miRNA let7對小鼠腦組織基因表達(dá)譜的影響研究

伊力亞斯·艾薩，卡哈爾江·艾力，阿布力米提·麥提圖蓀，付 瑾

(新疆維吾爾醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校藥學(xué)系，新疆 和田 848000)

miRNA是一類在所有生命體中高度保守、長度為18～22個核苷酸的非編碼RNA[1]。miRNA通過與mRNA的3′ UTR區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合來沉默或者下調(diào)靶基因表達(dá)水平，以行使其對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[2]。相關(guān)研究已證實(shí)，miRNA參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，如增殖、分化、凋亡等[3]。因此，miRNA的異常將會導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生、發(fā)展。人類基因組可編碼超過1 917個miRNA，約30%的mRNA可作為miRNA的靶基因，且一種miRNA可以對應(yīng)調(diào)節(jié)多種靶基因表達(dá)[4-5]。因此，miRNA可作為重要的調(diào)控因子，參與并調(diào)節(jié)許多生理生化過程。

let7是最初在線蟲中發(fā)現(xiàn)的一類由13個成員組成的miRNA家族，由于其序列的高度保守性及家族成員之間序列的相似性，let7在包括線蟲、人類及其他物種中作為重要的調(diào)節(jié)因子調(diào)控細(xì)胞的許多生物學(xué)過程[6- 7]。一系列體內(nèi)、外研究已證實(shí)，let7可通過調(diào)控癌基因、抑癌基因的表達(dá)水平來影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。同時，let7本身的表達(dá)水平也受到某些腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控，如p53突變體、Twist、MYC等[10-11]。因此，在腫瘤患者的診斷及其預(yù)后評價(jià)中，let7水平可以作為臨床診斷治療的生物標(biāo)志物。關(guān)于let7對腫瘤及其他疾病影響的分子機(jī)制仍不明確，許多問題有待進(jìn)一步研究。

有研究報(bào)道，let7在腦組織中誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，以清除有害蛋白聚集體，如α-核突觸蛋白及損傷老化的線粒體，從而減輕帕金森病、阿爾茨海默病患者的癥狀[12]。眾所周知，自噬受mTOR信號通路調(diào)節(jié)，該通路是代謝信息整合的焦點(diǎn)，mTORC1在平衡生物合成和分解代謝中具有核心作用。在mTORC1的各種輸入中，氨基酸感應(yīng)途徑最為有效。在此前的研究中，基于對營養(yǎng)缺乏神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組(GSE60848)分析，確定let7是一種能夠促進(jìn)神經(jīng)元自噬的miRNA。let7通過下調(diào)氨基酸感應(yīng)途徑來激活自噬，從而阻止mTORC1激活。let7在腦內(nèi)誘導(dǎo)自噬，并在多聚谷氨酰胺病的慢病毒模型中大大減少蛋白質(zhì)聚集。因此，let7在高等生物的營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起著核心作用。let7除在腦組織誘導(dǎo)自噬外，研究人員也在脂肪組織、骨骼肌等其他組織中觀察到自噬水平的升高，推測let7除了具有調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自噬水平外，在調(diào)控整個機(jī)體能量和蛋白質(zhì)代謝也發(fā)揮了中心作用。為從分子水平研究let7的作用機(jī)制，本研究利用生物信息學(xué)研究方法分析了let7敲低的小鼠腦組織mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，并初步構(gòu)建let7-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以探索let7發(fā)揮生物學(xué)功能的分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 從GEO公共數(shù)據(jù)庫檢索并下載GSE60848數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含了2對let7敲低的小鼠腦組織樣本和2對正常腦組織樣本。本項(xiàng)研究中所有樣本均利用GPL1261平臺進(jìn)行檢測，并利用GEO2R在線分析工具進(jìn)行基因的表達(dá)分析，以獲得基因表達(dá)矩陣。將統(tǒng)計(jì)值P<0.05及差異表達(dá)倍數(shù)值log2|FC|>1作為差異表達(dá)基因篩選閾值，進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，并繪制相應(yīng)的火山圖。

1.2方法

1.2.1差異表達(dá)基因的功能注釋和信號通路富集分析 首先，利用DAVID在線生物數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換，將所有差異表達(dá)基因的基因名稱(Gene Symbol)轉(zhuǎn)換成基因標(biāo)識符(Entrze ID)。其次，進(jìn)一步將轉(zhuǎn)換得到的差異表達(dá)基因標(biāo)識符輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，對其進(jìn)行基因功能注釋和KEGG信號通路富集分析。最后，對分析得到的結(jié)果進(jìn)行篩選，將校正后的統(tǒng)計(jì)值P<0.05作為篩選條件，篩選出滿足條件的條目，并利用R軟件包對篩選結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.2確定關(guān)鍵基因并構(gòu)建let7-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 利用STRING數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，評價(jià)并篩選分析結(jié)果，將綜合評分大于0.4的相互作用節(jié)點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7軟件，構(gòu)建差異基因的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步應(yīng)用Cytoscape軟件的MCODE插件分析蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中具有密切相互作用的子網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步利用CytoHubba插件確定關(guān)鍵基因。設(shè)置MCODE插件參數(shù)如下：Degree Cutoff=12，其余默認(rèn)。

2 結(jié) 果

2.1差異表達(dá)基因的篩選 利用GEO2R在線分析工具對GSE60848數(shù)據(jù)集進(jìn)行處理分析，發(fā)現(xiàn)一共分析處理了45 101個基因。通過對其分析結(jié)果的篩選發(fā)現(xiàn)，表達(dá)上調(diào)的基因69個，表達(dá)下調(diào)的基因8個(圖1)。

2.2差異表達(dá)基因的功能注釋與通路富集分析 利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對篩選出的77個差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能注釋分析與KEGG信號通路富集分析。以校正后的統(tǒng)計(jì)值P進(jìn)行篩選并排列，最后利用R軟件對其結(jié)果進(jìn)行可視化處理。GO功能富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)的基因主要與免疫應(yīng)答、抗原遞呈、GTP酶活性、GTP連接等生物學(xué)過程密切相關(guān)。KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)的基因主要富集在糖代謝、細(xì)胞黏附、抗原加工提呈、吞噬小體等信號通路(結(jié)果見表1、表2)。

表1 差異表達(dá)基因的功能富集分析結(jié)果

表2 差異表達(dá)基因的功能富集分析結(jié)果

2.3蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析 通過STRING在線分析工具，對篩選出的77個差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，排除其中互作評分小于0.4的蛋白，并將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化處理。為進(jìn)一步確定其中的關(guān)鍵基因，本研究中利用MCODE插件對PPI互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選了評分最高的子網(wǎng)絡(luò)，并利用cytoHubba插件子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，計(jì)算節(jié)點(diǎn)得分，共篩選排名前10的關(guān)鍵基因，分別為TRIM30A、GBP3、PARP14、IFIT2、RTP4、IFI44、OASL2、IFIT1、IFIT3、IRF7，見圖2。

3 討 論

隨著對非編碼RNA領(lǐng)域的深入了解，越來越多的研究表明，miRNA在真核生物體內(nèi)參與調(diào)解幾乎所有的生理病理過程。一種miRNA通過調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，在生物體內(nèi)組成了非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物信息科學(xué)的蓬勃發(fā)展，以及高通量測序技術(shù)的愈加成熟，都為研究復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。本研究正是利用在線GEO公共數(shù)據(jù)庫，并借助生物信息學(xué)研究方法，從分子水平系統(tǒng)地闡釋了let7對機(jī)體發(fā)揮作用的可能機(jī)制。let7是目前為止研究最為廣泛的miRNA之一，由于其在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的表達(dá)量會發(fā)生改變，導(dǎo)致其下游轉(zhuǎn)錄因子、mRNA和功能蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也發(fā)生改變，最終引起整個機(jī)體生命狀態(tài)的異常。因此，深入挖掘let7的分子調(diào)控功能機(jī)制將為疾病的早期預(yù)警、靶向治療和預(yù)后分析提供理論基礎(chǔ)。

越來越多的證據(jù)已經(jīng)揭示了let7在癌癥中的作用。在肺癌患者中，let7表達(dá)下調(diào)與肺癌組織RAS基因表達(dá)升高相一致。隨后，這種let7依賴性RAS表達(dá)升高在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中得到進(jìn)一步證實(shí)，提示let7通過抑制RAS而阻斷腫瘤的發(fā)生[13]。除了靶向RAS外，let7還調(diào)節(jié)高遷移率族蛋白A2(HMGA2)的表達(dá)。HMGA2是一個早期胚胎癌基因，其在干細(xì)胞中過度表達(dá)并與干細(xì)胞自我更新密切相關(guān)[14]。干細(xì)胞中l(wèi)et7低表達(dá)與HMGA2的高表達(dá)相一致，這種表達(dá)模式可維持干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。當(dāng)干細(xì)胞分化時，let7表達(dá)水平明顯升高，并通過識別HMGA2基因3，UTR上的多個結(jié)合位點(diǎn)，下調(diào)HMGA2的表達(dá)。最近的一項(xiàng)研究表明，let7的異位表達(dá)通過下調(diào)RAS和HMGA2的表達(dá)，抑制乳腺癌小鼠模型的細(xì)胞生長和乳房球形成[15]。此外，研究發(fā)現(xiàn)let7通過抑制細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，如細(xì)胞周期蛋白A、D1、D3和CDK4，來抑制腫瘤細(xì)胞的非錨定依賴性生長和細(xì)胞周期進(jìn)展[16-17]。

在許多生物學(xué)過程中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了miRNA表達(dá)譜的改變。miRNA在許多病理生理過程中受轉(zhuǎn)錄后機(jī)制的調(diào)控，因?yàn)槌跫塵iRNA的水平常常與其成熟形式的水平不一致。let7轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的證據(jù)來自對小鼠胚胎的研究，成熟的let7a、let7c和let7e只能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的早期被檢測到，而其前體的水平在神經(jīng)發(fā)育過程中保持穩(wěn)定[18]。let7在發(fā)育過程中的時間表達(dá)模式受到多種蛋白質(zhì)因子的復(fù)雜調(diào)控。研究人員已經(jīng)鑒定出數(shù)種與let7成熟有關(guān)的RNA結(jié)合蛋白，這些蛋白識別let7的前體并影響其生物發(fā)生。

let7是一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，同時參與了正常發(fā)展和癌癥。了解let7的功能及其調(diào)控途徑對當(dāng)前藥物研究具有重要意義。let7調(diào)控基因的研究已經(jīng)大大提高了人們對miRNA基因轉(zhuǎn)錄、剪接和成熟的認(rèn)識。因此，對let7的整體調(diào)控及其發(fā)生機(jī)制的研究將為let7的調(diào)控提供關(guān)鍵信息，并具有巨大潛力。本研究基于GEO2R在線分析工具，分析篩選了let7缺失的小鼠腦組織中差異表達(dá)的mRNA，結(jié)果顯示，共有77個差異表達(dá)的基因，其中上調(diào)的有69個，下調(diào)的有8個。let7敲除后篩選出的這些上調(diào)基因很好地闡釋了miRNA所起到的調(diào)節(jié)功能，即miRNA通過與靶基因特定保守區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制或沉默其表達(dá)水平。然而，本研究中出現(xiàn)少量下調(diào)的基因，其可能受到let7的間接調(diào)控，從而導(dǎo)致其表達(dá)水平降低。為進(jìn)一步整體分析let7的分子功能，本研究對所有差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)let7缺失導(dǎo)致差異表達(dá)的基因主要參與免疫應(yīng)答、抗原遞呈、GTP酶活性與GTP連接活性等生物學(xué)過程，表明let7的功能可能與免疫、細(xì)胞骨架、代謝等過程密切相關(guān)。有研究證明，let7能夠在癌癥疾病中影響基因表達(dá)變化，如前列腺癌[19-20]、肺癌[21]、甲狀腺癌[22]等。此外，miR-let7家族已被證實(shí)在心血管疾病、糖尿病、血管平滑肌炎性反應(yīng)、增殖和凋亡中都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[23-24]。結(jié)合目前關(guān)于let7家族的相關(guān)研究及本研究結(jié)果可知，let7家族作為一種關(guān)鍵的信號分子，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控，最終影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。KEGG信號通路富集分析結(jié)果表明，let7主要參與糖代謝、細(xì)胞黏附、抗原加工提呈、吞噬小體等信號通路。這些相關(guān)信號通路對let7發(fā)揮生物學(xué)功能高度敏感且有效。如抗原提呈加工信號通路作為免疫反應(yīng)的起始階段，對發(fā)動整個免疫應(yīng)答過程必不可少，而細(xì)胞黏附相關(guān)信號通路又是免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移及創(chuàng)傷愈合等一系列重要病理生理過程的共同分子基礎(chǔ)。在一項(xiàng)自身免疫性腦脊髓炎動物模型研究中，研究人員已經(jīng)證明let7通過負(fù)調(diào)控致病性輔助性T細(xì)胞17(Th17)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)增殖、分化和趨化因子介導(dǎo)的遷移，從而發(fā)揮保護(hù)作用[25]。除此之外，另有研究表明，let7家族通過PI3K/AKT信號通路[26]、Wnt/β-Catenin信號通路[8]、MAPK信號通路[27]和Lin28/let7等信號通路[28]參與免疫應(yīng)答、生長、代謝、增殖、凋亡等重要的生物學(xué)過程。目前，let7家族可作為一種生物標(biāo)志物，用于合理、精確的臨床診斷，從而提高患者的生存率[29]。

差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)被用于進(jìn)一步推測let7在生理狀態(tài)下影響生物信號及生物功能的反應(yīng)機(jī)制，其結(jié)果顯示，TRIM30A、GBP3、PARP14、IFIT2、RTP4、IFI44、OASL2、IFIT1、IFIT3、IRF7等10個關(guān)鍵基因與let7組成核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與調(diào)控基因表達(dá)過程。這提示let7可能直接或間接地通過靶向調(diào)控上述核心基因的表達(dá)，對整個生物系統(tǒng)生長、發(fā)育、分化及其他生物學(xué)功能實(shí)現(xiàn)影響。另外，通過對這些核心基因的文獻(xiàn)回顧與調(diào)查發(fā)現(xiàn)，截至目前，這些基因已被證實(shí)主要參與DNA損傷修復(fù)、炎癥、免疫、代謝等過程，這一方面提示本項(xiàng)研究結(jié)果的可靠性；另一方面對let7的基礎(chǔ)研究提供了新的研究思路和方向，也為探索發(fā)現(xiàn)let7家族新的作用靶點(diǎn)及其密切相關(guān)疾病的診斷、治療、預(yù)后提供寶貴的研究基礎(chǔ)。