去甲烏藥堿的藥理作用和含量測(cè)定的研究進(jìn)展*

張曉麗 綜述，遲名鋒,張 寧,郭承軍△ 審校

(1.山東省運(yùn)動(dòng)康復(fù)研究中心，山東 濟(jì)南 250102；2.萊西市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266600)

去甲烏藥堿(HG)屬于芐基異喹啉類(lèi)生物堿，是存在于烏頭、附子、蓮子心、細(xì)辛等中藥材中的強(qiáng)心成分。其藥理作用比較廣泛，具有強(qiáng)心、舒張血管、擴(kuò)張支氣管、緩解哮喘癥狀、抗氧化、保護(hù)細(xì)胞、抗炎、抗腫瘤等作用。常用的含量檢測(cè)方法有高效液相色譜高效液相色譜-紫外檢測(cè)(HPLC-UV)、高效液相色譜-熒光檢測(cè)(HPLC-FLD)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)及近年發(fā)展起來(lái)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法等。本文對(duì)HG結(jié)構(gòu)、藥理作用和含量測(cè)定方法等方面進(jìn)行綜述如下。

1 HG的結(jié)構(gòu)

HG為1-對(duì)羥芐基-1,2,3,4-四氫異喹啉類(lèi)生物堿，英文名稱(chēng)為Higenamine或1-(4-hydroxybenzyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-6,7-diol；美國(guó)化學(xué)文摘服務(wù)社編號(hào)：5843-65-2；分子式：C16H17NO3；相對(duì)分子質(zhì)量：271.314；化合物結(jié)構(gòu)式如下圖1。HG是β2激動(dòng)劑類(lèi)藥物，具有刺激β-腎上腺素受體、增強(qiáng)心肌的收縮力、舒張血管的作用，在臨床上可被用作強(qiáng)心劑[1-3]。

2 HG藥理作用的研究進(jìn)展

2.1強(qiáng)心作用 韋震鳴等[4]等研究發(fā)現(xiàn)，HG可抑制心肌纖維化，改善左室重構(gòu)，從而改善腎功能，阻斷心腎交互，發(fā)揮心腎保護(hù)作用。HG對(duì)離體蛙的心臟，兔的在體心臟皆有明顯的強(qiáng)心功效[5]。新西蘭兔病竇綜合征模型發(fā)現(xiàn)，HG可用于治療由竇房結(jié)損傷引起的心律失常[6]。ZHANG等[1]的研究表明，HG靜脈輸注22.5 μg/kg可增加心率，改善緩慢性心律失?；颊叩母]房結(jié)阻滯和房室傳導(dǎo)阻滯。JIN-XING等[7]的研究表明，HG通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)和CFs激活，部分地改善了病理性心臟纖維化和功能障礙。TING等[8]的研究表明，HG治療后可顯著減少新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞膠原合成，抑制新生大鼠心臟纖維化，其機(jī)制可能是通過(guò)ASKI信號(hào)通路改善心腎綜合征大鼠的心腎纖維化。在治療緩慢性心律失常方面，HG的效果可能優(yōu)于異丙腎上腺素，且比異丙腎上腺素更安全[9]。

2.2舒張心血管作用 研究表明[10]，HG在心血管系統(tǒng)方面的治療作用較為明顯，可通過(guò)作用受體舒張血管平滑肌達(dá)到抑制血小板聚集與抗血栓形成的目的，尤其是對(duì)腎上腺素誘發(fā)血小板聚集的抑制作用最強(qiáng)。在正常血壓、自發(fā)性高血壓誘發(fā)高血壓的動(dòng)物模型中，HG靜脈注射0.001～3.000 mg/kg可發(fā)揮降血壓作用，但HG在降血壓方面的作用機(jī)制尚不明確。翁嘉灝等[11]的研究表明，HG能抑制大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移與增殖,且呈劑量依賴(lài)性。推測(cè)HG可能具有預(yù)防血管再狹窄的作用。XIAOPING等[12]的研究表明，HG減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。在腦缺血再灌注大鼠模型中，HG改善了神經(jīng)的功能狀態(tài)，顯著抑制了缺血再灌注誘導(dǎo)的血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL)如IL-1、IL-6和IL-18，以及CD14+細(xì)胞水平的升高，同時(shí)減輕了軸突神經(jīng)變性。數(shù)據(jù)表明，HG對(duì)腦缺血再灌注損傷有治療作用。

2.3對(duì)支氣管哮喘的作用 研究表明，HG通過(guò)激動(dòng)β2受體來(lái)達(dá)到放松氣管的目的。GANG等[13]在細(xì)辛中篩選具有β2受體激動(dòng)劑活性的化合物時(shí)，發(fā)現(xiàn)了有效化合物HG，HG對(duì)于由組胺引起的豚鼠哮喘可以起到保護(hù)性作用。

2.4抗氧化保護(hù)細(xì)胞作用 成蒙蒙等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HG對(duì)過(guò)氧化氫引起的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。HG可用于治療缺血性腦損傷[15]，通過(guò)抵抗低氧損傷，保護(hù)腦細(xì)胞。大鼠腹腔注射一定劑量的HG后，可以明顯減少腦梗死面積及致死率。XIAOJUAN等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，HG雖不影響活性氧(ROS)水平和PI3K/Akt信號(hào)，但減弱IL-1β誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和PI3K/Akt信號(hào)抑制，從而通過(guò)ROS介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)減輕白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的人髓核細(xì)胞凋亡。YANG等[17]的研究表明，HG通過(guò)激活A(yù)kt/GSK3β途徑，顯著保護(hù)AlCl3誘導(dǎo)的記憶和學(xué)習(xí)障礙、鋁超載、乙酰膽堿酯酶過(guò)度活躍、淀粉樣β負(fù)荷和腦組織凋亡，從而保護(hù)阿爾茨海默病患者的神經(jīng)。OMER等[18]的研究表明，單劑量給予HG對(duì)缺血再灌注引起的睪丸氧化損傷具有保護(hù)作用。YI等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，HG改善了氧-葡萄糖剝奪/再灌注(OGD/R)誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷。HG減弱了OGD/R對(duì)ROS和丙二醛產(chǎn)生的誘導(dǎo)，以及對(duì)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的抑制。此外，HG抑制Caspase-3活性和Bax表達(dá)的增加，抑制Bcl-2表達(dá)的降低，提高了p-Akt、血紅素氧合酶-1(HO-1)和核因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)的表達(dá)水平，從而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受損傷。

2.5抗炎作用 HG還具有抗炎作用。XIAOHAN[20]的研究表明，HG可明顯減輕過(guò)敏性鼻炎小鼠的摩擦和打噴嚏，減輕肺和鼻組織的組織病理學(xué)變化。此外，HG可以降低過(guò)敏性鼻炎小鼠血清中IgE、組胺和IL-4的水平，并調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的失衡。通過(guò)激活A(yù)KT1和抑制EGFR/JAK2/c-JUN信號(hào)減輕過(guò)敏性鼻炎。

2.6抗腫瘤作用 研究發(fā)現(xiàn)，HG具有抗腫瘤作用，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。宋莉等[21]通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HG抗腫瘤作用的機(jī)制可能是誘導(dǎo)心臟分泌心鈉肽(ANP)等肽類(lèi)激素釋放，促進(jìn)HT-29結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制結(jié)腸癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。金子淇[22]的研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆素B可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),HG主要通過(guò)對(duì)SKBR3、T47D細(xì)胞的抑制增殖、阻滯周期及誘導(dǎo)凋亡作用來(lái)提高抗腫瘤效果。HG和葫蘆素B合用對(duì)SKBR3裸鼠移植瘤模型也有協(xié)同抑制作用。HG和葫蘆素B可能通過(guò)抑制AKT與CDK2相互作用來(lái)協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。YUAN等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，HG對(duì)LSD1表現(xiàn)出可接受的效力和對(duì)賴(lài)氨酸脫甲基酶(LSD1)的高選擇性。Higenamine顯著增加混合血統(tǒng)白血病(MLL)重排型細(xì)胞MV4-11和MOLM-13中LSD1底物H3K4me1和H3K4me2的表達(dá)，但對(duì)LSD1和H3K4Me3幾乎沒(méi)有影響。同時(shí)，Higenamine劑量依賴(lài)性地抑制白血病細(xì)胞系中過(guò)度表達(dá)的HOXA9和MES1水平。HG誘導(dǎo)MV4-11和MOLM-13細(xì)胞分化，同時(shí)增加CD11b、CD14和CD86的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制集落形成，但不顯著抑制白血病細(xì)胞增殖。此外，在MV4-11細(xì)胞中，HG以LSD1依賴(lài)的方式顯著改變了p53的表達(dá)水平。因此，HG作為一種強(qiáng)效、選擇性和細(xì)胞活性的天然LSD1抑制劑用于MLL重排型的治療。

2.7HG藥動(dòng)學(xué)相關(guān)研究進(jìn)展 CHI-FANG等[24]第1次研究了HG在兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)。靜脈給藥HG后，隨著時(shí)間的變化，血藥濃度成雙指數(shù)型下降，平均半衰期為22 min。鄭英麗等[25]研究HG在米格魯獵兔犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，得到半衰期為8.60 min。董玲娜[26]進(jìn)行了HG的UGC代謝機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)大鼠存在顯著性的性別差異，狗在中濃度和高濃度存在顯著性差異，但在小鼠和人中無(wú)明顯性別差異。張盼盼等[27]采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)同時(shí)進(jìn)行尿樣中痕量烏頭堿等生物堿的含量測(cè)定。楊志勇等[28]以甲睪為內(nèi)標(biāo)，甲基叔丁基醚為萃取溶劑，運(yùn)用HPLC-MS技術(shù)定性檢測(cè)人尿中8種禁用成分，滿(mǎn)足世界反興奮劑機(jī)構(gòu)對(duì)此類(lèi)藥物最低檢測(cè)能力的要求。常巍等[29]運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對(duì)人尿液中34種小肽類(lèi)禁用物質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定。張志清等[30]將待測(cè)血樣、尿樣進(jìn)行定性分析，離心處理后，過(guò)固相萃取小柱，洗脫、吹干、定容，運(yùn)用飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高，能夠快速檢測(cè)檢材中烏頭類(lèi)生物堿。

3 HG的含量測(cè)定研究進(jìn)展

HG作為芐基異喹啉類(lèi)生物堿，近年來(lái)作為食源性興奮劑的檢出率呈上升態(tài)勢(shì)[31]，世界反興奮劑機(jī)構(gòu)在2017年的《世界反興奮劑國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)禁用清單》中將HG明確列為β2激動(dòng)劑類(lèi)，賽內(nèi)賽外均禁用[32]。食源性興奮劑可在植物體內(nèi)天然存在，如蓮子和蓮子心中天然存在的某些生物堿類(lèi)成分，可發(fā)揮鎮(zhèn)靜、抗心律失常效果；甘草中的某些成分能發(fā)揮類(lèi)固醇激素作用[33]。HG存在于多種中藥材及調(diào)味品中，首先在附子中分離得到，后在黃柏、花椒、地膚子、細(xì)辛中陸續(xù)檢出。

國(guó)外學(xué)者PINAR等[34]用一次性鉛筆石墨電極測(cè)定了膳食補(bǔ)充劑中的HG，結(jié)果表明在0.44 V時(shí)的氧化峰電流與0.05～2.00 μg/cm3[(1.63×10-7)～(6.5×10-6) mol/dm3]范圍內(nèi)的HG濃度(以鹽酸鹽形式)之間具有極好的相關(guān)性，但是其操作復(fù)雜，檢測(cè)限僅限于μg級(jí)別的檢測(cè)，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足pg、ng級(jí)別的檢測(cè)。

陳寶玲等[35]采用苯基色譜柱對(duì)HG進(jìn)行HPLC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HG在酸性條件下的離子化程度較高，色譜峰對(duì)稱(chēng)性好，敏感度更高。田海峰[36]通過(guò)HPLC測(cè)定了北細(xì)辛、附子、蓮子心中HG的含量分別為84 mg/kg、22 mg/kg、920 mg/kg。受當(dāng)時(shí)檢測(cè)器的限制，對(duì)于只有ppm級(jí)別痕量的HG來(lái)說(shuō)，其測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度值得商榷?；輵?zhàn)鋒等[37]通過(guò)HPLC研究發(fā)現(xiàn)，以甲醇進(jìn)行超聲提取，對(duì)HG的提取效果更好。

隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，ng、pg級(jí)別的準(zhǔn)確測(cè)定已不是問(wèn)題。目前測(cè)定中藥中HG含量最為準(zhǔn)確的方法就是UPLC-MS/MS測(cè)定，但有關(guān)的分析檢測(cè)報(bào)道還較少。STAJIC[38]應(yīng)用UPLC-MS/MS方法檢測(cè)了營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑中HG的含量。有學(xué)者采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)建立了數(shù)種藥材中HG的測(cè)定方法[39-40]，并檢測(cè)出花椒、桂皮、十三香、黑胡椒、白胡椒和香葉共6種香辛料樣品中的HG含量。王晗等[41]應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)檢測(cè)中藥材、調(diào)味品及外敷藥物中的HG含量。

4 小 結(jié)

綜上所述，HG屬于芐基異喹啉類(lèi)生物堿，其作為β2激動(dòng)劑類(lèi)物質(zhì)，是自然界中普遍存在的一類(lèi)生物堿，存在于多種中藥材或日常飲食調(diào)味品中，但目前對(duì)此文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量較少。HG的藥理作用主要是強(qiáng)心、抗氧化保護(hù)腦損傷、緩解支氣管哮喘、抗炎、抗腫瘤等。

關(guān)于中藥中HG的檢測(cè)文獻(xiàn)報(bào)道仍很少，而目前常用于食源性興奮劑檢測(cè)的方法有酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、HPLC-UV、HPLC-MS、HPLC-MS/MS。酶聯(lián)免疫法由于抗體理化性質(zhì)不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；氣相色譜法檢測(cè)涉及衍生操作，步驟較為繁瑣且適用性窄；HPLC-UV檢測(cè)敏感度低、檢測(cè)限太高，對(duì)于在中藥材中的含量?jī)H有ppm級(jí)的HG來(lái)說(shuō)，檢測(cè)的準(zhǔn)確度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。HPLC-MS成為微量成分含量測(cè)定的常用方法，已廣泛應(yīng)用于獸藥殘留的檢測(cè)，目前相關(guān)文獻(xiàn)及我國(guó)現(xiàn)行有效的食源性興奮劑檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法大多采用HPLC-MS進(jìn)行檢測(cè)。HPLC-MS雖然敏感度高，但分辨率和質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度較低，無(wú)法滿(mǎn)足高通量篩選分析的要求，且存在基質(zhì)干擾嚴(yán)重、化合物裂解、碎片信息量少等問(wèn)題。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，具有分辨率高、采集速率快，且能夠獲得精確一級(jí)質(zhì)量數(shù)、豐富的碎片離子信息和同位素比例信息等優(yōu)點(diǎn)的UPLC-MS/MS技術(shù)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。UPLC-MS/MS檢測(cè)具有敏感度高、步驟少、選擇性高等優(yōu)勢(shì)，已越來(lái)越多地用于微量、痕量物質(zhì)的檢測(cè)。