血清類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)瓜氨酸化蛋白檢測在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷中的應(yīng)用價值研究

趙宏帥，羅 清，付 鵬，高玉潔，葉玉濤，饒佳月，李俊明*

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科；2.南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江西 南昌 330006）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關(guān)節(jié)損傷為主要臨床表現(xiàn)的一種慢性自身免疫性疾病，其主要病理特點為滑膜組織的炎癥增生和骨侵蝕，RA 的發(fā)病機制與多種細胞、蛋白質(zhì)有關(guān)[1]。RA 早期可致關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，若未得到及時治療可進一步導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能的喪失，最終導(dǎo)致患者殘疾、喪失勞動力，因此RA 的早期準確診斷對提高患者的生活質(zhì)量和生存率非常重要[2]。

目前RA 的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查和實驗室指標的檢測，RA 的臨床個體差異大、輕重程度不一，而在RA 早期影像學(xué)改變不明顯，所以實驗室指標對RA 的早期診斷尤為重要。根據(jù)2010 年美國風(fēng)濕病學(xué)院（ACR）和歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）合作修訂的RA 的分類標準[3]，RA 診斷的實驗室指標主要是類風(fēng)濕因子（RF）和抗循環(huán)瓜氨酸化蛋白抗體（Anti-CCP）。然而，RF 診斷RA 的特異度并不是很理想，在其他的自身免疫性疾病和部分感染性疾病中也可能增高。Anti-CCP 是目前診斷RA特異度最好的實驗室指標，但敏感度并不理想。因此，尋找新的RA 診斷標志物對于進一步促進RA 的診斷具有重要價值。蛋白質(zhì)的瓜氨酸化是蛋白質(zhì)肽鏈中的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的過程。由于發(fā)生了肽鏈基團和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，蛋白質(zhì)的瓜氨酸化可導(dǎo)致免疫細胞對蛋白質(zhì)免疫識別和應(yīng)答的紊亂，進而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。蛋白質(zhì)的瓜氨酸化在介導(dǎo)RA 患者的免疫異常中發(fā)揮了重要作用，由此產(chǎn)生的瓜氨酸化蛋白也被發(fā)現(xiàn)是多種自身抗體，尤其是Anti-CCP 產(chǎn)生的重要靶抗原。RACP 是一類與RA 特異度相關(guān)的翻譯后修飾蛋白，較早前就有研究發(fā)現(xiàn)，瓜氨酸化蛋白在RA 患者疾病發(fā)生早期的血清中就會出現(xiàn)，但其在RA 臨床診斷中的研究卻鮮見報道。本研究采用商品化的試劑盒對RA 患者其他疾病患者和健康對照者外周血中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎瓜氨酸化蛋白（RACP）的水平進行了檢測，并系統(tǒng)分析了其在RA 診斷中的應(yīng)用價值[4]。

1 材料與方法

1.1 研究對象的選擇選取2020 年7 月至11 月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科就診的RA 患者作為RA組，其診斷符合2010 年ACR/EULAR 修訂的RA 分類標準[3]。選取同期在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）、未分化關(guān)節(jié)炎（undifferentiated arthritis，UA）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者作為疾病對照組。OA 的診斷符合《骨關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南》中骨關(guān)節(jié)炎診斷標準[5]；SLE診斷符合2019 年EULAR/ACR SLE 分類標準[6]；UA 患者的納入標準：①至少有一個關(guān)節(jié)表現(xiàn)為紅腫癥狀，且不能用其他疾病解釋，②未出現(xiàn)骨侵襲表現(xiàn)[7]。健康對照組選自南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心無疾病記錄的健康體檢者。

所有研究對象在納入時均排除妊娠或哺乳期婦女，腫瘤患者，有活動性感染或近期有感染的患者，患有嚴重心、肺、肝、腎、血液系統(tǒng)疾病的患者，以及同時伴有其他自身免疫性疾病的患者。本研究獲得南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準，入組研究對象及其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集及指標檢測

1.2.1 收集所有研究對象的臨床資料及相關(guān)實驗室檢查數(shù)據(jù)計算RA 患者28 關(guān)節(jié)疾病活動指數(shù)（disease activity score 28，DAS28）[8]。同時，采集研究對象的清晨空腹靜脈血5 mL，低速水平離心機（德國Eppendorf 公司）離心（3 500 r/min，5 min）分離血清后置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RACP 的檢測RACP 的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒由廣州市雷德生物科技有限公司提供，嚴格依據(jù)說明書進行檢測。結(jié)果判斷：以血清樣品檢測結(jié)果的OD 值與臨界對照品OD 值比值（S/CO）作為RACP 的半定量水平，以S/CO=1 作為RACP 定性判斷的臨界值，S/CO ≥1 判斷為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，首先進行正態(tài)分布分析，正態(tài)分布定量資料以(±s)表示，非正態(tài)分布資料用M（P25～P75）表示，符合正態(tài)分布者采用t檢驗或單因素方差分析，否則采用非參數(shù)檢驗；定性資料以例數(shù)或百分率表示采用χ2檢驗。采用Spearman 相關(guān)分析研究各指標之間的相關(guān)性。用Medcale軟件繪制受試者操作特征（ROC）曲線評價各檢測指標對RA 的診斷價值，應(yīng)用Z 檢驗比較各指標間ROC 曲線下的AUC 值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的一般情況及臨床資料本研究共納入RA 患者133 例，包括初診患者62 例、經(jīng)治病例71 例，其中女性108 例（81.2%），年齡15～81 歲[ 平均年齡（51.81±12.88）歲]。疾病對照組共納入非RA 患者151例，包括OA95 例，SLE40 例，UA16 例，其中女性128 例（84.7%），年齡14～86 歲[平均年齡（50.32±15.59）歲]。健康對照組共納入40 例健康體檢者，其中女32 例（80.0%），年齡29～71 歲[平均年齡（48.28±10.74）歲]，年齡、性別與RA 組相匹配。研究對象的一般情況及臨床資料見表1。

表1 研究對象的一般情況及臨床資料

2.2 RACP 的陽性率分析各組研究對象的RA 相關(guān)血清學(xué)標志物的陽性率見表2。RACP 在RA 患者中的陽性率88.0%高于非RA 的疾病對照組（19.9%）和健康對照組（12.5%）。在RA 患者中，初診和經(jīng)治患者RACP 的陽性率分別為87.1%和88.7%。

表2 各組別研究對象血清RACP、Anti-CCP和RF 的陽性率[ 例(%)]

與經(jīng)典的RA 血清學(xué)標志物比較：RACP 在RA 患者中的陽性率與RF 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（88.0% vs 85.7%，χ2=0.06，P＞0.05），但高于Anti-CCP（88.0% vs 76.7%，χ2=7.04，P＜0.05）。在疾病對照組中，RACP 的陽性率高于Anti-CCP（19.9% vs 4.0%，χ2=18.17，P＜0.05），與RF 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（19.9% vs 21.2%，χ2=0.08，P＞0.05）。在健康對照組中，RACP 的陽性率高于Anti-CCP（12.5%vs 0.0%，χ2=3.20，P＞0.05），與RF 一致。

在Anti-CCP 陽性和RF 陽性的RA 患者中，RACP 的檢出率分別為96.1%和94.7%。在Anti-CCP 陰性和RF 陰性的RA 患者中，RACP 的檢出率分別為61.3%和47.4%。

在病程＜2 年的RA 患者中，RACP 陽性率為84.5%；在病程2～5 年RA 患者中，RACP 陽性率為84.8%；在病程≥5 年的RA 患者中，RACP 陽性率為95.2%高于前兩組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.07，P＞0.05）。

2.3 RACP 水平與RA 經(jīng)典的血清學(xué)標志物及RA 疾病活動度的相關(guān)性分析RA 組血清RACP 的水平高于疾病對照組和健康對照組（圖1A）。疾病對照組血清RACP的水平也高于健康對照組，其中UA 組RACP 水平高于OA 組（圖1B）。

圖1 各組研究對象的血清RACP 水平

RACP 水平與RA 其他血清學(xué)標志物的相關(guān)性分析：Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，RA 患者血清RACP 的水平與患者的年齡和性別無相關(guān)，與血清RF 水平也無相關(guān)（結(jié)果未顯示），Anti-CCP 陽性患者RACP 水平與Anti-CCP 水平正相關(guān)（r=0.367，P＜0.05）。

RACP 與RA 疾病進程和活動性的相關(guān)性分析：血清RACP 的水平在初診和經(jīng)治RA 患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A），不同病程的RA 患者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2B）。Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，RA 患者血清RACP的水平與DAS28CRP、DAS28ESR 均無相關(guān)性（結(jié)果未顯示）。但初診RA 患者血清RACP 水平與變形關(guān)節(jié)數(shù)呈正相關(guān)（r=0.65，P＜0.05）。

圖2 不同組別RA 患者血清RACP 的水平

2.4 ROC 分析以所有非RA 研究對象為對照組的ROC分析結(jié)果顯示（圖3），RACP 診斷RA 的最佳截斷值為S/CO=3.44，敏感度和特異度分別為79.0%和92.1%，其ROC 下面積（AUC）為0.90（95%CI：0.86～0.93），略高于RF 的0.89（95%CI：0.85～0.92），低于Anti-CCP的0.920（95%CI：0.89～0.95），但三者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。RACP 分別與Anti-CCP，RF 聯(lián)合后AUC 分別為0.94（95%CI：0.91～0.96）和0.93（95%CI：0.89～0.95），與RACP、RF 單一指標比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。RACP、Anti-CCP 和RF 三者聯(lián)合后AUC可達0.95（95%CI：0.92～0.97），高于RACP 和RF 兩者聯(lián)合的效果（Z=3.28，P＜0.05）。

圖3 RACP、Anti-CCP 和RF 單獨或聯(lián)合診斷RA 的ROC 分析

2.5 RACP 在RA 診斷中的性能分析各RA 血清學(xué)標志物診斷RA 的性能參數(shù)見表3。RACP 診斷RA 的敏感度高于Anti-CCP（88.0% vs 76.6%，χ2=7.04，P＜0.05），但特異度低于Anti-CCP（81.7% vs 96.9%，χ2=21.19，P＜0.05）。RACP 的敏感度和特異度都略高于RF，但差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。Anti-CCP 在RA 的診斷方面具有最好的特異度和陽性預(yù)測值，RACP 診斷RA 的敏感度和陰性預(yù)測值最佳。三個指標或兩個指標聯(lián)合后的結(jié)果表明，RACP 與Anti-CCP 聯(lián)合后比較合適，敏感度提高到91.0%，特異度為79.6%。

表3 Anti-CCP、RF 和RACP 水平單獨及聯(lián)合后診斷RA 敏感度、特異度和準確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比、陰性似然比

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征，并以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，進而導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形甚至致殘的自身免疫性疾病[9]。研究證明RA 患者對瓜氨酸化的蛋白質(zhì)可產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，提示瓜氨酸化蛋白可能是RA 致病的重要自身反應(yīng)性抗原[10]。RA 患者瓜氨酸代謝失調(diào)是驅(qū)動和維持抗瓜氨酸蛋白抗體的關(guān)鍵因素[11]。瓜氨酸化蛋白是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異度自身抗體識別的重要抗原，產(chǎn)生的抗瓜氨酸化蛋白抗體能直接或間接介導(dǎo)軟骨侵蝕、骨質(zhì)破壞，在RA 發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。目前發(fā)現(xiàn)的結(jié)合瓜氨酸化蛋白的特異度抗體包括抗核周因子（antiperinuclear factor）、抗角蛋白抗體（antikeratin antibodies）、抗聚角蛋白微絲蛋白抗體（antifilaggrin antibodies）和抗環(huán)瓜氨酸抗體（Anti-CCP），且這幾種抗體的出現(xiàn)對診斷RA 具有高度的特異度，其中Anti-CCP 已成為診斷RA 的重要血清學(xué)標志物[12]。然而由于檢測技術(shù)的限制，目前對RA 患者RACP 應(yīng)用價值的研究卻很少有報道。最近，有學(xué)者利用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了瓜氨酸化蛋白的鑒定方法，并發(fā)現(xiàn)在血清Anti-CCP 陰性的RA 患者滑膜組織同樣有瓜氨酸化蛋白的高表達[13]，提示瓜氨酸化蛋白在RA 患者中的檢出率可能高于Anti-CCP。本次研究選取了與早期RA 鑒別困難的關(guān)節(jié)炎患者作為對照組，更符合臨床要求，而且對一些RA 或者Anti-CCP 陰性的患者進行檢測，與傳統(tǒng)的實驗室檢測方法有很好的互補性。

研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者血清RACP 的檢測陽性率高于Anti-CCP，該結(jié)果證實了管曉龍等[13]的推測。然而，研究顯示RACP 診斷RA 的特異度不如Anti-CCP，提示在其他疾病特別是未分化關(guān)節(jié)炎患者同樣存在一定水平的瓜氨酸化蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)RA 新發(fā)病例組瓜氨酸化蛋白的陽性率與RA 復(fù)發(fā)疾病組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，盡管隨著病程延長RACP 的陽性率有上升趨勢，提示RACP 可能主要在RA 的發(fā)生過程中發(fā)揮作用。進一步的研究也發(fā)現(xiàn)，RACP的水平與RA 患者的疾病活動性沒有相關(guān)性，但Anti-CCP陽性患者RACP 水平與Anti-CCP 水平正相關(guān)（r=0.367，P＜0.05），而且初診RA 患者血清RACP 水平與變形關(guān)節(jié)數(shù)呈正相關(guān)（r=0.65，P＜0.05）。

在RA 的診斷效能方面，ROC 分析結(jié)果顯示，RACP診斷RA 的AUC 達到0.90，提示RACP 可作為RA 的診斷標志物。進一步的研究顯示，在Anti-CCP 陽性的RA 患者中，RACP 的陽性率可達96.1%，在Anti-CCP 陰性的RA患者中RACP 的陽性率也能達到和61.3%，即有一半以上的Anti-CCP 陰性的RA 患者血清中可檢出RACP，提示在RA 診斷方面兩者具有較好的互補性，具有較好的聯(lián)合診斷價值。研究結(jié)果也顯示，RACP 與Anti-CCP 聯(lián)合應(yīng)用于RA 的診斷時，雖然特異度有所降低，但是敏感度可顯著提高到91.0%。

本次研究RACP 特異度略低于應(yīng)用相同試劑盒陳建蕓等[14]的研究，敏感度高于該研究，可能是因為本次實驗納入的樣本多半是有關(guān)節(jié)痛等相關(guān)癥狀的患者，導(dǎo)致對照組RACP 陽性率略高。在部分非RA 的疾病對照組患者和部分健康人血清中也檢出了較高比例的RACP，尤其是在未分化關(guān)節(jié)炎患者中的檢出率達到了31.2%，提示RACP 診斷RA 的特異度并不是很理想。然而，考慮到RACP 主要是作為啟動RA 自身免疫應(yīng)答的靶抗原在RA 的發(fā)生過程中發(fā)揮作用，可能也存在部分已經(jīng)發(fā)生較高水平的蛋白質(zhì)瓜氨酸化，但尚未發(fā)生RA 或尚未滿足RA 診斷標準的個體。此前的文獻報道顯示，有約29.4%的UA 患者最終會發(fā)展為RA[15]，這也從一個側(cè)面為我們的推測提供了支撐。后期計劃對這部分RACP 陽性的非RA 組研究對象進行隨訪，了解這部分人群未來疾病的進展和發(fā)生RA 的可能，以評估RACP 在預(yù)測RA 發(fā)生中的可能作用。

綜上所述，RACP可作為RA診斷的新型血清學(xué)標志物，并與Anti-CCP 和RF 具有較好的互補性，尤其是RACP 與Anti-CCP 聯(lián)合應(yīng)用可提高RA 診斷的敏感度，但其診斷RA的特異度和預(yù)測RA 發(fā)生的作用尚需進一步的深入研究。