甘草甜素對(duì)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其lnc-SNHG5表達(dá)的影響

劉東升,唐關(guān)敏

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院·浙江 杭州 310053；2嘉興學(xué)院附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科·浙江 嘉興 314000)

急性心肌梗死導(dǎo)致心肌缺血壞死，對(duì)人群健康危害極大[1]。在我國心肌梗死的發(fā)病率逐年上升[2]。心肌梗死患者及時(shí)開放冠狀動(dòng)脈可以減少心肌梗死面積，顯著降低死亡率[3]；但缺血心肌恢復(fù)血液灌注后易造成心肌結(jié)構(gòu)的損傷，即缺血再灌注(I/R)損傷[4]。在心肌I/R的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者發(fā)病后不同時(shí)期循環(huán)血中l(wèi)ncRNA的水平和心臟左室功能及患者是否存在糖尿病、高血壓等并發(fā)癥密切相關(guān)，說明lncRNA參與缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展過程[5]。甘草甜素(glycyrdaizin，GL)是從甘草中分離提取的三萜類成分，甘草作為中醫(yī)處方中使用頻率最高的中草藥之一，性味甘、平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、緩急止痛、緩解藥物毒性及烈性等作用。本研究在觀察甘草甜素對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用同時(shí)PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞lnc-SNHG5表達(dá)，探討其相關(guān)性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

甘草甜素(純度99.80%)購自美國Selleck公司。大鼠H9C2心肌細(xì)胞：上海中喬新舟生物科技有限公司。DMEM低糖培養(yǎng)基：美國Hyclone公司；CCK8試劑盒：美國Abmole公司；SNHG5 siRNA：蘇州GenePharma公司；Lipofecmine 2000和Lipofectamine? RNAiMAX：ThermoFisher公司。LSRFortessa流式細(xì)胞儀：美國BD公司；三氣培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀：美國 Thermo公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM低糖培養(yǎng)基，添加10%的胎牛血清，培養(yǎng)于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中。消化對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，傳代至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)初始密度為1×105個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)過程中將細(xì)胞分為4組，分別為：①正常對(duì)照組(Control)：常規(guī)培養(yǎng)，不予藥物或轉(zhuǎn)染處理；②模型組(Hypoxia Reoxygenation,HR)：細(xì)胞置于37 ℃、充滿5%CO2和95%N2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧培養(yǎng)3 h，然后再轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧3 h，以構(gòu)建缺氧/復(fù)氧模型； ③轉(zhuǎn)染組(Transfection group，TG)：將sh-SNHG5基因序列克隆到pLKO載體中，構(gòu)建了SNHG5基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株，sh-SNHG5的引物見表1。④甘草甜素組(Glycyrrhizin group，GP)：于缺氧/復(fù)氧前給與甘草甜素，濃度為40 μmol/L，隨后予以缺氧/復(fù)氧處理。

表1 sh-SNHG5的引物序列

2.2 CCK-8 法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率 按照試劑盒的說明，取對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，鋪96孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，分別按照2.1分組進(jìn)行處理，其中正常對(duì)照組單獨(dú)鋪96孔板，其余3組細(xì)胞鋪設(shè)于同一塊96孔板，每組設(shè)定10個(gè)孔，各組處理后測(cè)定各組H9C2心肌細(xì)胞的活性，每孔微量加樣器加100 μL的CCK-8溶液，避光孵育3 h，通過酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長下的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(本組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 每組細(xì)胞按2.1分組處理后分別收集培養(yǎng)上清液，使用1 mL的Bingding Buffer(1×)混懸細(xì)胞，300×g離心10 min，棄上清液。使用1 mL的Bingding Buffer重新混懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL。取100 uL每管，每管再加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)。避光常溫狀態(tài)下輕混勻10 min，滴加5 μL碘化丙啶，避光常溫下繼續(xù)反應(yīng)5 min，滴加PBS 500 μL輕混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率=(早期凋亡數(shù) + 晚期凋亡數(shù))/總細(xì)胞數(shù)。測(cè)5次，取均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

2.4 qPCR 檢測(cè)心肌細(xì)胞lnc-SNHG5表達(dá)水平 每組細(xì)胞按2.1 分組處理后分別收集細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑盒的說明提取RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成CDNA，以CDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火 2 min，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計(jì)算lnc-SNHG5的表達(dá)水平，重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 各組心肌細(xì)胞存活率比較 以正常對(duì)照組細(xì)胞為參照，模型組、轉(zhuǎn)染組、甘草甜素組細(xì)胞的存活率分別為(16.14±3.95)%、(35.16±5.73)%、(42.59±6.31)%。各組細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.98，P=0.0025)，且轉(zhuǎn)染組與甘草甜素組細(xì)胞存活率均較模型組顯著升高(均P<0.05)，而甘草甜素組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率的比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.2 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較 各組細(xì)胞凋亡率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=104.7，P<0.0001)。進(jìn)一步兩兩比較，與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.05)；且甘草甜素組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率較模型組均明顯降低(均P<0.05)，提示甘草甜素或沉默lnc-SNHG5的表達(dá)可降低缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞凋亡率，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，見表2。

表2 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較

3.3 各組心肌細(xì)胞lnc-SNHG5表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組相比，模型組與甘草甜素組lnc-SNHG5的表達(dá)水平均升高(均P<0.05)，轉(zhuǎn)染組lnc-SNHG5的表達(dá)水平無改變(P>0.05)，與模型組相比，甘草甜素組lnc-SNHG5的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組心肌細(xì)胞lnc-SNHG5表達(dá)水平比較

4 討論

甘草甜素是中藥甘草的主要成分，由1分子甘草次酸與2分子葡萄糖醛酸組成，為水溶性物質(zhì)[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素在抗癌、抗病毒、抗氧化、抗炎方面均有作用[7-8]，同時(shí)甘草甜素通過抑制HMGB1表達(dá)發(fā)揮組織器官缺血再灌注損傷保護(hù)作用[9]。Tiziana等[10]研究證實(shí)甘草甜素通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮對(duì)脊椎再灌注損傷的保護(hù)作用。Zhai等[11]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)甘草甜素可通過抑制心肌缺血再灌注后HMGBI的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，減少心肌缺血再灌注損傷。此外，甘草甜素可以顯著減輕大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡損傷程度，并參與調(diào)節(jié)Bax和細(xì)胞色素C的釋放，影響caspase-3活性從而減輕心肌細(xì)胞凋亡，該保護(hù)機(jī)制可能與抑制JNK磷酸化有關(guān)[12]；然而甘草甜素對(duì)于心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

心臟疾病的發(fā)生與異常的心臟基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)緊密相關(guān)，最新的研究證實(shí)非編碼RNA在多種心臟疾病及眾多的疾病中均發(fā)揮了相關(guān)作用。LncRNA由超過200個(gè)核苷酸所組成，是一種新的非編碼轉(zhuǎn)錄RNA，缺乏完整開放的閱讀框，不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，其主要通過募集轉(zhuǎn)錄因子或參與組蛋白修飾發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控的作用；lncRNA也可通過內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA和miRNA關(guān)聯(lián)作用，對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控[13-14]。在心肌缺血再灌注損傷的研究中，不同時(shí)期外周血HIF-1α與lncRNA表達(dá)與患者是否患有高血壓、糖尿病及心臟左心室功能均具有緊密聯(lián)系，說明lncRNA在缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了相關(guān)作用[15]。其他相關(guān)研究也顯示lncRNA與miRNA的結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)，對(duì)缺血心肌細(xì)胞的功能及存活有一定影響[16-17]。

LncRNA在心肌I/R損傷的功能研究剛剛起步，目前關(guān)注較多的lncRNA有H19、MALAT1、ARF等，lnc-SNHG5的研究主要在淋巴癌、大腸癌及食管癌等腫瘤領(lǐng)域。LncRNA-SNHG5 (small nucleolar RNA host gene 5)在2000年由Tanaka等在人類B淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，由snoRNA (small nucleolar RNA)家族U50和U50’的宿主基因U50HG 6個(gè)外顯子組成的成熟剪切體，U50HG定位于染色質(zhì)基因組斷點(diǎn)t(3; 6)(q27; q15)。位于基因組斷點(diǎn)位置的基因是候選腫瘤相關(guān)基因的重要指標(biāo)。Zhao L發(fā)現(xiàn)lncRNA-SNHG5/miR-32/KLF4軸對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移進(jìn)行調(diào)控[18]。lncRNA-SNHG5通過抑制STAU-1表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的存活[19]，其表達(dá)異常在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中得到了驗(yàn)證[20]。但lncRNA-SNHG5在心血管疾病的研究中未見報(bào)道。本課題組前期在大鼠心肌I/R模型的lncRNA和mRNA芯片檢測(cè)中，獲得57個(gè)差異表達(dá)的lncRNA。熒光定量PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)lnc-SNHG5在I/R模型和心肌細(xì)胞H/R模型中均表達(dá)升高。其差異性表達(dá)提示lncRNA-SNHG5很可能在心肌I/R損傷中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。因此，本課題組重點(diǎn)探索了其與心肌缺血再灌注損傷的相關(guān)性。

本研究構(gòu)建了lnc-SNHG5基因沉默的H9C2心肌細(xì)胞模型及甘草甜素處理的缺氧復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甘草甜素及l(fā)nc-SNHG5沉默可以保護(hù)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞，各組lnc-SNHG5表達(dá)qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示模型組lnc-SNHG5表達(dá)明顯增高，甘草甜素預(yù)處理可有效抑制心肌細(xì)胞lnc-SNHG5的表達(dá)。

綜合上述，甘草甜素可能通過抑制lnc-SNHG5的表達(dá)發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，而lnc-SNHG5抑制后的下游通路改變有待進(jìn)一步研究。