昆明地區(qū)1 452例低病毒載量慢乙肝患者耐藥突變相關(guān)位點(diǎn)的分析

余婷婷，王紅英，張潤武，白經(jīng)，普冬，李冬玲

（昆明市第三人民醫(yī)院/云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650041）

2016 年世界衛(wèi)生組織提出“2030 年消除病毒性肝炎作為重大公共衛(wèi)生威脅”的目標(biāo)。云南病毒性肝炎發(fā)病率跟全國的總體情況差不多，截至2022 年2 月，云南省共報(bào)告法定傳染病15 912例，其中共報(bào)告16 種乙類傳染病，病毒性肝炎的報(bào)告發(fā)病數(shù)居第2 位，而乙肝在病毒性肝炎里占比最高，乙肝的診療水平也亟待提高。臨床上低病毒載量乙肝患者分布比例高，即便乙肝病毒在低水平復(fù)制狀態(tài)下病毒仍有對人體肝臟造成損傷的能力，長期以往亦會(huì)影響患者的預(yù)后，甚至導(dǎo)致其死亡[1]。

《慢性乙型肝炎防治指南》（2019 年版）[2]放寬了抗病毒治療的適應(yīng)證，過去對于乙肝患者要求轉(zhuǎn)氨酶超過2 倍上限，E 抗原陽性的，HBV DNA ＞ 104IU/mL，E 抗原陰性的，HBV DNA ＞103IU/mL，才開始抗病毒治療，現(xiàn)在不再對HBV載量提出要求，只要檢測結(jié)果為陽性，ALT 升高（排除其他原因），就推薦開始抗病毒治療，HBV DNA《103IU/mL 的低病毒載量乙肝患者也納入抗病毒治療人群。不同基因型和抗病毒治療方案對乙肝患者病情發(fā)展以及預(yù)后有重要影響，本研究通過對昆明地區(qū)低病毒載量乙肝患者進(jìn)行基因分型及耐藥性研究，為臨床抗病毒治療難易程度的判定及抗病毒精準(zhǔn)醫(yī)療個(gè)體化方案的制定提供依據(jù)，致力于2030 年全球消除病毒性肝炎目標(biāo)的推進(jìn)。

1 資料與方法

1.1 入選標(biāo)準(zhǔn)

選取2020 年1 月至2021 年12 月昆明市第三人民醫(yī)院門診及住院的1 452例低病毒載量（HBV DNA《2.0×103IU/mL）慢性乙型肝炎患者，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2019 年版）[2]。

1.2 標(biāo)本采集

慢性乙型肝炎患者空腹采集不抗凝靜脈血5 mL，3 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心 10 min，分離血清置于 1.5 mL 離心管中，于-20 ℃儲存，備用。

1.3 標(biāo)本檢測

乙肝病毒載量檢測：按照羅氏COBAS TaqMan的試劑盒操作說明進(jìn)行檢測。

乙肝病毒分型和耐藥基因位點(diǎn)檢測：血清標(biāo)本中提取HBV DNA，PCR 擴(kuò)增 HBVP 區(qū) RT 段序列，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，在ABI 3500DX 測序儀上進(jìn)行雙脫氧末端終止法Sanger 測序。操作按說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

1.4 序列分析

通過序列比對，分析乙肝病毒基因型以及HBV P 區(qū)核苷類藥物拉米夫定LAM、阿德福韋酯ADV、恩替卡韋ETV、替比夫定LDT、替諾福韋酯TDF、恩曲他濱FTC 等相關(guān)耐藥位點(diǎn)基因的突變情況。參照《2017 年歐洲肝病年會(huì)乙型肝炎病毒感染臨床實(shí)踐指南要點(diǎn)》[3]判讀耐藥敏感性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS15.0 對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示。

2 結(jié)果

2.1 昆明地區(qū)乙肝低載量人群分布特征

昆明地區(qū)乙肝低載量人群中HBeAg 陰性者占比較高（59.5%），男性患者占比（70.6%）高于女性，年齡分布以30～60 歲為主，占比72.7%，C 基因型患者占比最高（61.8%），檢出D 基因型患者2例，見表1。

表1 昆明地區(qū)乙肝低載量人群分布特征Tab.1 Population distribution characteristics of the chronic hepatitis B patients withlowviral.l.oadin Kunming

2.2 昆明地區(qū)低載量乙肝患者耐藥分布情況

1 452例昆明地區(qū)低載量乙肝患者中共有37例患者檢出耐藥突變位點(diǎn)，拉米夫定與恩曲他濱耐藥率一致（1.6%），替比夫定耐藥率為1.2%，阿德福韋耐藥率0.9%，恩替卡韋耐藥率0.2%，替諾福韋未檢出耐藥突變位點(diǎn)，見表2。

表2 昆明地區(qū)低載量乙肝患者耐藥分布情況Tab.2 Drug resistance distribution of the chronic hepatitis B patients withlowviral.l.oadin Kunming

2.3 昆明地區(qū)低載量人群耐藥位點(diǎn)檢出情況

37例檢出耐藥突變位點(diǎn)的低載量乙肝患者中，檢出阿德福韋耐藥相關(guān)主要位點(diǎn)A181T/V、N236T、M204V/I；替比夫定耐藥相關(guān)主要位點(diǎn)M204V/I、A181T/V，補(bǔ)償位點(diǎn)L180M；恩替卡韋耐藥相關(guān)主要位點(diǎn)M204V，補(bǔ)償位點(diǎn)L180M、V173L，其他位點(diǎn)S202G；拉米夫定耐藥相關(guān)主要位點(diǎn)M204V/I、A181T/V，補(bǔ)償位點(diǎn)L180M、V173L；恩曲他濱耐藥位點(diǎn)與拉米夫定一致。各藥物的耐藥位點(diǎn)模式，見表3。

表3 昆明地區(qū)低載量人群耐藥位點(diǎn)分布情況Tab.3 Drug resistance sitesdistribution of the chronic hepatitis B patients withlowviral.l.oadin Kunming

2.4 其他突變位點(diǎn)檢出情況

除耐藥突變位點(diǎn)外，1 452例昆明地區(qū)低載量乙肝患者中還檢出其他突變位點(diǎn)112例，其中S256G、S213T、N/H238T/D、Q215H 檢出率最高，檢出率最低的突變位點(diǎn)為A194T，共檢出2例，見表4。

表4 其他突變位點(diǎn)檢出情況Tab.4 Detection of other mutation sites

3 討論

本研究中，昆明地區(qū)低病毒載量乙肝患者多為男性，與本研究團(tuán)隊(duì)前期對昆明地區(qū)2 707例慢性乙肝患者的研究結(jié)果相一致[4]，這可能與男性社交范圍較女性更廣，感染HBV 的機(jī)會(huì)更大。低病毒載量乙肝患者年齡段多集中在30～60 歲，占比72.7%，可能與此年齡段人群社會(huì)活動(dòng)程度相對較高、經(jīng)濟(jì)能力相對較強(qiáng)有關(guān)，他們獲取健康普及知識的渠道更為廣泛，因此就診率相應(yīng)增高[5]。我國HBV 基因型分布存在南方以 B 型為主，北方以 C 型為主的地域性差異。而對于昆明地區(qū)低病毒載量乙肝患者的研究發(fā)現(xiàn)，C 基因型患者占比61.8%，B 型占比38.1%，D 基因型患者2例，占比0.1%，說明本地區(qū)低病毒載量乙肝患者基因型以C 型為主，這與張悅等[6]的研究結(jié)果相一致，提示本地區(qū)的 HBV 基因型分布狀況有獨(dú)立特征。這可能與昆明為云南省會(huì)城市，人口流動(dòng)性大，HBV 的傳播途徑及感染人群等都在發(fā)生變化，造成基因型分布出現(xiàn)多樣化的趨勢。

《慢性乙型肝炎防治指南》（2019 年版）[2]不再對HBV 載量提出要求，只要檢測結(jié)果為陽性，ALT 升高（排除其他原因），就推薦開始抗病毒治療，治療藥物首選強(qiáng)效低耐藥的核苷類藥物 NAs，HBV DNA《103IU/mL 的低病毒載量乙肝患者也納入抗病毒治療人群。本研究中，1 452例低病毒載量乙肝患者中HBeAg 陰性人數(shù)占比較高（59.5%），臨床實(shí)踐中，部分低載量乙肝患者HBeAg 陰性，病毒復(fù)制處于靜止?fàn)顟B(tài)，但HBeAg 轉(zhuǎn)陰也可能是由HBV 的變異所引發(fā)，此時(shí)病毒更易對臨床抗病毒藥物耐藥[7]，提示臨床治療過程中更應(yīng)對低載量乙肝患者耐藥情況予以關(guān)注。

本次1 452例昆明地區(qū)低載量乙肝患者中共有37例患者檢出耐藥突變位點(diǎn)。拉米夫定是第一代核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，體內(nèi)與體外研究表明拉米夫定與恩曲他濱耐藥位點(diǎn)一致，本研究中拉米夫定與恩曲他濱耐藥率一致，耐藥率為1.6%，耐藥相關(guān)主要位點(diǎn)M204V/I、A181T/V，補(bǔ)償位點(diǎn)L180M、V173L，這與許春、趙衛(wèi)峰等[8-9]的研究結(jié)果相一致。本研究中，與拉米夫定相比，替比夫定的耐藥率略低，但替比夫定耐藥率高于阿德福韋、恩替卡韋，其中以恩替卡韋的耐藥率最低。恩替卡韋耐藥率低，具有較高的耐藥屏障，這可能與恩替卡韋的耐藥機(jī)制不同于其他NAs 藥物有關(guān)，需要在先出現(xiàn)M204V +L180M 兩個(gè)位點(diǎn)的耐藥突變后，再出現(xiàn)補(bǔ)償位點(diǎn)或其他位點(diǎn)的聯(lián)合變異，從而產(chǎn)生 ETV 耐藥。以往的臨床研究中[10-11]，尚未發(fā)現(xiàn) TDF 耐藥產(chǎn)生，與本研究結(jié)果類似。但N236T、A194T 和A181T/V 位點(diǎn)突變會(huì)引起替諾福韋酯不敏感[12]，本研究中發(fā)現(xiàn)N236T位點(diǎn)變異2例，A194T 位點(diǎn)變異2例，A181T/V位點(diǎn)變異12例，提示昆明地區(qū)低載量乙肝患者可能存在替諾福韋酯藥物敏感性下降。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)2 種或2 種以上的核苷類藥物可能存在交叉耐藥位點(diǎn)，臨床應(yīng)用有待進(jìn)一步研究探討。

除耐藥突變位點(diǎn)外，1 452例昆明地區(qū)低載量乙肝患者中還檢出其他突變位點(diǎn)112例。其中，檢出N/H238T/D 位點(diǎn)18例（占比16.1%），Q215H位點(diǎn)16例（占比14.3%），I233V 位點(diǎn)8例（占比7.1%），還檢出V214A、V191I 各4例。與Ryu 等[13]的研究相似，他們的研究還發(fā)現(xiàn)這5 個(gè)位點(diǎn)的出現(xiàn)可能會(huì)導(dǎo)致阿德福韋耐藥敏感性下降。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)V207M 位點(diǎn)10例（占比8.9%）、S213T 位點(diǎn)18例（占比16.1%），Jiang 等[14]對79例單用阿德福韋治療的阿德福韋耐藥者研究也發(fā)現(xiàn)了 V207 M、S213 T18例等位點(diǎn)的變異。L229V位點(diǎn)本研究中發(fā)現(xiàn)10例（占比8.9%），Han 等[15]對46例替比夫定變異患者進(jìn)行基因測序發(fā)現(xiàn)34例患者也L229V 等變異位點(diǎn)。本研究中，除上述位點(diǎn)外，還發(fā)現(xiàn)V191I、A200V、S256G 突變位點(diǎn)的存在，而這些位點(diǎn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道極少。上述檢測出的所有突變位點(diǎn)是否與耐藥性相關(guān)，能否引起藥物敏感性降低，仍存在一定的爭議，但其檢出率存在一定的占比，也應(yīng)引起重視，還需要更多學(xué)者持續(xù)深入的研究，提供一些客觀的數(shù)據(jù)支撐，從而能促使新的耐藥位點(diǎn)得到認(rèn)定。

耐藥突變是阻礙慢性 HBV 感染治療的一項(xiàng)重大難題，需進(jìn)一步深入研究昆明地區(qū)低病毒載量乙肝患者耐藥突變位點(diǎn)情況，結(jié)合肝纖維化程度、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平、乙肝病毒DNA 水平等多指標(biāo)聯(lián)合檢測，為低載量慢乙肝患者的診斷和療效動(dòng)態(tài)監(jiān)測提供更準(zhǔn)確的臨床依據(jù)，判定患者抗病毒治療難易程度，制定抗病毒精準(zhǔn)醫(yī)療個(gè)體化方案，從而致力于推進(jìn)2030 年全球消除病毒性肝炎目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。