甘麥龍骨湯對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠神經(jīng)遞質(zhì)、激素水平的影響

孫 麒，何建珉，王俊安，魏君萍，周 奕，王國(guó)華

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院·上海 200021；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院·上海 200011；3上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院·上海 200071)

甘麥龍骨湯系全國(guó)名老中醫(yī)王翹楚經(jīng)驗(yàn)方，在臨床上廣泛用于各類失眠癥的治療，療效顯著[1-2]。全國(guó)名老中醫(yī)王翹楚教授系上海市中醫(yī)醫(yī)院專家委員會(huì)主任委員，上海中醫(yī)藥大學(xué)終身教授，上海市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)睡眠學(xué)科奠基人、學(xué)術(shù)帶頭人。王老畢生致力于中醫(yī)睡眠疾病的理論創(chuàng)新、臨床及實(shí)驗(yàn)研究。甘麥龍骨湯系王老以《傷寒論》經(jīng)方柴胡加龍骨牡蠣湯為基礎(chǔ)，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)化裁所得[3]。目前該方已在臨床上被廣泛運(yùn)用，收效甚佳。從現(xiàn)代生物學(xué)角度探討其潛在的作用機(jī)制，有助于對(duì)該經(jīng)驗(yàn)方更深入的理解及其臨床推廣應(yīng)用。為了進(jìn)一步明確該方劑改善睡眠的可能作用機(jī)制，本文通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及激素水平的影響。報(bào)道如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠44 只，SPF級(jí)，4周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(滬)2018-0006。實(shí)驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)5 d,分籠飼養(yǎng)，每個(gè)籠內(nèi)4只大鼠，室溫維持在22～26 ℃，相對(duì)濕度55%～65%，晝夜循環(huán)，保持12 h光照，大鼠灌胃、添加飼料及換水等均由上海市中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心專人負(fù)責(zé)。

1.2 藥物及試劑 甘麥龍骨湯由上海市中醫(yī)醫(yī)院制備，藥方為：淮小麥27 g、甘草9 g、苦參9 g、蟬衣6 g、僵蠶9 g、明天麻9 g、嫩鉤藤15 g(后入)、葛根27 g、川芎12 g、軟柴胡9 g、煅龍骨27 g、廣郁金9 g、石菖蒲9 g、焦山梔9 g、黃芩12 g、赤白芍各12 g、紫丹參30 g、合歡皮27 g、夜交藤30 g。制備方法：首先用8倍于藥材的清水浸泡15 min，武火煮沸后改文火煎15 min，取出藥液；藥渣中加入6倍水量同法煎熬，取藥液；將兩次藥液混合煎熬，濃縮為990 mL(相當(dāng)于1.8 g生藥/mL),滅菌后分裝于4 ℃保存?zhèn)溆谩４笫笄傲邢偎谼2(PGD2)、5羥色胺(5-HT)、促甲狀腺激素(TSH)、去甲腎上腺素(NE)、皮質(zhì)酮/腎上腺酮(CORT)ELISA試劑盒均購(gòu)自上海科博瑞生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 Thermo Fresco-17離心機(jī)；Bio-Rad 680 酶標(biāo)儀；MMM-group恒溫培養(yǎng)箱；eppendorf移液器。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥及造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，用EXCEL中隨機(jī)數(shù)字發(fā)生器將44只大鼠隨機(jī)分入4 組，包括正常對(duì)照組、中藥組、模型組及模型+中藥組，每組11只。正常對(duì)照組及模型組接受0.9%氯化鈉注射液灌胃；中藥組及模型+中藥組接受甘麥龍骨湯灌胃，給藥比重為18 g/kg。4組大鼠均在每日上午9∶00接受灌胃給藥1次，連續(xù)10 d。中藥組1只大鼠灌胃時(shí)嗆入氣管死亡。慢性睡眠剝奪大鼠模型構(gòu)建采用改良多平臺(tái)水環(huán)境法[4]。睡眠剝奪箱(30 cm×30 cm×150 cm)內(nèi)中央放置11個(gè)直徑6 cm、高8 cm的平臺(tái)，平臺(tái)間隔15 cm。箱內(nèi)注水，使水面在平臺(tái)下約1cm，水溫維持在(20±2)℃；將實(shí)驗(yàn)大鼠放在箱內(nèi)平臺(tái)上，持續(xù)日光燈照射，自由攝食飲水，當(dāng)大鼠進(jìn)入睡眠REM階段時(shí)因觸水而驚醒，導(dǎo)致睡眠剝奪，每日睡眠剝奪時(shí)長(zhǎng)18 h(中午 12∶00 至次晨6∶00)，持續(xù)8周。對(duì)照為大平臺(tái)，直徑12 cm，大鼠在平臺(tái)上能夠進(jìn)入睡眠。4 組大鼠中，僅對(duì)模型組及模型+中藥組大鼠進(jìn)行造模。造模時(shí)間為72 h，從給藥第7天開(kāi)始。

2.2 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

2.2.1 行為學(xué)評(píng)價(jià) 采用Y-迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)。正式開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，將大鼠放入迷宮中先適應(yīng)3～5 min，采用隨機(jī)不休息法，無(wú)規(guī)則次序變換安全區(qū)，對(duì)大鼠所在支臂與另一支臂通電，動(dòng)物在電擊下逃竄至燈光區(qū)后再保持10 s或30 s為一次測(cè)試。然后動(dòng)物所在支臂為下次測(cè)試的起始位置進(jìn)行下一次測(cè)試。觀察指標(biāo)：①錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)：每個(gè)實(shí)驗(yàn)日進(jìn)行20次訓(xùn)練測(cè)試，一個(gè)實(shí)驗(yàn)日完成所有反應(yīng)中錯(cuò)誤反應(yīng)的次數(shù)。②主動(dòng)回避率：大鼠在燈亮后但未通電的5 s內(nèi)完成逃避反應(yīng)的次數(shù)占總反應(yīng)次數(shù)的百分率。安全區(qū)燈亮，電刺激尚未開(kāi)始時(shí)，大鼠即逃往安全區(qū)說(shuō)明明暗辨別條件反射(即主動(dòng)回避反應(yīng))形成[4]。

2.2.2 腦脊液和血清PGD2及血清5-HT、TSH、NE、CORT含量測(cè)定 動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦脊液及血標(biāo)本。用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，采用直視下劃破硬脊膜抽取大鼠腦脊液約100 μL，置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。采用ELISA法測(cè)定腦脊液中PGD2的濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。取完腦脊液后，迅速腹腔靜脈取血4 mL，冰浴靜置0.5 h，然后在4 ℃環(huán)境中3 000 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?，采用ELISA法測(cè)定血清PGD2、5-HT、TSH、NE、CORT的含量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。正常對(duì)照組1只大鼠血標(biāo)本溶血，模型+中藥組1只大鼠抽取腦脊液失敗。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

3.2 各組大鼠腦脊液和血清PGD2含量的比較 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦脊液及血清PGD2水平比較

3.3 各組大鼠血清5-HT、NE、TSH及CORT含量的比較 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清5-HT、NE、TSH及CORT含量比較

4 討論

根據(jù)“心主神明”理論，古代醫(yī)家論治失眠多“從心辨治”；而王翹楚教授另辟蹊徑，首倡“從肝論治失眠”理論，認(rèn)為現(xiàn)代人失眠多伴“情志問(wèn)題”(情緒過(guò)激或心情不暢)，因“肝氣被郁”故而發(fā)為失眠；因此當(dāng)結(jié)合現(xiàn)代人的身心特點(diǎn)從肝論治失眠[3]，甘麥龍骨湯系“從肝論治失眠”理論下的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。甘麥龍骨湯方中淮小麥、甘草、苦參具有除煩安神、開(kāi)郁散結(jié)之效；蟬衣、僵蠶可息風(fēng)止痙、鎮(zhèn)靜安神；柴胡疏肝解郁；龍骨、牡蠣平肝潛陽(yáng)、鎮(zhèn)靜安神；天麻、鉤藤平抑肝陽(yáng)；葛根、川芎活血解肌、祛風(fēng)止痛；郁金、菖蒲解郁開(kāi)竅安神；焦山梔、黃芩清肝經(jīng)濕熱、瀉火除煩；赤、白芍活血柔肝配合丹參活血安神；合歡皮有晝開(kāi)夜合之特性，能安五臟、和心志，令人歡樂(lè)無(wú)憂；夜交藤亦養(yǎng)心安神。諸藥相合，理氣疏肝、行氣解郁、除煩安神，共奏促眠之功[5]。

本研究通過(guò)建立慢性睡眠剝奪大鼠模型，客觀評(píng)價(jià)了名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方甘麥龍骨湯對(duì)大鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)及激素水平的影響。在本研究中，通過(guò)行為學(xué)評(píng)價(jià)可觀察到模型組大鼠錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多，主動(dòng)回避率明顯減少，說(shuō)明睡眠剝奪損害了大鼠的學(xué)習(xí)、記憶和空間認(rèn)知等能力；而與之相比，模型+中藥組的錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，主動(dòng)回避率明顯增多，說(shuō)明給予中藥后，可以減輕睡眠剝奪對(duì)大鼠學(xué)習(xí)、記憶和空間認(rèn)知等能力的損害。

已有研究指出，PGD2是目前已知最有潛力的內(nèi)源性促睡眠物質(zhì)之一，鼠腦脊液中PGD2濃度與睡眠-覺(jué)醒周期一致，呈現(xiàn)節(jié)律性改變，并且隨睡眠剝奪期間嗜睡傾向增加而增加[6-7]。5-HT能神經(jīng)元在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛存在，研究顯示調(diào)節(jié)睡眠/覺(jué)醒的藥物中發(fā)現(xiàn)多數(shù)藥物是通過(guò)5-HT受體的不同亞型發(fā)揮作用[8-9]，因此對(duì)5-HT神經(jīng)元及其受體特性的深入研究對(duì)推進(jìn)臨床上與睡眠/覺(jué)醒調(diào)節(jié)障礙相關(guān)疾病的治療可能有重要意義。NE神經(jīng)元在調(diào)節(jié)睡眠/覺(jué)醒過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，MALLICK等[10]研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪會(huì)影響海馬體區(qū)NE水平，短時(shí)間會(huì)導(dǎo)致其濃度增加而長(zhǎng)時(shí)間則會(huì)降低濃度，表明海馬體內(nèi)NE水平對(duì)睡眠高度敏感且時(shí)間不同影響不一[11]。TSH和CORT也是參與睡眠調(diào)節(jié)的重要的內(nèi)源性物質(zhì)，其分泌過(guò)程具有脈沖節(jié)律性特點(diǎn)，并受多種因素的影響，其分泌紊亂可導(dǎo)致睡眠/覺(jué)醒障礙[12-13]。為了探尋甘麥龍骨湯減輕睡眠剝奪造成腦功能損害的可能機(jī)制，本研究檢測(cè)了腦脊液及血液中上述幾種與睡眠功能密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)和激素。結(jié)果顯示，經(jīng)慢性睡眠剝奪后，大鼠腦脊液、血清PGD2水平及血清5-HT、NE、TSH和CORT水平均顯著升高；而與之相比，通過(guò)中藥灌胃后，上述異常升高的指標(biāo)則明顯下降。因此，筆者推斷甘麥龍骨湯的促眠機(jī)制可能與此相關(guān)。

綜上所述，甘麥龍骨湯可減輕慢性睡眠剝奪對(duì)大鼠神經(jīng)功能的損害，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)腦脊液及外周血清PGD2及血清5-HT、TSH、NE水平實(shí)現(xiàn)的。