HPLC法同時測定三子顆粒中沒食子酸、川楝素和梔子苷的含量

戴小燕，張 婷，嚴(yán)道榮

(1溫州市中醫(yī)院·浙江 溫州 325000；2杭州奧默醫(yī)藥股份有限公司·浙江 杭州 311112；2浙江康恩貝中藥有限公司·浙江 麗水 323400)

三子顆粒是由訶子、川楝子、梔子3味藥組成的蒙藥制劑，具有清熱、涼血、解毒作用，用于治療瘟熱、眩暈、頭痛、血熱目赤等癥。本品在部頒標(biāo)準(zhǔn)[1]中已收載，目前中國藥典已經(jīng)對川楝子飲片中的川楝素以及梔子飲片中的梔子苷等有效成分進(jìn)行了質(zhì)量控制，但部頒標(biāo)準(zhǔn)中并未對三子顆粒中相關(guān)有效成分的含量進(jìn)行限定，而其散劑三子散藥品也僅對梔子苷進(jìn)行了檢測[2]。雖然文獻(xiàn)有對三子顆粒中的一味或兩味藥的活性成分含量研究的報道，但同時測定三子顆粒中3味藥物多個化學(xué)成分含量卻很少有相關(guān)報道。本文采用高效液相色譜法(HPLC)同時測定三子顆粒訶子中的活性成分沒食子酸、川楝子中的活性成分川楝素以及梔子中的活性成分梔子苷的含量，進(jìn)行方法學(xué)考察，為有效控制該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀：安捷倫公司；十萬分之一電子天平：METTLER TOLEDO瑞士梅特勒-托利多公司；KQ5200超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司。

三子顆粒：內(nèi)蒙古凱蒙藥業(yè)有限公司，批號：18010301、19050901、19091203。沒食子酸、川楝素、梔子苷的對照品：中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110831-201906、111842-201001、110749-201919。水為高純水；乙腈、三氟乙酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取沒食子酸對照品49.68 mg置50 mL量瓶中、川楝素對照品12.51 mg置50 mL量瓶中、梔子苷對照品63.12 mg置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解，定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液。再精密吸取以上對照品儲備溶液按照3∶2∶5的比例混合，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取本品10袋(批號：18010301)，混合，研細(xì)，取細(xì)粉約0.32 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性品溶液的制備 甲醇為空白溶液。

2.4 色譜條件 采用Chanin HPU-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以流動相A(乙腈)和流動相B(0.1%三氟乙酸溶液)進(jìn)行梯度洗脫(0～60 min，5%→60%A)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長為230 nm，進(jìn)樣量為20 μL，理論板數(shù)(n)按沒食子酸、川楝素和梔子苷計算均在4 000以上，分離度均大于1.5。對照品、樣品、陰性溶液色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.1中濃度為993.5 mg·L-1的沒食子酸對照品溶液、125.1 mg·L-1的川楝素對照品溶液和631.2 mg·L-1的梔子苷對照品溶液適量，加甲醇配成濃度為3.97、39.74、99.38、198.75、317.92、397.40 mg·L-1系列沒食子酸對照品溶液，0.42、0.83、1.67、4.17、6.67、8.34 mg·L-1系列川楝素對照品溶液和3.79、37.87、94.68、189.36、302.98、378.72 mg·L-1系列梔子苷對照品溶液，按2.4中的色譜條件測定峰面積，并且以峰面積(Y)對濃度(X)進(jìn)行線性回歸，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，得到線性方程：Y=11.708X-6.2641，r2=0.9999；Y=1.0629X+0.0034，r2=0.9998;Y=8.453X+9.1751，r2=0.9998;結(jié)果表明沒食子酸在3.97～397.40 mg·L-1，川楝素在0.42～8.34 mg·L-1，梔子苷在3.79～378.72 mg·L-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按照2.4中的色譜條件進(jìn)行測定，分別計算供試品溶液沒食子酸、川楝素和梔子苷的峰面積RSD。得沒食子酸、川楝素和梔子苷峰面積的RSD分別為0.5%，1.7%和1.3%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 精密度試驗 分別精密吸取2.5中沒食子酸濃度為317.92 mg·L-1、川楝素濃度為6.67 mg·L-1、梔子苷濃度為302.98 mg·L-1的對照品溶液，按2.4中的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄其峰面積，計算其RSD。得到?jīng)]食子酸、川楝素和梔子苷峰面積的RSD分別為0.4%，1.6%，0.9%(n=6)；結(jié)果表明該條件下儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗 稱取同一批次(批號：18010301)的三子顆粒，按2.2項下的方法平行制備6份供試液并依法測定。結(jié)果顯示沒食子酸、川楝素和梔子苷含量的RSD分別為1.7%，1.2%，1.8%(n=6)；表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的三子顆粒(含沒食子酸2.483%、川楝素0.050%、梔子苷2.227%)樣品粉末適量，計9份，每份約0.16 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液適量，揮干溶劑，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液，按2.4項下的色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率及RSD。結(jié)果見表1。

表1 沒食子酸、川楝素和梔子苷的含量加樣回收率測定結(jié)果(n=9)

續(xù)表1 沒食子酸、川楝素和梔子苷的含量加樣回收率測定結(jié)果(n=9)

2.10 樣品含量測定 按照2.2項下的供試品制備方法和2.4項下的色譜條件對3批樣品(批號：18010301、19050901、19091203)中沒食子酸、川楝素和梔子苷進(jìn)行測定，記錄其峰面積，計算其含量。結(jié)果見表2。

表2 3 批樣品中各成分含量測定結(jié)果

3 討論

三子顆粒是由訶子、川楝子、梔子組成，是一種常用的蒙藥。訶子能澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽，用于久瀉久痢，便血脫肛，肺虛喘咳，久嗽不止，咽痛音?。淮ㄩ觿t味苦性寒，行氣止痛、驅(qū)蟲，用于肝郁化火，胸脅、脘腹脹痛，疝氣疼痛，蟲積腹痛；梔子清熱利濕、瀉火除煩、涼血解毒，用于熱病心煩，淋證澀痛，濕熱黃疸，血熱吐衄，目赤腫痛，火毒瘡瘍，外治扭挫傷痛[2]。文獻(xiàn)報道訶子、川楝子及梔子的有效成分具有抗炎、解毒、改善免疫功能等作用，從而起到清肺胃熱、消炎解毒的作用，臨床多應(yīng)用于酒糟鼻[3]、嬰幼兒濕疹[4]、高血壓[5]、高脂血癥的治療[6]。

沒食子酸是訶子中的主要藥效成分，藥理研究表明其具有抗氧化作用[7]。川楝素則是川楝子的主要活性成分，具有抗腫瘤活性、抑制脂肪形成活性、殺蟲、拒食性等作用，但也具有一定的毒性，通常用它作為衡量川楝子藥材質(zhì)量的參考指標(biāo)[8]。梔子苷作為梔子的主要活性成分，具有保肝利膽、降糖、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗血栓等作用[9]。目前關(guān)于三子散的質(zhì)量控制已有相關(guān)文獻(xiàn)報道[2,10-14]，尚無用HPLC法對沒食子酸、川楝素和梔子苷的含量同時進(jìn)行測定的報道。本實驗采用高效液相色譜法同時測定沒食子酸、川楝素和梔子苷3 種成分的含量，對三子顆粒的質(zhì)量控制具有重要的參考意義。

本文在方法開發(fā)時對不同品牌和型號的色譜柱進(jìn)行了篩選，最終采用的色譜柱為Chanin HPU-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)。在流動相條件的考察中，參考了三子散中的含量測定方法[2]，但沒食子酸峰形不佳，后加入三氟乙酸，峰形得到改善，經(jīng)過研究，最終采用通過乙睛-0.1%三氟乙酸溶液進(jìn)行梯度洗脫的方法。

HPLC法進(jìn)行多成分檢測時，波長的選擇是其中的關(guān)鍵因素。本文通過DAD對3 種成分進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果表明沒食子酸的最大吸收波長為216 nm，川楝素的最大吸收波長為210 nm和梔子苷的最大吸收波長為242 nm，為了兼顧3 種成分同時測定的需求，故選擇230 nm作為三者的檢測波長。

本實驗采用的HPLC法同時測定三子顆粒中沒食子酸、川楝素和梔子苷的含量測定方法可行，該方法操作簡便，精密度高，重現(xiàn)性好，樣品回收率好，一測多評，能較全面地反映該制劑的質(zhì)量，為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。