CYP1A1、TSLPR、CCR3在小兒特應(yīng)性皮炎中的表達(dá)及與臨床特征相關(guān)性研究

凌琬茗，劉 巖，谷紅霞，趙瑞雪，韓志敏

(河北省兒童醫(yī)院皮膚科，河北 石家莊 050031)

特應(yīng)性皮炎屬于一種慢性、炎癥性、瘙癢性疾病，多發(fā)于嬰幼兒期，且此病發(fā)病反復(fù)，多數(shù)患兒可持續(xù)至成年期，在臨床上又被稱為遺傳過(guò)敏性皮炎、異位性皮炎、特應(yīng)性濕疹、嬰兒濕疹等，目前此病表現(xiàn)為逐年升高的趨勢(shì)，且疾病遷延難愈、劇烈瘙癢在一定程度上影響患兒的正常生長(zhǎng)發(fā)育[1-2]。研究顯示，近年來(lái)我國(guó)小兒特應(yīng)性皮炎的發(fā)病率表現(xiàn)為逐年升高的趨勢(shì)，部分患兒在臨床治療中并未獲得滿意的效果，具有難以根治的特點(diǎn)，且目前對(duì)于小兒特應(yīng)性皮炎的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，導(dǎo)致患兒疾病反復(fù)遷延，給患兒的身心帶來(lái)了巨大的痛苦，因此深入分析小兒特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制具有重要的作用[3-4]。本研究深入分析小兒特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制，分析CYP1A1、TSLPR、CCR3在小兒特應(yīng)性皮炎中的表達(dá)，為臨床上此病的診治提供新方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5月—2020年5月我院收治的特應(yīng)性皮炎患兒89例作為特應(yīng)性皮炎組，男性42例，女性47例，年齡2.0～8.5歲，平均(4.99±2.83)歲，病程6個(gè)月～4.5年，平均(2.12±1.00)年，根據(jù)歐洲特應(yīng)性皮炎評(píng)分(Scoring Atopic Dermatitis Index，SCORAD)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)患兒疾病嚴(yán)重程度，其中得分<25分為輕度(35例)、得分25～50分為中度(39例)、得分>50分為重度(15例)。同期選取行健康體檢的健康兒童80例作為健康組，男性39例，女性41例，年齡2.3～8.6歲，平均(5.18±2.72)歲。兩組納入標(biāo)準(zhǔn)：①特應(yīng)性皮炎組患兒均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)分會(huì)免疫學(xué)組,特應(yīng)性皮炎協(xié)作研究中心所頒布的《中國(guó)特應(yīng)性皮炎診療指南(2020版)》[5]中關(guān)于小兒特應(yīng)性皮炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，②病程≥6個(gè)月，③近1周內(nèi)未接受過(guò)疾病相關(guān)治療者；④健康組研究對(duì)象無(wú)皮膚類疾病，近6個(gè)月內(nèi)無(wú)感染，身體健康，無(wú)家族遺傳史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心、肺、腎等重要臟器功能不全者；②先天性疾病者；③合并其他皮膚病或者感染性疾病者；④近1周內(nèi)使用過(guò)免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥物干預(yù)者；⑤皮膚嚴(yán)重潰瘍者；⑥精神障礙者。兩組在性別、年齡、居住地等一般資料中比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較Table 1 Comparison of general information in two groups

所有患兒家屬均知情同意本研究，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1樣本采集 采集兩組入組后第2天空腹靜脈血3 mL，在密度梯度離心處理下獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，用于CYP1A1、TSLPR、CCR3測(cè)定。

1.2.2CYP1A1、TSLPR檢測(cè)方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定CYP1A1、TSLPR表達(dá)量，取所制備的外周血單個(gè)核細(xì)胞加入600 μL RNA提取細(xì)胞裂解液，充分吹打混合均勻后備用，采用Trizol法提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA，并測(cè)定所提取的RNA純度、完整性，當(dāng)所測(cè)得的A260/A280比值在1.8～2.1范圍內(nèi)、28S寬度為18S的1.5～2.0倍時(shí)說(shuō)明所提取的RNA純度、完整性較好可用于后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞中CYP1A1、TSLPR表達(dá)量，采用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用2-△△Ct方法計(jì)算CYP1A1、TSLPR表達(dá)量。反應(yīng)體系(27 μL)：上下游引物各1.6 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 10.3 μL;SYB Green 12.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 31 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。CYP1A1引物序列：正義鏈：5′-GTCATCTGT-GCCATTTGCTTTG-3′，反義鏈：5′-CAACCACC-TCCCCGAAATTATT-3′；TSLPR引物序列：正義鏈：5′-GCACACTGGCAATGTAATGC-3′，反義鏈：5′-GTTGAACAGAACAAGTGACC-3′；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：正義鏈：5′-AACAGCCTC-AAGATCATCAGCAA-3′，反義鏈：5′-GACTGT-GGTCATGAGTCCTTCCA-3′。

1.2.3CCR3檢測(cè)方法 采用熒光抗體標(biāo)記、流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞中CCR3表達(dá)水平，將10 μL CCR3-FITC試劑加入至指標(biāo)管中，之后在檢測(cè)管中加入抗凝血100 μL，并設(shè)立同型對(duì)照管，振蕩均勻后，在避光室溫下進(jìn)行孵育，孵育20 min。將2 mL溶血素加入，振蕩均勻后在避光室溫下進(jìn)行孵育，孵育5 min，之后離心5 min(1 000 r/min)，將上清液棄除后加入2 mL PBS，再次離心5 min(1 000 r/min)，上清液棄除加入300 μL PBS混合均勻，使用美國(guó)BectonDickinso公司流式細(xì)胞儀檢測(cè)CCR3表達(dá)水平，使用Cell Quest軟件分別以FSC/SSC給細(xì)胞設(shè)門，獲取門內(nèi)10 000個(gè)細(xì)胞(每管)，分析CCR3表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，采用受試者特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析CYP1A1、TSLPR、CCR3對(duì)小兒特應(yīng)性皮炎的預(yù)測(cè)價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CYP1A1、TSLPR、CCR3在兩組中的表達(dá)情況比較 與健康組比較，特應(yīng)性皮炎組CYP1A1、TSLPR、CCR3表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 CYP1A1、TSLPR、CCR3在兩組中的表達(dá)情況比較Table 2 Comparison of CYP1A1, TSLPR and CCR3 expressions between two groups

2.2CYP1A1、TSLPR、CCR3與不同臨床特征組間的差異 CYP1A1、TSLPR、CCR3表達(dá)在特應(yīng)性皮炎患兒性別、年齡、伴隨癥狀組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CYP1A1、TSLPR、CCR3表達(dá)不同特應(yīng)性皮炎患兒疾病嚴(yán)重程度、家族過(guò)敏史、特應(yīng)性家族史、個(gè)人過(guò)敏史相關(guān)，與輕度、中度、無(wú)家族過(guò)敏史、無(wú)特應(yīng)性家族史、無(wú)個(gè)人過(guò)敏史的患兒組間比較，重度、有家族過(guò)敏史、有特應(yīng)性家族史、有個(gè)人過(guò)敏史的患兒組CYP1A1、TSLPR、CCR3表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同臨床特征組間CYP1A1、TSLPR、CCR3表達(dá)的比較Table 3 Comparison of CYP1A1, TSLPR and CCR3 expressions among groups with different clinical characteristics

2.3CYP1A1、TSLPR、CCR3之間相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，CYP1A1與TSLPR之間呈正相關(guān)(r=0.267,P=0.012)；CYP1A1與CCR3之間呈正相關(guān)(r=0.359,P=0.001)；TSLPR與CCR3之間呈正相關(guān)(r=0.269,P=0.011)。

2.4CYP1A1、TSLPR、CCR3對(duì)小兒特應(yīng)性皮炎的預(yù)測(cè)價(jià)值分析 ROC曲線分析CYP1A1、TSLPR、CCR3對(duì)小兒特應(yīng)性皮炎的預(yù)測(cè)價(jià)值結(jié)果顯示，與CYP1A1、TSLPR、CCR3單項(xiàng)預(yù)測(cè)相比，三項(xiàng)聯(lián)合的預(yù)測(cè)價(jià)值較高(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖1。

表4 CYP1A1、TSLPR、CCR3對(duì)小兒特應(yīng)性皮炎的預(yù)測(cè)價(jià)值分析Table 4 Analysis of predictive value of CYP1A1, TSLPR and CCR3 in atopic dermatitis in children

圖1 CYP1A1、TSLPR、CCR3預(yù)測(cè)小兒特應(yīng)性皮炎的ROC曲線

3 討 論

小兒特應(yīng)性皮炎臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，在疾病的不同時(shí)期其皮損表現(xiàn)不同，較為嚴(yán)重的表現(xiàn)為急性濕疹，多伴隨著劇烈瘙癢，目前隨著工業(yè)化的不斷發(fā)展，小兒特應(yīng)性皮炎的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響著患兒的身心和生長(zhǎng)發(fā)育[6-7]。

細(xì)胞色素酶P450屬于一組含有鐵血紅素的超家族，其包含CYP1、CYP2、CYP3三大家族，屬于外源性、內(nèi)源性物質(zhì)轉(zhuǎn)化酶的主要成員，其中CYP1亞家族中的CYP1A1一直是目前所研究的熱點(diǎn)，在一定的刺激下其可與體外的AHR發(fā)生特異性結(jié)合，使其表達(dá)升高，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[8-9]。目前隨著臨床上對(duì)CYP1A1的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，其參與多種生理病理過(guò)程，包括氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)、急慢性炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、肺損傷、多種惡性腫瘤、病原體感染等[10-11]。本研究為分析CYP1A1是否與小兒特應(yīng)性皮炎相關(guān)，采集此類患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞，檢測(cè)其表達(dá)，結(jié)果顯示，CYP1A1在此病中表達(dá)明顯升高，且與疾病嚴(yán)重程度、過(guò)敏史、特應(yīng)性家族史等相關(guān)，此結(jié)果提示著，CYP1A1可能參與在內(nèi)源性、外源性的刺激下參與此病，此結(jié)果與胡宇晴等[12]在其研究中發(fā)現(xiàn)，CYP1A1在特應(yīng)性皮炎患者中表達(dá)升高的結(jié)果保持一致。

特應(yīng)性皮炎皮膚炎癥皮損處的特征表現(xiàn)為活化T細(xì)胞浸潤(rùn)，存在少量的嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和大量的CD4+記憶性T細(xì)胞，其中CD4+為輔助性Th細(xì)胞表面標(biāo)志物，根據(jù)其所執(zhí)行的功能不同分析三個(gè)亞型，即為Th0、Th1、Th2[13-14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2細(xì)胞失衡在特應(yīng)性皮炎的發(fā)生中具有重要的作用，在疾病處于急性時(shí)期時(shí)Th1細(xì)胞被抑制，而Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，TSL受體為Th2型細(xì)胞因子，其具有促進(jìn)此類免疫應(yīng)答反應(yīng)的作用[15]。研究表明，TSLP屬于啟動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)的重要因子，TSLPR為其受體，主要在某些T細(xì)胞表面、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞上所表達(dá)，其主要在樹突狀細(xì)胞極化促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[16-17]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子與白細(xì)胞募集浸潤(rùn)炎癥皮損相關(guān)，而Th1、Th2細(xì)胞表達(dá)分化趨化性細(xì)胞因子受體，CCR3、CCR4、CCR8主要在Th2細(xì)胞上選擇性表達(dá)，均為上述細(xì)胞的表面標(biāo)志物[18]。CCR3屬于G蛋白藕聯(lián)受體家族成員之一，其主要被CCR3基因所編碼，屬于C-C型趨化因子受體，CCR3可經(jīng)過(guò)與包括CCL11、CCL7、CCL13、CCL5等在內(nèi)的多種配體產(chǎn)生結(jié)合作用發(fā)揮其不同的生物效應(yīng)，其中與CCL11的親和力最強(qiáng)[19-20]。臨床研究顯示，CCR3主要經(jīng)過(guò)與CCL11的特異性結(jié)合作用募集并活化嗜酸粒細(xì)胞，參與變應(yīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展[21-22]。本研究結(jié)果顯示，TSLPR、CCR3在小兒特應(yīng)性皮炎中表達(dá)明顯升高，且與患兒疾病嚴(yán)重程度、過(guò)敏史等臨床特征密切相關(guān)，此結(jié)果提示著TSLPR、CCR3可能在Th1、Th2細(xì)胞表達(dá)異常的情況下參與此病的發(fā)生進(jìn)展，但本研究并未深入探討其具體作用機(jī)制，還需后續(xù)研究進(jìn)一步分析證實(shí)，為臨床上此病的早期診斷提供參考。

本研究分析CYP1A1、TSLPR、CCR3三者呈相關(guān)性，并采用ROC曲線分析CYP1A1、TSLPR、CCR3對(duì)小兒特應(yīng)性皮炎的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，三者正相關(guān)，且與三項(xiàng)單獨(dú)預(yù)測(cè)相比，三項(xiàng)聯(lián)合對(duì)小兒特應(yīng)性皮炎的預(yù)測(cè)價(jià)值較高，提示著臨床上可采用三者聯(lián)合評(píng)估此病，以早期預(yù)測(cè)，并采取針對(duì)性的措施干預(yù)，降低發(fā)病率，促進(jìn)患兒疾病恢復(fù)。

綜上所述， CYP1A1、TSLPR、CCR3在小兒特應(yīng)性皮炎中表達(dá)升高，且與患兒疾病嚴(yán)重程度、家族過(guò)敏史、特應(yīng)性家族史、個(gè)人過(guò)敏史相關(guān)，隨著患兒疾病嚴(yán)重程度的增加，表達(dá)加劇，且與單項(xiàng)預(yù)測(cè)相比，三項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)小兒特應(yīng)性皮炎的價(jià)值較高。