不同始溫浸種對圓齒野鴉椿休眠種子萌發(fā)特性的影響研究

陽先波，姜雪茹，吳慧平，冉 芳，涂淑萍，蔡軍火，張 隆

（江西農(nóng)業(yè)大學 園林與藝術學院，江西 南昌330045）

【研究意義】圓齒野鴉椿（Euscaphis konishii）屬省沽油科（Staphyleaceae）野鴉椿屬（Euscaphis）常綠小喬木，是中國南方特有的藥賞兩用珍貴鄉(xiāng)土樹種，其枝條、果皮等部位提取物具有較好的抗炎抑菌、抗癌作用[1-3]，其紅果吉祥喜慶，且掛果期長，經(jīng)冬不凋，具有極大的推廣應用價值。但是圓齒野鴉椿種子具有深休眠特性，發(fā)芽率低、出苗不整齊，是影響其苗木培育和規(guī)模化生產(chǎn)的主要原因。因此，從縮短催芽周期角度開展圓齒野鴉椿種子萌發(fā)特性相關研究對其種苗的高效繁育具有重要意義。【前人研究進展】以往對圓齒野鴉椿種子的研究表明，種胚發(fā)育不完全且種子內(nèi)含有發(fā)芽抑制物是導致其休眠的主要因素[4-6]。在種子采收后直接播種，至第二年春季發(fā)芽率仍為零。而在種子采收后濕沙自然層積約450 d后進行播種，發(fā)芽率可達到75%[7]，說明長時間的濕沙層積促進了種胚的發(fā)育和抑制物的減少。圓齒野鴉椿種胚發(fā)育存在不一致性[5]，在濕沙層積幾個月后，通過播種前對種子進行一定溫度的熱水浸種，能夠促進部分休眠種子萌發(fā)[8]，如張莉梅等[9]的研究發(fā)現(xiàn)采用濕沙4 ℃沙層積+60 ℃溫水浸泡（自然冷卻）對圓齒野鴉椿種子進行處理，僅用90～120 d 萌發(fā)率峰值可達48%，而歐斌等[10]將自然沙藏150～180 個月的圓齒野鴉椿種子用始溫65～68 ℃熱水浸種，可使萌發(fā)率達到51%～65%?！颈狙芯壳腥朦c】最佳浸種溫度可能與濕沙層積時間有一定的聯(lián)系。而在不同溫度熱水浸種處理下，圓齒野鴉椿種子的生活力、內(nèi)源發(fā)芽抑制物及內(nèi)含物質如何變化的還不得而知。【擬解決的關鍵問題】因此，本實驗研究了不同浸種溫度對濕沙層積120 d的圓齒野鴉椿種子發(fā)芽率和生活力的影響，比較不同浸種處理過程中種子內(nèi)含物的變化及對種子內(nèi)源發(fā)芽抑制物的影響，并將各項生理指標與萌發(fā)率和生活力進行相關性分析，探討熱水浸種處理下種子的生理變化機制，以期為縮短圓齒野鴉椿育苗周期和促進產(chǎn)業(yè)市場化發(fā)展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試種子來源于江西農(nóng)業(yè)大學花卉基地自然生長的14 年樹齡的圓齒野鴉椿母樹，采集時間為2020 年11 月初，自然沙藏層積120 d。于2021 年3 月初取出種子，經(jīng)0.3%高錳酸鉀溶液消毒和純水沖洗后[11]，采取5 種方式對種子進行預處理：常溫水浸泡24 h（CK）；始溫50 ℃水浸種，自然冷卻24 h（T1）；始溫60 ℃水浸種，自然冷卻24 h（T2）、始溫70 ℃水浸種，自然冷卻24 h（T3）；始溫80 ℃水浸種，自然冷卻24 h（T4）。

1.2 研究方法

1.2.1 種子萌發(fā)實驗 采用培養(yǎng)皿濾紙法進行萌發(fā)試驗[12]，人工氣候箱溫度為25 ℃，濕度55%，光周期為光12 h/暗12 h，當胚根伸長至2 mm 時，視為萌發(fā)。每個處理3 個重復，每個重復30 例種子，統(tǒng)計時間持續(xù)1 個月，1 個月后未萌發(fā)的視為不能發(fā)芽。期間及時清理污染發(fā)霉的種子并更換濾紙，并定時補充純水保持濾紙濕潤。發(fā)芽率（Germination Rate，GR/%）=（萌發(fā)種子數(shù)量/供試種子數(shù)量）×100%。

1.2.2 種子生活力測定 生活力測定采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑法（簡稱TTC法）將經(jīng)過預處理的種子去除外部硬種皮后縱向切開，采用0.3%TTC 溶液于25 ℃黑暗恒溫箱中孵育，15 h 后統(tǒng)計圓齒野鴉椿種胚著色情況[13-15]。每個處理3次重復，每個重復20粒種仁，以沸水處理的種仁為對照。

1.2.3 種子生理生化指標測定 分別取CK、T1、T2、T3處理過程中0，6，12，24 h的種子，去除外部堅硬種皮后，采樣進行相關生理指標測定，每個處理3個重復。考馬斯亮藍G-250法測定可溶性蛋白含量[16]，蒽酮比色法測定可溶性糖含量[17]，氮藍四唑光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[18]，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性[18]，紫外分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活性[19]。

1.2.4 圓齒野鴉椿種子浸提液的制備與使用 首先，制備質量濃度為0.2 g/mL 的圓齒野鴉椿種子浸提液：在20 mL 規(guī)格的玻璃試管中加入7 mL 純水，將試管放入50 ℃水浴鍋中，當試管中水溫達到50 ℃時，加入2 g 自然層積120 d 的圓齒野鴉椿種子，然后立即關閉水浴鍋，試管口用保鮮膜和皮筋封嚴，自然冷卻24 h 后抽取全部浸提液，定容至10 mL[20-21]，以上是50 ℃始溫熱水浸種（T1）提取液制備步驟。CK、T2（60 ℃）、T3（70 ℃）浸種提取液制備相同。采用以上浸提液浸泡白菜種子24 h，將浸泡后的白菜種子置于對應的浸提液潤濕的濾紙上，每個培養(yǎng)皿50 粒，每處理3 個重復，于溫度25 ℃、濕度55%，光周期為光8 h/暗16 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后統(tǒng)計白菜種子發(fā)芽率（以胚軸彎曲、胚根伸長≥4.0 mm作為萌發(fā)標準），用直尺測量白菜種子根長、莖長[13,22]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019 和Origin 2018 進行數(shù)據(jù)整理及繪圖。采用SPSS 22.0 進行ANOVA 分析（采用Duncans法進行多重比較）和Spearman相關性分析。

2 結果與分析

2.1 種子發(fā)芽率和生活力

5 種不同溫度浸種方式對種子發(fā)芽率和生活力的影響差異較大。與CK 相比，T1、T2 能顯著提高圓齒野鴉椿種子的發(fā)芽率，T1 的發(fā)芽率最高為43.33%±6.29%，T2 熱水浸種發(fā)芽率次之，為25.56%±3.63%，而T3、T4 熱水浸種發(fā)芽率則為0（圖1A）。為了明確不同溫度熱水浸泡引起的發(fā)芽率差異是否與種子活性有關，筆者測定了CK、T1、T2、T3 處理后的種子生活力，每個處理均以沸水滅活的種子為對照，結果發(fā)現(xiàn)，T1 與CK 浸種后圓齒野鴉椿種子生活力無顯著差異，均大于等于70.00%，而T2 浸種使生活力下降至58.33%±7.58%，T3 熱水浸種處理后種子已經(jīng)失去活性（圖1A，圖1B）。以上說明，始溫50 ℃熱水浸種在不損害種子生活力的基礎上還可顯著提高種子發(fā)芽率，而始溫70 ℃熱水浸種則會使種子失去活性。

圖1 不同始溫熱水浸種下圓齒野鴉椿種子萌發(fā)率和生活力差異Fig.1 Changes of Euscaphis konishii seeds germination rate and viability under seed soaking at different initial temperatures

2.2 種子生理指標

2.2.1 種子可溶性蛋白與可溶性糖含量變化 不同始溫浸種處理下，圓齒野鴉椿種子內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖含量隨時間的變化情況如圖2 所示。在浸種處理的12 h 內(nèi)，CK、T1、T2、T3 的可溶性蛋白含量無顯著性變化，在浸種處理的24 h 時，T3 的可溶性蛋白含量大幅度上升且顯著高于其余處理，而其余處理之間可溶性蛋白含量無顯著差異（圖2A）。在浸種處理的24 h內(nèi)，CK的可溶性糖含量呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，T1 的可溶性糖含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，T2、T3 的可溶性糖含量一直呈下降趨勢；在浸種處理的6 h時，CK 的可溶性糖含量顯著高于T2、T3，在12 h時T1的可溶性糖含量顯著高于其他處理，在24 h時CK的可溶性糖含量顯著高于T1，T1顯著高于T2、T3（圖2B）。

圖2 不同始溫浸種處理下圓齒野鴉椿種子可溶性糖和可溶性蛋白含量隨時間的變化情況Fig.2 The effects of different initial temperatures soaking water treatments on the soluble sugar and soluble protein content of Euscaphis konishii seeds

2.2.2 抗氧化酶活性變化 不同始溫浸種處理下，圓齒野鴉椿種子內(nèi)抗氧化酶活性隨時間的變化情況如圖3 所示。在浸種處理的6 h 時，T1 的CAT 活性顯著高于其他處理，T3 次之，CK 和T2 處理最低；在12 h 時，各個處理之間的CAT 活性沒有顯著性差異；在24 h 時，CK、T1 處理的CAT 活性顯著高于T2、T3，且在整個浸種過程中T2、T3 的CAT 活性一直低于初始值（0 h）（圖3 A）。與浸種前（0 h）相比，浸種處理6 h 時CK 的POD 活性顯著提高，而T3 的POD 活性大幅度下降；在浸種處理的12 h 時，T2 的POD 活性顯著高于其他處理；在浸種處理的24 h 時，CK 的POD 活性顯著高于其他處理，T1 次之，而T3 處理的POD 活性在整個浸種過程均較低（圖3B）。在浸種處理的6 h 時，T1 的SOD 活性最高，T3 的最低；在浸種處理的12 h 時，CK 的SOD 活性最高，同時T2、T3 活性與未浸種前相比也有了明顯地上升；在浸種處理的24 h 時，T1、T2 處理的SOD 活性顯著高于T3、T4；在整個過程中CK 和T1 一直保持較高的SOD 酶活性（圖3C）。

圖3 不同始溫浸種處理下圓齒野鴉椿種子內(nèi)抗氧化酶活性的變化Fig.3 The effects of different initial temperature soaking water treatments on antioxidant enzyme activities in Euscaphis konishii seeds

2.2.3 種子生理生化指標相關性分析 為了進一步探究熱水浸種過程中種子生理活動的啟動與萌發(fā)特性的關系，將每個浸種時間段內(nèi)種子的可溶性糖（SP）、可溶性蛋白（Pro）、抗氧化酶活性與種子最后的萌發(fā)率和種子活力進行了相關性分析。由表1可知，浸種處理6 h時的CAT 活性與種子的發(fā)芽率呈顯著正相關（P＜0.05），POD和SOD活性與種子的生活力呈極顯著正相關性（P＜0.01）；浸種處理12 h時的SP與種子發(fā)芽率呈顯著正相（P＜0.05）；浸種處理24 h 時的Pro 含量與種子生活力呈極顯著負相關（P＜0.01），而POD、SOD活性與種子生活力卻呈極顯著的正相關（P＜0.01）。

表1 不同浸種時間內(nèi)圓齒野鴉椿種子發(fā)芽率、生活力與生理指標的相關性分析Tab.1 Correlation analysis of germination rate，seed viability between physiological indexes in Euscaphis konishii seeds

2.3 內(nèi)含抑制物活性

與純水處理相比，經(jīng)始溫50 ℃（T1）、60 ℃（T2）和70 ℃（T3）熱水浸種液處理的白菜種子萌發(fā)率顯著降低，幼苗根長和莖長卻顯著增加；T1、T2、T3 浸種液處理之間的白菜種子萌發(fā)率和幼苗根長沒有顯著性差異，而幼苗莖長由高到低依次為T3，T2，T1，純水（圖4 A～C）。綜上，T1、T2、T3 浸種液處理顯著降低了白菜種子的萌發(fā)率，卻增加了白菜幼苗的根長和莖長，使得白菜根莖變得十分細長（圖4D）。

圖4 浸種液對白菜種子萌發(fā)的影響Fig.4 Effect of seed immersion solution on germination of cabbage seeds

3 討論與結論

3.1 熱水浸種對圓齒野鴉椿種子發(fā)芽率和生活力的影響

圓齒野鴉椿種子的休眠類型為形態(tài)-生理休眠[12]，即休眠原因為胚發(fā)育不完全和生理抑制機制強[23-24]。自然沙藏層積120 d 的種子，經(jīng)常溫水浸種24 h 后，萌發(fā)率幾乎為0，而50 ℃始溫熱水浸種后平均發(fā)芽率可達43.33%±6.29%，種子生活力也與常溫水浸種相近，可見50 ℃始熱水浸種可明顯提高圓齒野鴉椿種子的萌發(fā)率，且不會降低種子的整體生活力。當使用60 ℃始溫熱水進行浸種后，種子生活力開始受到損傷，發(fā)芽率也只有25.56%±3.63%，而采用70 ℃和80 ℃始溫熱水進行浸種的種子已完全失去生活力，所以在進行圓齒野鴉椿種子浸種時應注意嚴控溫度，最好不超過60 ℃。

在實驗中筆者觀察到，能夠發(fā)芽的種子絕大多數(shù)是浸種后露白的種子。鄒雙全[7]在圓齒野鴉椿種子自然層積第3 年露白10%時播種，發(fā)芽率可達75%，遠高于本實驗中50 ℃始溫熱水浸種處理的發(fā)芽率。推測原因可能是，層積120 d 的圓齒野鴉椿種子的種胚并沒有全部發(fā)育成熟，50 ℃始溫熱水浸種只能使部分發(fā)育完全的種胚吸水膨脹后露白進而萌發(fā)，而沒有萌發(fā)卻有生活力的那部分種子可能是由于層積時間過短、種胚未發(fā)育完全所致。

3.2 熱水浸種對圓齒野鴉椿種子內(nèi)源物質的影響

浸種過程中種子新陳代謝變得旺盛，消耗可溶性糖維持呼吸作用，種子內(nèi)可溶性糖含量隨著時間持續(xù)下降[25]，這與本實驗的研究相一致。Fatemeh 等[26]的研究顯示種子在經(jīng)歷外界脅迫時，會通過保持較高的蛋白質合成速率和較低的蛋白質降解速率，維持低滲透勢的穩(wěn)態(tài)，以抵御細胞膜受到的損害，這也可能是70 ℃始溫水浸泡24 h 時種子內(nèi)可溶性蛋白含量顯著高于其他處理的原因。50 ℃始溫熱水浸泡處理6 h 時，種子內(nèi)3 種抗氧化酶的活性均明顯升高，說明該處理在一定程度上減輕了活性氧自由基對細胞膜系統(tǒng)造成的傷害[27]，有利于種子萌發(fā)。而與其他處理相比，在70 ℃始溫熱水浸泡處理的24 h 內(nèi)，種子的抗氧化酶活性一直處于較低水平，其原因可能是過高的溫度處理破壞了抗氧化酶活性[28]。此外，由相關性分析結果可知，在浸種處理的6 h 時，CAT 活性與萌發(fā)率呈顯著正相關，12 h 時，可溶性糖含量與發(fā)芽率呈顯著的正相關，在24 h 時，可溶性蛋白含量與生活力呈極顯著的負相關，POD、SOD 活性與生活力呈正相關。以上說明，熱水浸種可觸發(fā)種子內(nèi)源物質轉換，為種子萌發(fā)做準備，并且CAT 可能是與圓齒野鴉椿種子萌發(fā)率密切相關的酶，而POD 和SOD 與圓齒野鴉椿種子的活力密切相關[29]。

3.3 熱水浸種對圓齒野鴉椿種子內(nèi)發(fā)芽抑制物的影響

圓齒野鴉椿種子休眠的主要原因是內(nèi)含發(fā)芽抑制物及種子具有胚后熟特性，即使在經(jīng)歷270 d的變溫層積后抑制物活性依舊比較強[4]。與常溫水浸種相比，不同始溫熱水浸種液均顯著降低了白菜種子的發(fā)芽率，這反向說明了熱水浸種處理可稀釋圓齒野鴉椿種子內(nèi)發(fā)芽抑制物質的濃度，進而降低內(nèi)源抑制物質對種子萌發(fā)的抑制作用[30]。而與大多數(shù)探究種子浸提取液抑制物實驗結果不同的是，本實驗中圓齒野鴉椿種子熱水浸泡液對白菜種子的根、莖都有顯著的促伸長作用，但是根莖與CK相比十分細長。

3.4 結論

圓齒野鴉椿種子具有深休眠特性，一般需自然層積450 d 萌發(fā)率可達75%。本研究發(fā)現(xiàn)，50 ℃始溫熱水浸種能夠使自然層積120 d 的圓齒野鴉椿種子萌發(fā)率達到43.33%±6.29%，而沒有萌發(fā)卻有生活力的那部分種子可能是由于層積時間過短、種胚未發(fā)育完全所致。熱水浸種可激發(fā)圓齒野鴉椿種子內(nèi)源物質轉換，降低內(nèi)源發(fā)芽抑制物濃度，CAT 可能是與圓齒野鴉椿種子萌發(fā)率密切相關的酶，而POD 和SOD 與圓齒野鴉椿種子的活力密切相關。圓齒野鴉椿種子可能存在種胚發(fā)育的不整齊性，有生活力但胚發(fā)育不完全的種子在適合的熱水浸種環(huán)境下仍無法解除休眠，具體原因及解除辦法還需要進一步探索。

致謝：江西省教育廳項目（GJJ200446）同時對本研究給予了資助，謹致謝意！