通過足細(xì)胞Cdc50a基因敲除構(gòu)建一種全新的腎小球硬化癥小鼠模型

趙月，張倩，李靜怡，陳桂蘭，曾博

（西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000）

腎臟的主要功能是過濾血液、排泄廢物和調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡（Gorriz&Martinez-Castelao，2012）。腎單位是尿生成的基本功能單位，每個(gè)人的腎臟大約有100萬個(gè)腎單位，每個(gè)腎單位由腎小體及腎小管系統(tǒng)組成，腎小體又由腎小球及腎小囊構(gòu)成，其中，腎小球作為腎臟的過濾單位，可以對血漿進(jìn)行超濾，這一過程只允許水、葡萄糖、離子和含氮廢物等低分子量物質(zhì)從血液進(jìn)入鮑曼氏空間，同時(shí)保留重要的蛋白（Barry.，2019）。腎小球由內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、鮑曼包膜壁層上皮細(xì)胞和足細(xì)胞4種細(xì)胞組成（Lu.，2019）。足細(xì)胞是腎小球中分化程度最高的細(xì)胞類型，在腎小球?yàn)V過屏障中起著至關(guān)重要的作用，這些細(xì)胞形態(tài)復(fù)雜，由細(xì)胞體、主要足突和次要足突組成，相鄰足突由狹縫隔膜連接，狹縫隔膜覆蓋在腎小球基底膜的外部，也是尿蛋白和腎病綜合征產(chǎn)生的最后屏障（Haraldsson.，2008）。因此，對濾過屏障的破壞，特別是對足細(xì)胞的破壞，是許多慢性腎臟疾病的標(biāo)志，慢性腎臟疾病最終發(fā)展成局灶性節(jié)段性腎 小 球 硬 化（focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS）（Sang.，2020）。FSGS是研究足細(xì)胞病和蛋白尿最廣泛使用的疾病模型之一（Bose&Cattran，2014）。蛋白尿與腎小球?yàn)V過率是慢性腎病的評估指標(biāo)。蛋白尿是慢性腎病進(jìn)展的有力標(biāo)志，也是心血管死亡率增加的標(biāo)志（Gorriz &Martinez-Castelao，2012）。

跨膜雙分子層磷脂不對稱是大多數(shù)生物膜的共同結(jié)構(gòu)特征（Daleke&Lyles，2000）。研究表明，含有膽堿的磷脂［磷脂酰膽堿（PC）和鞘磷脂（SM）］定位于質(zhì)膜的外層。相反，氨基磷脂［磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰絲氨酸（PS）］在這些膜的內(nèi)側(cè)富集。這種脂質(zhì)組織是由許多磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)體產(chǎn)生和維持的，其中，質(zhì)膜氨基磷脂翻轉(zhuǎn)酶能選擇性地將磷脂酰絲氨酸從質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜的外側(cè)（Yang.，2018）。PS翻轉(zhuǎn)酶的P4-ATPases是一組磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)體，是P型ATPases的一個(gè)亞家族。P4-ATPases產(chǎn)生并維持磷脂不對稱，在細(xì)胞膜穩(wěn)定性、囊泡運(yùn)輸、血液凝固、細(xì)胞極性和遷移、凋亡細(xì)胞清除、細(xì)胞分裂、精子獲能和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用（Folmer.，2012）。

CDC50（又稱TMEM30）家族蛋白作為P4-ATPases的β亞基跨膜蛋白（除ATP9A和ATP9B外），通過異源二聚作用形成一個(gè)功能性磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物對P4-ATPases的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)起至關(guān)重要的作 用（Folmer.，2012；Yang.，2018）。CDC50A（又稱TMEM30A）是在小鼠中表達(dá)最豐富和最普遍的CDC50家族成員，它是一種末端糖基化糖蛋白，通過輔助磷脂翻轉(zhuǎn)酶將氨基磷脂（磷脂酰絲氨酸）從細(xì)胞質(zhì)膜外側(cè)翻轉(zhuǎn)至內(nèi)側(cè)，以維持細(xì)胞內(nèi)外磷脂的不對稱分布，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位，對維持多種生理系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要（Yang F.，2019）。此前研究報(bào)道，CDC50A缺失會導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸暴露于細(xì)胞外，作為凋亡信號引起細(xì)胞凋亡，從而引起一系列疾?。涸谝暰W(wǎng)膜中，視桿雙極細(xì)胞表現(xiàn)為反應(yīng)性膠質(zhì)增生、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和CD68表達(dá)增加，光敏視網(wǎng)膜電圖反應(yīng)的缺失、錐視蛋白的錯(cuò)誤定位及視錐細(xì)胞的缺失（Zhang.，2017；Yang F.，2019）。在小腦中，CDC50A缺失可導(dǎo)致早發(fā)型共濟(jì)失調(diào)和小腦萎縮（Yang.，2018）；在肝臟中，CDC50A缺失會損害小鼠胎兒肝的紅細(xì)胞生成，通過影響膽汁鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的正常表達(dá)和定位，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積（Liu.，2017；Yang Y.，2019）；在造血系統(tǒng)中，CDC50A對造血細(xì)胞和白細(xì)胞的存活至關(guān)重要（Li.，2018）；在胰腺中，CDC50A缺失會影響胰島素分泌和葡萄糖敏感性，從而導(dǎo)致葡萄糖刺激胰島素分泌受損（Yang.，2021）。CDC50A在重要器官中均有表達(dá)并維持著重要的生理功能（Folmer.，2012；Zhang.，2017；Stevens&Oltean，2018）。

腎臟作為人體最主要的代謝器官之一，行使著一系列的細(xì)胞內(nèi)外運(yùn)輸功能，本研究推測基因在這些過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究通過構(gòu)建一個(gè)足細(xì)胞特異性基因敲除（cKO）模型來闡明CDC50A在腎小球中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除小鼠的腎小球?yàn)V過率降低，濾過屏障功能嚴(yán)重受損，出現(xiàn)蛋白尿和FSGS。這種全新的腎小球硬化癥小鼠模型表明，CDC50A在維持足細(xì)胞存活和腎小球?yàn)V過屏障完整性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 材料

2.5P-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson Laboratory，轉(zhuǎn)基因小鼠由四川省人民醫(yī)院朱獻(xiàn)軍教授提供。所有動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)，在醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開展［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2018-17，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SCXK（川）2018-065］。所有動物實(shí)驗(yàn)均按照批準(zhǔn)的方案和相關(guān)指南進(jìn)行。小鼠在西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF動物房繁育，飼養(yǎng)過程中給予充足的飲水和飼料，光周期為12 h光照/12 h黑暗。

為了獲得足細(xì)胞特異性基因敲除小鼠，本研究將基因中攜帶有flox序列的條件性敲除（）小鼠與足細(xì)胞中表達(dá)Cre重組酶（2.5P-Cre）的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，獲得基因型為2.5P-Cre/小鼠，Cre陽性雜合子后代與小鼠進(jìn)行雜交獲得基因型為2.5PCre/（cKO）小鼠，同時(shí)選擇小鼠作為對照組。

動物基因組DNA快速抽提試劑盒、一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，2×Es Taq MasterMix購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，F(xiàn)ITC-Sinistrin示蹤劑購自華東醫(yī)藥股份有限公司，小鼠基因型鑒定引物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成，麻醉藥物異氟烷由西南醫(yī)科大學(xué)統(tǒng)一訂購分配使用。

1.2 方法

1.2.1 腎小球特異性基因敲除小鼠模型研究使用的2.5P-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠為人NPHS2啟動子驅(qū)動的足細(xì)胞特異性Cre重組酶表達(dá)小鼠，基因條件性敲除小鼠是在目的DNA片段兩側(cè)插入2個(gè)同方向的LoxP位點(diǎn)。當(dāng)其與2.5P-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配后，在腎小球足細(xì)胞中表達(dá)的Cre重組酶對2個(gè)LoxP位點(diǎn)進(jìn)行剪切和重組，導(dǎo)致靶基因被敲除。

2種轉(zhuǎn)基因小鼠及其雜交后代的基因型鑒定使用2.5P-Cre特異性引物（2.5P-F：TGCCACGACCAAGTGACAGCAATG，2.5P-R：ACCAGAGACGCAAATCCATCGCTC，目的條帶大小：200 bp）和特異性引物（Cdc50a-F：ATTCCCCTCAAGATAGCTAC，Cdc50a-R：AATGATCAACTGTAATTCCCC，目的條帶大小：245 bp；WT：179 bp）對鼠尾DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷基因型。鼠尾DNA提取采用動物基因組DNA快速抽提試劑盒，取鼠尾（0.5～1 mm）于50 μL DNA Extraction Solution及2 μL Enzyme Mix混合溶液中，55℃金屬浴30 min，95℃金屬浴15 min，冷卻后加入50 μL Stop Solution混勻震蕩離心，用作PCR模板。PCR體系（20 μL）：ddHO 7 μL，引物各1 μL，DNA 1 μL，2×Es Taq MasterMix 10 μL。PCR程序：95℃2 min；94℃20 s，53℃/55℃20 s，72℃20 s，35個(gè)循環(huán)；72℃1 min，10℃保存。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后成像分析。

抓取小鼠背頸部將小鼠提起，當(dāng)小鼠應(yīng)激時(shí)會流出尿液，用EP管接取隨機(jī)尿，操作過程中避免糞便掉落EP管中污染尿液，尿液采集后-80℃保存，避免尿蛋白降解，多次收集至500 μL，3 000 r·min，離心10 min，收集上清液送至西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行尿蛋白、肌酐及尿電解質(zhì)檢測。

腎小球?yàn)V過率（glomerular filtration rate，GFR）指單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）兩側(cè)腎生成的超濾液量，是衡量腎功能的重要指標(biāo)之一。在實(shí)驗(yàn)前一天，用電動剃毛刀和脫毛膏將小鼠一側(cè)從大腿上部至頸部進(jìn)行脫毛至皮膚裸露，需要避開脊柱。用生理鹽水配置FITC-Sinistrin熒光示蹤劑溶液，配置濃度為35 mg·mL，配置后的溶液-20℃避光保存。FITC-Sinistrin示蹤劑劑量為7 mg/100 g體質(zhì)量。連接檢測儀和電源，藍(lán)色LED燈閃爍即接通電源，大約10 s后開始采集并存儲數(shù)據(jù)，之前的存儲在設(shè)備上的數(shù)據(jù)將在本次接通電源后自動刪除。將檢測儀上的LED燈與貼片透明窗口精準(zhǔn)對接并粘貼在小鼠裸露皮膚上，同時(shí)用膠帶固定。記錄背景信號2～3 min，將小鼠進(jìn)行異氟烷麻醉后靜脈注射FITC-Sinistrin熒光示蹤劑，測量期間小鼠放置在單獨(dú)籠中，盡量保持安靜，檢測時(shí)間60～90 min后，把檢測儀從小鼠身上取下進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取和分析。

小鼠麻醉稱重后迅速剖檢，取雙側(cè)腎臟，PBS緩沖液洗滌血液并用干紙吸取水分，稱定質(zhì)量，計(jì)算腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

腎臟組織用10%中性甲醛固定24 h，沖洗，脫水，石蠟包埋后切片。進(jìn)行PAS、HE染色，在光鏡下觀察腎臟組織病理變化。

使用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對腎臟石蠟切片進(jìn)行TUNEL檢測：（1）二甲苯中脫蠟5～10 min。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10 min，無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min。（2）滴加20 μg·mL不含DNase的蛋白酶K，室溫下作用10 min，37℃孵育1 h。（3）PBS緩沖液洗滌3次，每次15 min。（4）滴加TUNEL檢測液（1個(gè)樣本：TdT酶5 μL+熒光標(biāo)記液45 μL+TUNEL檢測液50 μL），37℃孵育60 min，PBS緩沖液洗滌3次，每次15 min。（5）滴加熒光淬滅劑封片后在顯微鏡下觀察和采集圖像。

數(shù)據(jù)集采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)正態(tài)分布。若符合正態(tài)分布，通過Student’s-test或ANOVA確定統(tǒng)計(jì)顯著性；反之，則使用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)量計(jì)算。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7處理。顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 雜交小鼠基因型

利用Cre-LoxP技術(shù)將2.5P-Cre小鼠和基因敲除小鼠進(jìn)行雜交，獲得基因型2.5P-Cre/（cKO組）及2.5P-Cre/（對照組）小鼠（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR genotyping of transgenic mice

2.2 cKO小鼠尿液表型特征

cKO組與對照組小鼠出生時(shí)的比例符合孟德爾定律，cKO組小鼠未見明顯形態(tài)異常，但從出生后2.5個(gè)月開始，其蛋白尿水平比對照組小鼠顯著增加，出生后3.5個(gè)月，蛋白尿水平繼續(xù)上升（圖2：A～C）。出生后2.5個(gè)月，2組的腎臟指數(shù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2：D）。此外，3月齡小鼠的尿電解質(zhì)在組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2：E～I(xiàn)）。

圖2 Cdc50a基因敲除小鼠尿液表型特征Fig.2 Phenotypic characteristics of urine in Cdc50a gene knock-out mice

2.3 cKO小鼠腎小球?yàn)V過率變化表征

與對照組相比，cKO組小鼠的GFR從出生后2.5個(gè)月明顯降低，并且在3.5個(gè)月時(shí)降低情況依舊保持（圖3）。

圖3 Cdc50a基因敲除小鼠腎小球?yàn)V過率特征Fig.3 Characterization of glomerular filtration rate in Cdc50a gene knock-out mice

2.4 cKO小鼠足細(xì)胞凋亡情況

TUNEL檢測結(jié)果顯示，腎小球凋亡情況在1.5月齡小鼠間無顯著性差異，而2.5月齡cKO組小鼠足細(xì)胞陽性標(biāo)記數(shù)量顯著增加，3.5月齡小鼠在組間有顯著性差異（圖4）。

圖4 Cdc50a基因敲除小鼠足細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色）Fig.4 Apoptosis of podocytes in Cdc50a gene knock-out mice（TUNEL staining）

2.5 cKO小鼠腎臟損傷情況

對1.5月齡、2.5月齡和3.5月齡的cKO組及同窩對照組小鼠的腎臟石蠟切片通過光鏡分析以評估病理變化。腎臟切片的HE染色和PAS染色均顯示2組小鼠無顯著差異，主要腎臟變化證實(shí)與腎小球有關(guān)（圖5：A）。1.5月齡時(shí)足細(xì)胞中基因敲除對腎臟大小及形態(tài)沒有影響。而在2.5月齡基因敲除的小鼠中，組織學(xué)分析顯示，除了節(jié)段性系膜增生及包膜粘連外，部分腎小球出現(xiàn)硬化表征（圖5：B）。3.5月齡時(shí)，腎小球硬化加重（圖5：C），并伴有不同程度的足細(xì)胞變形和丟失，這與腎小球?yàn)V過率結(jié)果一致。

圖5 Cdc50a基因敲除小鼠腎臟損傷情況Fig.5 Kidney injury in Cdc50a gene knock-out mice

3 討論

足細(xì)胞損傷在多種腎臟疾病進(jìn)展中被認(rèn)定為獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因素，也是導(dǎo)致腎小球硬化的起始因素，如DN、IgAN和FSGS（Lu.，2019；Sang.，2020）。足細(xì)胞在健康狀態(tài)下正常維持穩(wěn)態(tài)，遇到生理壓力或病理刺激時(shí)，則會發(fā)生代償性反應(yīng)以保持功能，如通過合成腎小球基底膜的成分來維持腎小球?yàn)V過屏障；形成狹縫以及相互作用確保內(nèi)皮細(xì)胞的活力。當(dāng)刺激強(qiáng)度超過其代償性作用，則會發(fā)生病理性損傷，如蛋白尿、節(jié)段性腎小球纖維化、腎小球基底膜增厚，最終導(dǎo)致腎小球硬化（Coresh.，2014）。

蛋白尿是足細(xì)胞損傷的早期結(jié)果，也是腎病的典型征象?；啄ぜ?xì)胞、肌動蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞黏附分子形成了一個(gè)緊密的網(wǎng)絡(luò)來穩(wěn)定過濾屏障功能，這些成分的缺陷使得蛋白尿得以存在（Lu.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)cKO小鼠在2.5月齡時(shí)出現(xiàn)蛋白尿，并且與同窩對照小鼠相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05），表明腎小球足細(xì)胞出現(xiàn)損傷和丟失；同時(shí)與同窩對照小鼠相比，2.5月齡cKO小鼠的腎臟指數(shù)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，猜測腎小球?yàn)V過屏障受損可能使腎臟發(fā)生代償性增生，并且隨受損程度的增加而增加。此外，GFR檢測結(jié)果也與此前動物實(shí)驗(yàn)研究中單腎單位水平的超濾是蛋白尿和腎小球硬化的危險(xiǎn)因素結(jié)果一致（Brenner.，1996）。

PS翻轉(zhuǎn)酶的β亞基CDC50A對于維持質(zhì)膜磷脂的不對稱分布以確保細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要（Daleke.，2000；Dhar.，2004；Ruggenenti & Remuzzi，2006；Turin.，2013；Liu.，2017），本研究小鼠腎臟石蠟切片的TUNEL染色顯示，足細(xì)胞在2.5月齡時(shí)開始出現(xiàn)凋亡。這也證實(shí)了CDC50A敲除后，質(zhì)膜上的PS暴露作為凋亡信號導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，腎臟切片HE和PAS染色結(jié)果均顯示，基因缺失會造成腎損傷，且損傷程度隨月齡的增加進(jìn)一步加重，直至可能發(fā)生腎衰竭。

CDC50A對于腦、肝臟、胰腺等重要器官的存活和功能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究揭示了CDC50A在維持腎小球?yàn)V過屏障完整性方面的新作用。足細(xì)胞基因缺失致使足細(xì)胞變性，導(dǎo)致蛋白尿、GRF降低、系膜細(xì)胞增殖、系膜基質(zhì)堆積、足細(xì)胞損傷和丟失、節(jié)段性腎小球纖維化，最終導(dǎo)致自發(fā)性腎小球硬化等一系列病理表型改變。這為理解足細(xì)胞損傷機(jī)制提供了另一種獨(dú)特的視角，同時(shí)也構(gòu)建了一種全新的自發(fā)性腎小球硬化癥小鼠模型。