敏感，而對(duì)氟甲喹、恩諾沙星耐藥[12,18]。土耳其[15]、加拿大[19]、丹麥[20]、芬蘭[21]、日本[22]、西班牙[23]等國家臨床分離株的藥物敏感性也差異較大?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】我國對(duì)嗜冷黃桿菌病原學(xué)特性及防控方法的相關(guān)研究起步較晚，國內(nèi)現(xiàn)行嗜冷黃桿菌分離株的藥物敏感性的報(bào)道僅見本實(shí)驗(yàn)室前期柴靜茹等[2]及Li 等[24]對(duì)部分代表性嗜冷黃桿菌分離株的8 種藥物敏感性的分析報(bào)道。因此，系統(tǒng)全面的了解和掌握我國嗜冷黃桿菌現(xiàn)行分離株藥敏特性，對(duì)于BCWD 的精準(zhǔn)施藥和高效防控病害至關(guān)重要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了解我國鮭源嗜冷黃桿菌分離株的藥物敏感性，本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離保藏的11株鮭源嗜冷黃桿菌為研究對(duì)象，擬采用微量肉湯稀釋法檢測分離株對(duì)20種藥物的敏感性，進(jìn)而分析菌株藥物敏感性與分離地區(qū)、時(shí)間和宿主的關(guān)聯(lián)性，以期為我國養(yǎng)殖鮭鱒BCWD 的科學(xué)防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 試驗(yàn)用11株嗜冷黃桿菌分離自黑龍江省和吉林省的鮭鱒魚養(yǎng)殖場，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所水產(chǎn)病害與防治研究室鑒定保藏。采樣時(shí)間為2019年和2020年。細(xì)菌分離的宿主包括美洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fontinalis）、亞東鮭（Salmo truttaL.）和白點(diǎn)鮭（Salvelinus leucomaenis）（表1）。

表1 11株鮭源嗜冷黃桿菌分離株基本信息Tab.1 Information of 11 Flavobacterium psychrophilum isolates recovered from salmonids

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白胨和酵母提取物購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，MH肉湯培養(yǎng)基購自美國BD 公司；恩諾沙星（enrofloxacin，ENRO）、氟甲喹（flumequine，F(xiàn)LUQ）、惡喹酸（oxolinic Acid，OXO）、左氧氟沙星（levofloxacin，LVX）、鏈霉素（streptomycin，STR）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、阿米卡星（amikacin，AMI）、慶大霉素（gentamicin，GEN）、新霉素（neomycin，NEO）、四環(huán)素（tetracyclines，TET）、土霉素（oxytetracycline，OXY）、阿莫西林（amoxicillin，AMO）、氨芐西林（ampicillin，AMP）、甲氧芐啶（trimethoprim，TMP）、氯霉素（chloroamphenicol，CHL）、氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)FC）、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）、利福平（rifampin，RIF）、紅霉素（erythromycin，ERY）、呋喃唑酮（furazolidone，AOZ）等抗菌藥物均購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 采用胰蛋白酵母提取物（tryptone yeast extract salts，TYES）瓊脂平板培養(yǎng)嗜冷黃桿菌（TYES 培養(yǎng)基配方：0.4%胰蛋白胨、0.04%酵母提取物、0.05%七水硫酸鎂、0.05%無水氯化鈣，pH 7.2）[25]。從-80 ℃冰箱取出實(shí)驗(yàn)室保存的甘油凍存菌，用一次性接種環(huán)劃線于TYES 平板，18 ℃培養(yǎng)48～72 h 后挑取單菌落于TYES 液體培養(yǎng)基，18 ℃120 r/min 震搖48 h。隨后，將培養(yǎng)好的菌液用1∶7 稀釋的MH肉湯培養(yǎng)基稀釋至1×106CFU/mL備用。

1.2.2 最小抑菌濃度測定 按照CLSI 指南[26-27]中推薦的方法制備20 種抗菌藥物母液，進(jìn)而采用微量肉湯稀釋法測定喹諾酮類、氨基糖苷類等共計(jì)9 類20 種藥物對(duì)嗜冷黃桿菌分離株的最小抑菌濃度（Minimal inhibition concentration，MIC）。

首先在96孔板第2列到12列加入1∶7稀釋的MH肉湯100μL，然后將配制好的藥物母液用1∶7稀釋的MH 肉湯稀釋至合適濃度，分別加入到96 孔板第1 列中，每孔200μL。每種藥物從96 孔板第1 列2 倍倍比稀釋直至第11 列，并設(shè)置第11 列為不加菌液只加藥物的陰性對(duì)照，第12 列為不加藥物只加菌液的陽性對(duì)照；在第1～10和12列每孔分別加入100μL稀釋好的菌懸液。將96孔板置于18 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察并讀取MIC值。

1.2.3 MIC 值的判定及數(shù)據(jù)分析 MIC 值的判定參考CLSI 標(biāo)準(zhǔn)和Vliet 等[17]報(bào)道，并使用Excel 分析數(shù)據(jù)，利用分離株對(duì)20種藥物對(duì)應(yīng)的MIC分布用Origin 2021作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜冷黃桿菌MIC值分析

根據(jù)測得的MIC 結(jié)果，得到11 株嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度的百分比分布表，如表2 所示。喹諾酮類藥物對(duì)36.4%～54.5%的嗜冷黃桿菌分離株MIC 為≤0.125 μg/mL，其中FLUQ 和OXO 的部分MIC偏高，F(xiàn)LUQ 對(duì)36.4%、18%的菌株的MIC 分別為8 μg/mL、16 μg/mL；OXO 對(duì)27.3%、9%的菌株的MIC分別為8 μg/mL、16 μg/mL。氨基糖苷類藥物中，AMI 對(duì)72.7%的菌株的MIC≤0.125 μg/mL，GEN 對(duì)36.4%的菌株的MIC 為≤0.125μg/mL。有45.5%的菌株對(duì)STR 的敏感性較低，MIC 高達(dá)32μg/mL。四環(huán)素類藥物中，嗜冷黃桿菌對(duì)OXY 的敏感性比TET 高。OXY 對(duì)63.6%的菌株的MIC 為≤0.125 μg/mL。OXY 對(duì)分離株的MIC 均小于2 μg/mL，TET 的MIC 分布在0.5～8 μg/mL。β-內(nèi)酰胺類藥物中，AMP 對(duì)36.4%的菌株的MIC≤0.125 μg/mL?；前奉愃幬颰MP 的MIC 集中在8～16 μg/mL，TMP 對(duì)72.7%的菌株的MIC 為16 μg/mL。氯霉素藥物的MIC 大多集中在0.5～4μg/mL，有18%的菌株對(duì)CHL、TAP 兩種藥物的敏感性略偏低，集中在8～16μg/mL。利福平RIF 對(duì)90.9%的菌株MIC≤0.125μg/mL。大環(huán)內(nèi)酯類ERY的MIC分布在0.25～8μg/mL。呋喃類藥物AOZ的MIC均≤1μg/mL，且有45.4%的菌株MIC為1μg/mL。

表2 20種抗菌藥物對(duì)11株嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度分布百分比Tab.2 Percent distribution of minimum inhibitory concentrations of 11 F. psychrophilum strains to 20 antimicrobial agents

2.2 嗜冷黃桿菌藥物敏感性與宿主的關(guān)聯(lián)性分析

本試驗(yàn)對(duì)白點(diǎn)鮭源、美洲紅點(diǎn)鮭源和亞東鮭源嗜冷黃桿菌的藥物敏感性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，3種宿主來源菌株均對(duì)ENRO、GEN、RIF藥物敏感性較高，對(duì)STR、TMP藥物敏感性較低；白點(diǎn)鮭源、美洲紅點(diǎn)鮭源分離株對(duì)氯霉素類藥物藥物敏感性偏低；氟喹諾酮類藥物對(duì)亞東鮭源分離株的抑制效果較好，而對(duì)美洲紅點(diǎn)鮭源分離株抑制效果較差。

2.2.1 白點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌MIC 結(jié)果 根據(jù)測得的MIC 結(jié)果，構(gòu)建20 種藥物對(duì)3 株白點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度百分比分布，如表3 所示：3 株白點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌對(duì)ENRO、AMI、GEN、RIF、AOZ 的敏感性較高，對(duì)STR、NEO、TMP、CHL的藥物敏感性較低。

表3 20種抗菌藥物對(duì)3株白點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度分布百分比Tab.3 Minimum inhibitory concentration distribution of 3 F.psychrophilum strains recovered from Salvelinus leucomaenis with 20 antimicrobial agents

根據(jù)測得的MIC結(jié)果，構(gòu)建3株白點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌對(duì)20種藥物的最小抑菌濃度弦圖，如圖1所示：藥物對(duì)菌株的MIC 值大多分布在1～8μg/mL，且MIC 值為16～32μg/mL 的4 種藥物對(duì)嗜冷黃桿菌的抑制效果較弱，即CHL、TMP、NEO、STR。

圖1 20種藥物對(duì)3株白點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度弦圖Fig.1 Strogram of the minimum inhibitory concentrations of 3 Salvelinus pluvius Hilgendorf F.psychrophilum strains from 20 drugs

2.2.2 美洲紅點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌MIC 結(jié)果 根據(jù)測得的MIC 結(jié)果，構(gòu)建20 種藥物對(duì)6 株美洲紅點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度百分比分布，如表4 所示：6 株美洲紅點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌對(duì)ENRO、LVX、AMI、GEN、OXY、AMP、RIF、AOZ的敏感性較高，對(duì)FLUQ、OXO、STR、TMP、TAP的藥物敏感性較低。

表4 20種抗菌藥物對(duì)6株美洲紅點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度分布百分比Tab.4 Minimum inhibitory concentration distribution of 6 Salvelinus fontinalis Source F. psychrophilum strains with 20 antimicrobial agents

根據(jù)測得的MIC 結(jié)果，構(gòu)建20 種藥物對(duì)6 株美州紅點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度弦圖，如圖2 所示：藥物對(duì)菌株的MIC 值大多≤0.125μg/mL，其中MIC 值為1μg/mL 的菌株占比也較高。STR、TMP兩種藥物對(duì)嗜冷黃桿菌的抑制效果較弱，MIC值為16～32μg/mL。

圖2 20種藥物對(duì)6株美洲紅點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度弦圖Fig.2 Strogram of the minimum inhibitory concentrations of 6 Salvelinus fontinalis F.psychrophilum strains from 20 drugs

2.2.3 亞東鮭源嗜冷黃桿菌MIC 結(jié)果 根據(jù)測得的MIC 結(jié)果，構(gòu)建20 種藥物對(duì)2 株亞東鮭源嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度百分比分布，如表5 所示：對(duì)2 株亞東鮭源嗜冷黃桿菌ENRO、FLUQ、OXO、LVX、AMI、GEN、OXY、AMP、RIF 的藥物敏感性較高，對(duì)STR、TMP的藥物敏感性較低。

表5 20種抗菌藥物對(duì)2株美洲紅點(diǎn)鮭源嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度分布百分比Tab.5 Minimum inhibitory concentration distribution of 2 Salmo trutta L. F. psychrophilum strains with 20 antimicrobial agents

根據(jù)測得的MIC 結(jié)果，構(gòu)建20 種藥物對(duì)2 株亞東鮭源嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度弦圖，如圖3 所示：藥物對(duì)菌株的MIC 值大多≤0.125μg/mL，其中MIC值為0.5μg/mL、1μg/mL的菌株占比也較高。STR、TMP 兩種藥物對(duì)嗜冷黃桿菌的抑制效果較弱，MIC值為8～16μg/mL。

圖3 20種藥物對(duì)2株亞東鮭源嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度弦圖Fig.3 Strogram of the minimum inhibitory concentrations of 2 Salmo trutta L.F.psychrophilum strains from 20 drugs

2.3 嗜冷黃桿菌藥物敏感性與時(shí)空分布的關(guān)聯(lián)性分析

2.3.1 不同地區(qū)嗜冷黃桿菌MIC 結(jié)果 根據(jù)測得的MIC 結(jié)果，分別構(gòu)建分離自黑龍江省和吉林省的嗜冷黃桿菌對(duì)20種藥物的不同最小抑菌濃度豐度分布雷達(dá)（圖4）。

圖4 20種藥物對(duì)黑龍江省及吉林省嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度個(gè)數(shù)分布Fig.4 The distribution of minimum inhibitory concentrations of 20 drugs with 8 F.psychrophilum strains in Heilongjiang and Jilin Province

由圖4a 可見，黑龍江省嗜冷黃桿菌分離株對(duì)ENRO、FLUQ、OXO、LVX、AMI、OXY、AMP、RIF 8 種藥物的敏感性偏高，MIC 值多分布于小于0.125μg/mL 處；而TMP、STR 的敏感性則大部分偏低，MIC 分別為16μg/mL和32μg/mL。

由圖4b 可見，吉林省地區(qū)的嗜冷黃桿菌分離株對(duì)RIF 藥物敏感性偏高，大部分MIC≤0.125μg/mL；而FLUQ、GEN、NEO、TET、TAP 5 種藥物的敏感性則較低，為8 μg/mL；TMP、CHL 兩種藥物的MIC 為16 μg/mL；STR的MIC最高，為32μg/mL。

由圖4a和4b結(jié)果可見，兩地嗜冷黃桿菌分離株對(duì)TMP和STR的敏感性較低，MIC分別為16μg/mL和32μg/mL；而吉林省分離株對(duì)FLUQ、GEN、NEO、TET、TAP 及CHL 6 種藥物的敏感性也明顯低于黑龍江省分離株。

2.3.2 不同年份嗜冷黃桿菌MIC 結(jié)果 根據(jù)測得的MIC 結(jié)果，分別構(gòu)建20 種藥物對(duì)分離自2019 年和2020年的嗜冷黃桿菌的不同最小抑菌濃度豐度分布雷達(dá)（圖5）。

圖5 20種藥物對(duì)2019、2020年嗜冷黃桿菌的最小抑菌濃度個(gè)數(shù)分布Fig.5 The distribution of minimum inhibitory concentrations to 20 drugs of F.psychrophilum strains in 2019 and 2020

由圖5a 可見，2020 年嗜冷黃桿菌對(duì)ENRO、FLUQ、OXO、LVX、AMI、GEN、OXY、AMP、RIF 九種藥物的敏感性較高，大部分MIC≤0.125 μg/mL；而分離株對(duì)TMP、STR 的敏感性則大部分偏低，MIC 分別為16μg/mL 和32μg/mL。

由圖5b 可見，2019 年嗜冷黃桿菌對(duì)ENRO、AMI、OXY、RIF 四種藥物的敏感性較高，大部分MIC≤0.125 μg/mL；而FLUQ（50%分離株）、OXO 兩種藥物的敏感性則較低，MIC 為8 μg/mL；FLUQ（50%分離株）、TMP兩種藥物的MIC為16μg/mL；STR的MIC最高，為32μg/mL。

由圖5a和5b結(jié)果可見，近兩年嗜冷黃桿菌分離株均對(duì)TMP和STR的敏感性偏低，分別為16μg/mL和32μg/mL；而2019年分離株對(duì)FLUQ及OXO兩種藥物的敏感性明顯低于黑龍江省分離株。

3 討 論

嗜冷黃桿菌感染可引發(fā)鮭鱒細(xì)菌性冷水病，給全世界的鮭鱒養(yǎng)殖造成重大損失[28-30]。本研究按照CLSI 執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[26]，選用MIC 值進(jìn)行區(qū)分和比較分析9 大類20 種水產(chǎn)藥物對(duì)我國東北地區(qū)鮭源嗜冷黃桿菌分離株藥物敏感性，較前人采用MIC與MBC相結(jié)合的評(píng)估方法[31]獲得了更為理想的趨勢和數(shù)據(jù)，也篩選出了受試菌株的敏感性藥物。CLSI給出了以參考菌株大腸桿菌（Escherichia coli）（ATCC25922）和殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）（ATCC33658）為代表的8 種藥物閾值標(biāo)準(zhǔn)[26]。從而掌握我國現(xiàn)行嗜冷黃桿菌分離株藥敏特性及其變化趨勢，同時(shí)也為完善多種藥物閾值標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

本研究中分別有81.9%和100%的菌株對(duì)STR 和TMP 藥物敏感性較低；而有90.9%和100%的菌株對(duì)RIF、ENRO 和AOZ 藥物敏感性偏高；不同地區(qū)分離株對(duì)FLUQ、GEN、NEO、TET、CHL 的敏感性差別較大。說明東北地區(qū)鮭源嗜冷黃桿菌分離株對(duì)鏈霉素和甲氧芐啶的藥物敏感性下降趨勢較嚴(yán)峻，同時(shí)多種藥物也顯示出不同程度的敏感性下降，亟需科學(xué)施藥。

3.1 β-內(nèi)酰胺類抗生素——阿莫西林

在智利[16]、丹麥[22]、英國[12]的分離株中，阿莫西林敏感性降低的分離株MIC 分布范圍分別為0.016～128μg/mL、0.5～4μg/mL和1～4μg/mL，菌株占比最大的MIC數(shù)值也不盡相同，分別為0.032，1，2 μg/mL，可以看出智利分離株對(duì)阿莫西林的藥物敏感性明顯高于英國和丹麥分離株。而在土耳其25 株嗜冷黃桿菌分離株的體外敏感性均未降低[32]。本研究結(jié)果表明，我國11 株鮭源嗜冷黃桿菌對(duì)阿莫西林的MIC 數(shù)值主要集中在1 μg/mL，和英國分離株藥物敏感性一致，高于智利分離株，而低于丹麥分離株。

3.2 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素——紅霉素

在歐洲、美國和土耳其等國家和地區(qū)，紅霉素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中是禁用的[22]，但在這些地方仍有嗜冷黃桿菌分離株對(duì)其藥物敏感性降低的現(xiàn)象。Smith等[11]和Ngo等[12]報(bào)告，來自英國和丹麥的所有分離株對(duì)紅霉素的藥物敏感性均有所降低，MIC數(shù)值分布范圍分別為0.5～4μg/mL和0.5～8μg/mL，MIC數(shù)值均主要集中在2μg/mL。在土耳其Saticioglu等[32]的報(bào)告中，有20%的菌株對(duì)紅霉素的藥物敏感性降低，而本試驗(yàn)中的嗜冷黃桿菌對(duì)紅霉素的MIC數(shù)值主要集中在0.25～2μg/mL，與英國、丹麥分離株的耐藥水平相近。

3.3 氯霉素類抗生素——氟苯尼考

在大多數(shù)國家，F(xiàn)FC 是治療嗜冷黃桿菌感染的首選藥物[32]，來自智利[16]、美國[17]、丹麥[11]、英國[12]共428株嗜冷黃桿菌分離株的研究中，僅有2 株來自智利[16]的分離株（＜0.5%）被報(bào)道為敏感性降低的菌株。而本研究中，嗜冷黃桿菌分離株的MIC 值較小，藥物敏感性均高于國外。中國嗜冷黃桿菌對(duì)氟苯尼考的MIC 值最高限低于國外4～8倍，但2020年也出現(xiàn)了敏感性降低趨勢，MIC 值為1μg/mL 的菌株數(shù)增多，這樣的結(jié)果可能與近年來FFC在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的高效廣泛使用有關(guān)。

3.4 喹諾酮類抗生素

除美國不允許在食用動(dòng)物中使用喹諾酮類藥物外，許多國家已使用喹諾酮類藥物治療嗜冷黃桿菌感染[17,22]。然而，隨著敏感性降低的菌株越來越多地出現(xiàn)，藥物防治效果大幅下降，導(dǎo)致近年來這類藥物的使用有所減少。在2016 年與2018 年Smith 等[11]和Ngo 等[12]報(bào)告來自英國和丹麥的菌株大多出現(xiàn)了藥物敏感性降低的現(xiàn)象，對(duì)FLUQ 的MIC 最高值均為4μg/mL。Miranda 等[16]研究顯示，智利的嗜冷黃桿菌對(duì)FLUQ 的MIC 最高值為0.5μg/mL。本研究中，黑龍江省嗜冷黃桿菌對(duì)ENRO、FLUQ、OXO、LVX 的MIC都主要集中在≤0.125μg/mL，但部分菌株對(duì)FLUQ 的MIC 最高值達(dá)到16μg/mL，藥物敏感性低于智利[16]、丹麥[11]、英國[12]；吉林省分離株的MIC值集中在2～8μg/mL，對(duì)喹諾酮類藥物均出現(xiàn)了較低藥物敏感性，且FLUQ 的藥物敏感性明顯低于其他3種藥物。值得注意的是，黑龍江省大部分分離株對(duì)OXO 的藥物敏感性較高，兩省份均出現(xiàn)了藥物敏感性降低的趨勢。

3.5 四環(huán)素類抗生素

四環(huán)素類藥物已廣泛應(yīng)用于人醫(yī)和獸藥，在畜牧業(yè)中用作生長促進(jìn)劑，在農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中用作防治藥物。由于藥物的不科學(xué)不合理使用，四環(huán)素藥物敏感性降低的現(xiàn)象幾乎已經(jīng)擴(kuò)散到所有的細(xì)菌種屬[13,32]，而OXY為嗜冷黃桿菌防治的常用藥物[34]。2016年，智利、英國和丹麥分別有70%和46%的嗜冷黃桿菌分離株對(duì)OXY 敏感性降低[16,22]；而2018 年英國又有報(bào)道指出58%的嗜冷黃桿菌的藥物敏感性升高[29]；2017年Van 等[17]研究來自美國某地的菌株，對(duì)OXY 的MIC 最高值為8μg/mL。Kum 等[6]發(fā)現(xiàn)土耳其分離的嗜冷黃桿菌對(duì)OXY 的藥物敏感性極低(75%)。本試驗(yàn)中我國東北地區(qū)臨床分離的嗜冷黃桿菌對(duì)OXY 的MIC 均小于2μg/mL，顯著低于智利[16]、丹麥[22]、美國[17]和土耳其[6]，與2018 年英國試驗(yàn)菌株MIC 最大值持平。

3.6 氨基糖苷類抗生素

嗜冷黃桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果較少，Kum 等[6]在土耳其采用平板擴(kuò)散法和瓊脂稀釋法均表明20 株嗜冷黃桿菌菌株對(duì)GEN 具有抗性（平板擴(kuò)散法：70%；瓊脂稀釋度：95%），2017 年Van Vliet 等[17]在美國密歇根州觀察到GEN 的MIC 值呈單峰分布，最常見的MIC 為0.12 μg/mL，大多分布在0.06～2 μg/mL。本試驗(yàn)中，63.5%的嗜冷黃桿菌分離株對(duì)GEN 的MIC 值分布在0.25～8μg/mL，最常見的MIC 為0.25μg/mL，低于美國分離株的藥物敏感性。黑龍江省62.5%的分離株的MIC 為0.25μg/mL，MIC最高值高達(dá)8μg/mL；吉林省33.3%的分離株的MIC 為≤0.125μg/mL 和8μg/mL，黑龍江省和吉林省分離株的藥物敏感性均低于美國。2019年有33.3%分離株對(duì)GEN的MIC≤0.125μg/mL，2020年42.9%分離株的MIC為0.25μg/mL，呈現(xiàn)逐年增長趨勢。

3.7 其他類抗生素

利福平在防治嗜冷黃桿菌的應(yīng)用較少，在本試驗(yàn)中，絕大多數(shù)分離株的MIC≤0.125μg/mL，但2019—2020年，分離株對(duì)RIF的MIC≤0.125μg/mL占比從100%降至85.7%，藥物敏感性有一定降低。

雖然呋喃唑酮已被列為水產(chǎn)禁用藥物，但由于前期病害防控或人類及動(dòng)物的藥物使用導(dǎo)致水體或土壤中有藥物殘留，因此試驗(yàn)中也將水產(chǎn)禁藥對(duì)嗜冷黃桿菌的MIC值進(jìn)行了比較分析，以確定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性是否發(fā)生變化。在本實(shí)驗(yàn)中100%的分離株MIC均已≤1μg/mL，2019—2020年AOZ的MIC為1μg/mL 的菌株占比由50%降至42.9%，藥物敏感性略有升高趨勢，也應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測檢測力度，確保水環(huán)境無污染及殘留。

磺胺類抗生素中，2018 年英國有36%的分離株對(duì)磺胺甲惡唑-甲氧芐啶較敏感[12]，而2008 年土耳其分離株則呈現(xiàn)100%耐藥[6]。本試驗(yàn)中，所有分離株對(duì)TMP 的MIC 均分布在8～16μg/mL，藥物敏感性介于英國和土耳其分離株之間，且不同來源分離株均出現(xiàn)了藥物敏感性降低的趨勢，可能與近年來藥物的廣泛使用有關(guān)，應(yīng)引起重視。

4 結(jié) 論

本研究表明我國東北地區(qū)臨床分離的鮭源嗜冷黃桿菌對(duì)呋喃唑酮（AOZ）、恩諾沙星（ENRO）和土霉素（OXY）較敏感，但由于呋喃唑酮、土霉素為水產(chǎn)禁用藥，故在鮭鱒魚養(yǎng)殖過程中建議選用恩諾沙星來防治嗜冷黃桿菌引起的細(xì)菌性冷水病。研究結(jié)果對(duì)于我國鮭魚養(yǎng)殖中BCWD的科學(xué)防控具有重要參考價(jià)值。

致謝：中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（HSY201902Q）和中國水產(chǎn)科學(xué)研究院冷水性魚類病害防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2020TD43）同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！