續(xù)仲接骨散的薄層色譜鑒別與含量測(cè)定

劉 彥，韓德強(qiáng)，付瑋辰，梁麗麗

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

續(xù)仲接骨散由槲寄生、續(xù)斷、當(dāng)歸、杜仲、制馬錢(qián)子、冰片、大黃、全蝎等中藥組成，具有活血化瘀、消腫止痛、接骨續(xù)筋之功效；用于跌打損傷、筋斷骨折、瘀血腫痛等病癥；是本院臨床常用且療效確切的經(jīng)驗(yàn)方。原標(biāo)準(zhǔn)只有當(dāng)歸、杜仲、冰片的薄層色譜鑒別及士的寧的含量測(cè)定方法。本方屬于按傳統(tǒng)工藝配制的散劑，為了按要求對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)傳統(tǒng)工藝配制的中藥制劑進(jìn)行備案制管理，同時(shí)能夠更加全面、科學(xué)、有效地控制其質(zhì)量，課題組對(duì)續(xù)仲接骨散的原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了進(jìn)一步研究改進(jìn)，在此基礎(chǔ)上初步建立續(xù)斷薄層色譜方法及制馬錢(qián)子的兩種成分含量測(cè)定方法。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)所確立的川續(xù)斷皂苷Ⅵ的定性方法及士的寧、馬錢(qián)子堿定量方法專(zhuān)屬性好，簡(jiǎn)單并具有可重復(fù)性，便于更好地控制其質(zhì)量。報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥 續(xù)仲接骨散(批號(hào)：210501、210502、210503)：黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室提供。馬錢(qián)子總生物堿對(duì)照提取物(批號(hào)：112030-201601)、川續(xù)斷皂苷Ⅵ(批號(hào)：111685-201707)：中國(guó)食品藥品檢定研究院。庚烷磺酸鈉為色譜純：上海展云化工有限公司；乙腈為色譜純(DIKMA)；其他試劑均為分析純；水為重蒸水。

1.2 儀器 戴安P680高壓液相色譜儀：美國(guó)戴安公司；BT25S型十萬(wàn)分之一電子天平、BSA224S型萬(wàn)分之一電子天平：德國(guó)賽多利斯；KQ-700VDB雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 續(xù)斷的TLC鑒別

稱(chēng)取本品散劑5 g，加入稀乙醇20 mL，超聲處理30 min，提取液濾過(guò)，濾液于水浴鍋上蒸至無(wú)醇味，加入水20 mL，混勻，以水飽和正丁醇50 mL振搖提取，正丁醇液用氨試液30 mL洗滌，棄去氨試液，正丁醇液再用水30 mL洗滌，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状糽 mL溶解，制成供試品溶液[1]952。另取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品，以甲醇溶解并制成每l mL含1 mg的對(duì)照品溶液。再稱(chēng)取處方比例的無(wú)續(xù)斷樣品按同一方法制成續(xù)斷陰性液。照(通則0502)試驗(yàn)，將3 種溶液于硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量均為5 μL，展開(kāi)劑選取正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)的上層溶液，噴以10%硫酸乙醇溶液并立即加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[1]952。結(jié)果可見(jiàn)：供試品色譜于日光下檢驗(yàn)，可以清晰檢出與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品未檢測(cè)到干擾斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

1～3.供試品；4.川續(xù)斷皂苷Ⅵ；5.陰性供試品圖1 續(xù)斷薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Synergi Hydro-RP 80A(4.6 mm×250 mm，4 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)(21∶79)為流動(dòng)相[1]53；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm[1]53；流速：1.0 mL/min.

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取馬錢(qián)子總生物堿對(duì)照提取物18.70 mg于50 mL量瓶中，以甲醇超聲數(shù)分鐘溶解并定容至刻度，即得(每1 mL含士的寧0.18 663 mg、馬錢(qián)子堿0.16 980 mg)。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品散劑充分混勻，取5.5 g，精密稱(chēng)定，置磨口三角瓶中，加氫氧化鈉試液6 mL，混勻后室溫放置30 min，精密量取三氯甲烷40 mL加入后密塞，稱(chēng)定其重量，回流提取2 h，放冷，再稱(chēng)定重量，以三氯甲烷對(duì)減失的重量進(jìn)行補(bǔ)足，搖勻，使三氯甲烷液通過(guò)無(wú)水硫酸鈉的濾紙進(jìn)行濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液6 mL[1]53，60 ℃以下蒸干，立即冷卻，殘?jiān)⒓从眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照品溶液制備 取按照本品散劑的處方組成及處方工藝制成的不含制馬錢(qián)子陰性樣品，同2.2.3所述方法制成制馬錢(qián)子陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 專(zhuān)屬性 依次將上述陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液注入色譜儀測(cè)定其方法的專(zhuān)屬性。結(jié)果表明：陰性色譜圖在士的寧、馬錢(qián)子堿對(duì)應(yīng)保留時(shí)間位置上未檢測(cè)到干擾吸收峰。見(jiàn)圖2。

圖2 續(xù)仲接骨散的HPLC色譜圖(A.馬錢(qián)子堿；B.士的寧)

2.2.6 線性關(guān)系考察 將2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液稀釋制成如下濃度：士的寧對(duì)照品濃度為0.03 733、0.07 465、0.11 198、0.14 930、0.18 663 g/L、馬錢(qián)子堿對(duì)照品溶液濃度為0.03 396、0.06 792、0.10 188、0.13 584、0.16 980 g/L，依次分別注入色譜儀，測(cè)得回歸方程分別為Y=268.65X+0.0998(r=0.9997)、Y=226.6X+0.1500(r=0.9997)；結(jié)果士的寧、馬錢(qián)子堿峰面積與進(jìn)樣量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度 將對(duì)照品(士的寧：0.11 198 g/L、馬錢(qián)子堿：0.10 188 g/L)溶液進(jìn)樣測(cè)定儀器精密度，進(jìn)樣量10 μL，由峰面積計(jì)算RSD分別為0.41%(n=6)、0.34%(n=6)。說(shuō)明儀器具有較好的精密度。

2.2.8 穩(wěn)定性 按照2.2.3所述方法，精密稱(chēng)取本品散劑制成供試品溶液，每隔一定時(shí)間進(jìn)行樣品穩(wěn)定性的測(cè)定(0、4、8、12、16、24 h)，RSD分別為0.59%(n=6)、0.72%(n=6)。表示樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性 取同批次本品散劑制成6份供試品，測(cè)定峰面積，計(jì)算士的寧、馬錢(qián)子堿平均含量分別為0.8 803 mg g-1，RSD=0.48%(n=6)、0.5 998 mg g-1，RSD=0.76%(n=6)。結(jié)果顯示此方法有良好的重復(fù)性。

2.2.10 回收率 取同批次散劑6份，每份約1.3 g，精密稱(chēng)定，精密加入對(duì)照品溶液，制備供試品溶液，計(jì)算士的寧、馬錢(qián)子堿回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 續(xù)仲接骨散中士的寧、馬錢(qián)子堿的回收率試驗(yàn)(S.士的寧；M.馬錢(qián)子堿)

2.2.11 含量測(cè)定結(jié)果 照上述建立的含量測(cè)定方法分別測(cè)定3批續(xù)仲接骨散(210501、210502、210503)士的寧、馬錢(qián)子堿含量，經(jīng)過(guò)計(jì)算，本品含士的寧分別為0.8 765、0.8 806、0.8 783 mg/g，含馬錢(qián)子堿分別為0.6 027、0.5 986、0.6 009 mg/g，綜合3個(gè)批次測(cè)定結(jié)果與考慮實(shí)際生產(chǎn)前處理粉碎與過(guò)篩收率、配研混合等各方面因素，暫定本品制馬錢(qián)子以士的寧(C21H22N2O2)計(jì)，應(yīng)為0.46～1.21 mg/g；以馬錢(qián)子堿(C23H26N2O4)計(jì)，不得少于0.31 mg/g。

3 討論

續(xù)斷具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、止崩漏的功效；近代藥理學(xué)研究顯示續(xù)斷在治療骨質(zhì)疏松和骨傷愈合等方面有良好作用[2-3]。續(xù)斷含三萜皂苷、生物堿、總黃酮、環(huán)烯醚萜苷等多種成分[2-3]，其中三萜皂苷類(lèi)成分最為豐富。續(xù)斷在本處方中占有重要地位，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)續(xù)斷的活性成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ進(jìn)行薄層色譜鑒別。川續(xù)斷皂苷Ⅵ性質(zhì)比較穩(wěn)定，采用藥典方法并在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)對(duì)比了參考文獻(xiàn)色譜條件中展開(kāi)劑三氯甲烷∶甲醇(4∶1)[4]與本實(shí)驗(yàn)選取的正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)[1]952的上層溶液的條件，發(fā)現(xiàn)方法均可行，但本實(shí)驗(yàn)藥典條件提取溶劑與展開(kāi)劑種類(lèi)的毒性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于參考文獻(xiàn)，所以選定藥典展開(kāi)劑為本實(shí)驗(yàn)色譜條件；由于此皂苷成分穩(wěn)定性好且續(xù)斷在本方中含量相對(duì)較高，因此該薄層色譜鑒別方法基本不受外界因素干擾，重復(fù)性和專(zhuān)屬性均良好。

制馬錢(qián)子具有散結(jié)消腫、通絡(luò)止痛之功效，其有效活性成分主要為生物堿類(lèi)，制馬錢(qián)子為本方中君藥，其代表性成分分別為士的寧與馬錢(qián)子堿，其有效成分亦是其毒性成分，其中士的寧毒性較大，是馬錢(qián)子堿毒性的20 倍[5]，但其療效卻為馬錢(qián)子堿療效的40 倍。原標(biāo)準(zhǔn)中只有針對(duì)士的寧一種成分進(jìn)行含量測(cè)定的方法，為了進(jìn)一步加強(qiáng)本方對(duì)于制馬錢(qián)子的毒性生物堿類(lèi)成分的合理性與安全性的有效控制，本實(shí)驗(yàn)采用馬錢(qián)子總生物堿對(duì)照提取物為對(duì)照，利用2020版藥典條件對(duì)2 種成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中比較了原方法色譜條件流動(dòng)相甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.5)(25∶75)、檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，發(fā)現(xiàn)該色譜條件只有針對(duì)士的寧成分的理論塔板數(shù)超過(guò)了2 000，而且此條件下發(fā)現(xiàn)馬錢(qián)子堿出峰時(shí)間落后于士的寧色譜峰保留時(shí)間，峰展寬程度較高，并且出現(xiàn)前沿峰，峰型對(duì)稱(chēng)性較差。而本實(shí)驗(yàn)選取的藥典條件為離子對(duì)試劑庚烷磺酸鈉與磷酸二氫鉀，此條件兩種成分色譜峰保留時(shí)間較為適宜，且無(wú)色譜峰展寬現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)選取的藥典條件檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm的紫外吸收更強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高于254 nm，提高了檢測(cè)靈敏度，并且在一定程度上降低了基線噪音與檢測(cè)誤差。同時(shí)也比較了文獻(xiàn)流動(dòng)相乙腈-水-二乙胺(34∶100∶1)[5]，此條件對(duì)柱溫條件要求嚴(yán)格，柱溫對(duì)色譜峰保留時(shí)間影響波動(dòng)比較大。雖然原標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)的色譜條件簡(jiǎn)單，價(jià)格相對(duì)低廉，但是達(dá)不到雙成分含量測(cè)定分析方法的要求，本方法采用的離子對(duì)試劑即便對(duì)C18色譜柱壽命有影響，但綜合考慮測(cè)定方法的準(zhǔn)確性等因素仍選用藥典條件為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。該條件下圖譜雜質(zhì)峰少，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，專(zhuān)屬性強(qiáng)，可以更加有效地控制本品的內(nèi)在質(zhì)量及服用劑量。