間充質(zhì)干細胞外泌體對腹膜間皮細胞高糖損傷的作用研究

紀鷗洋 方均燕 宋阿會 佟琰 魏珊 陳志豪 劉英莉

腹膜透析（Peritoneal dialysis，PD）是終末期腎?。‥nd－stage renal disease，ESRD）的主要治療方法之一[1]。腹膜炎是腹膜透析患者住院治療、腹透失敗、轉(zhuǎn)換成血液透析的最常見原因之一?；颊唛L期反復(fù)發(fā)生腹膜炎會導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)和功能改變，嚴重影響腹膜超濾、透析效能[2]。腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的發(fā)生與腹膜超濾失敗的具體分子機制仍不清楚，近年來有多項研究提示腹膜細胞炎癥損傷、新生血管及腹膜纖維化形成是該過程的幾個重要特征性改變[3]。在長時間高滲高糖腹膜透析液的作用下，葡萄糖降解產(chǎn)物會刺激腹膜間皮細胞產(chǎn)生活性氧類（ROS）、分泌炎癥因子，使細胞長期處于微炎癥狀態(tài)，進而導(dǎo)致新生血管形成和腹膜組織的纖維化[4－5]。間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是人體最重要的成體干細胞之一，來源廣泛、增殖快，并具有低免疫原性和多項分化潛能。研究證實，MSCs 的作用是通過旁分泌途徑來實現(xiàn)的，并且其與免疫調(diào)節(jié)、趨化、抗凋亡和血管生成等機制密切相關(guān)[6－7]。MSCs 相比于其他細胞能產(chǎn)生大量的外泌體，相關(guān)研究有望成為再生醫(yī)學(xué)的重要發(fā)展方向[8]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，干擾MSCs 的離子通道表達會對其產(chǎn)生的外泌體的抗炎作用造成影響[9]，而MSCs 來源的外泌體對腹膜透析中腹膜間皮細胞的抗炎保護作用尚未見報道。本研究擬通過觀察高糖誘導(dǎo)下MSCs 外泌體對腹膜間皮細胞的作用機制，為探索MSCs 外泌體修復(fù)腹膜間皮損傷的分子機制奠定基礎(chǔ)，為腹膜透析并發(fā)腹膜炎的臨床防治提供更為廣闊的思路。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人膜間皮細胞（Human membrane mesothelial cells，MET－5A）由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院腎內(nèi)科實驗室提供。人間充質(zhì)干細胞（Human mesenchymal stem cells,hMSCs）取自上海市第一婦嬰保健院產(chǎn)科健康足月新生兒的臍帶樣本，產(chǎn)婦及家屬均知情同意。

M199 培養(yǎng)基（Hyclone，美國）；葡萄糖粉（Sigma，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；胰蛋白酶（Gibco，美國）；青鏈霉素雙抗（新賽美生物科技有限公司）；ExoQuick 試劑盒（SBI，美國）；CCK8 試劑盒（Dojindo，日本）；細胞凋亡檢測試劑盒（BD，美國）；TRIzol 試劑（Sigma，美國）；PCR 引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Green Real－time PCR 試劑盒（TaKaRa，日本）；人IL－6 ELISA 試劑盒（Bioligend，美國）。

本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

取出并復(fù)蘇MET－5A 細胞，用含10%胎牛血清和1%雙抗的M199 培養(yǎng)基重懸細胞并接種于培養(yǎng)皿中，待細胞達到80%融合時進行后續(xù)實驗。

1.2.2 間充質(zhì)干細胞外泌體（MSCs－Exo）的提取和鑒定

在前期工作中，我們已經(jīng)成功分離、培養(yǎng)了人臍帶間充質(zhì)干細胞，流式細胞儀檢測顯示其高表達CD90 和CD73、低表達CD45，符合MSC 表型[9]。根據(jù)ExoQuick 試劑盒說明書，繼續(xù)從培養(yǎng)MSCs 的上清液中提取、分離外泌體，并儲存于－80 ℃?zhèn)溆谩Ｊ褂猛干潆婄R（TEM）、納米粒子跟蹤分析技術(shù)（NTA）和Western Blot 分別檢測外泌體的形態(tài)、粒徑分布和表面標志物。

1.2.3 CCK－8 法檢測細胞的增殖

使用CCK－8 試劑盒檢測Met－5A 細胞的增殖活力，并選出高糖和間充質(zhì)干細胞外泌體的最佳刺激濃度。將Met－5A 細胞按5×103個/孔的密度接種于96 孔板，貼壁后待細胞達到80%融合時，分別使用1.5%、2.5%和4.25%葡萄糖處理MET－5A 細胞24 h，并設(shè)正常對照（不加任何干預(yù)），每組7 個復(fù)孔。選取刺激效果最顯著的高糖濃度（4.25%高糖）細胞分別予10 μg/mL、100 μg/mL MSCs－Exo 共同培養(yǎng)MET－5A 細胞24 h。根據(jù)CCK－8 的實驗結(jié)果，選用4.25%高糖和100 μg/mL MSCs－Exo 作為后續(xù)實驗的條件。

1.2.4 流式細胞技術(shù)檢測細胞的凋亡

將Met－5A 細胞接種于6 孔板，待貼壁細胞達80%融合時將細胞隨機分為以下3 組：①正常對照組（C 組），不做任何干預(yù)處理；②高糖組，加4.25%葡萄糖作用24 h；③共培養(yǎng)組：加4.25%葡萄糖和100 μg/mL MSCs－Exo 共同作用24 h。收集各孔培養(yǎng)上清和細胞懸液離心后棄去上清液，加入100 μL結(jié)合液重懸細胞，依次加入5 μL Annexin Ⅴ－FITC和5 μL PI，避光孵育15 min 后于流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 qRT－PCR 檢測IL－6、TNF－α 表達

用TRIzol 試劑從3 組細胞中分別提取其總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制成cDNA。使用GAPDH 為內(nèi)參，利用SYBR Green Real-time PCR試劑盒測定IL-6、TNF-α 的mRNA 的表達水平。PCR 過程包括95 ℃變性30 s、95 ℃5 s、60 ℃退火34 s，循環(huán)40 次。引物序列如下：GAPDH，5'-3'ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG，3' -5'GCCATCACG CCACAGTTTC；IL -6，5' -3'CCTGAACCTTCCAAA GATGGC，3'-5'TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA；TNFα，5' -3'TCACATGCGCCTTGATGTCTG，3' -5'CGG GCCGATTGATCTCAGC。

1.2.6 ELISA 檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-6 的水平

根據(jù)試劑盒說明書配制溶液并放置一定量的孔槽。每孔洗滌4 次后甩凈拍干，加入50 μL 緩沖液、50 μL 的標準品以及待測樣本，封板孵育2 h 后洗板4 次。加100 μL 的IL-6 檢測抗體，封板孵育1 h洗板4 次；每孔內(nèi)加入100 μL 親和素標記的辣根過氧化物溶液，封板孵育30 min；棄去孔內(nèi)液體洗板后加入100 μL 底物溶液，避光孵育15 min 后加入100 μL 終止液，混勻后迅速用酶標儀檢測各孔在450 nm 和570 nm 處的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism Software 軟件統(tǒng)計并作圖，One-way ANOVA 法以及t 檢驗分析組間差異性。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體分離鑒定結(jié)果

透射電鏡觀察顯示，外泌體類似杯口狀，質(zhì)膜邊緣清晰。納米顆粒示蹤分析技術(shù)顯示，外泌體粒徑為50～200 nm。Western blot 結(jié)果表明，提取的外泌體表達特異性表面標志物CD63 和CD81。

2.2 高糖和MSCs-Exo 對Met-5A 細胞增殖的影響

CCK-8 結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖組細胞增殖水平明顯降低（P＜0.001），且隨著濃度增加，其抑制效果越明顯，高糖濃度為4.25%時抑制增殖效果最明顯（圖1）；不同濃度的MSCs-Exo 在與4.25%高糖共同刺激MET-5A 細胞24 h 后，與4.25%高糖組相比，共培養(yǎng)組Met-5A 細胞增殖水平明顯增加，且與外泌體的濃度有相關(guān)性，其中100 μg/mL MSCs-Exo 共培養(yǎng)組細胞增殖活力提高最明顯（圖2），表明MSCs-Exo 可改善高糖對Met-5A 細胞增殖的抑制作用。

圖1 CCK-8 檢測不同濃度高糖對Met-5A 細胞增殖活力的影響Fig.1 The effects of different concentrations of high glucose on the cell viability of MET-5A cells by CCK-8

圖2 CCK-8 檢測高糖與不同濃度MSCs-Exo 共培養(yǎng)對Met-5A細胞增殖活力的影響Fig.2 The effects of different concentrations of MSCs-Exo cocultured with high glucose on the cell viability of MET-5A cells by CCK-8

2.3 高糖和MSCs-Exo 對Met-5A 細胞凋亡的影響

流式細胞檢測結(jié)果顯示（圖3），與正常對照組對比，高糖組細胞凋亡明顯增加（P＜0.001）；而與高糖組相比，共培養(yǎng)組細胞凋亡率明顯降低。說明MSCs-Exo 可以緩解高糖對腹膜間皮細胞的促凋亡作用。

圖3 高糖和MSCs-Exo 對Met-5A 細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of high glucose and MSCs-Exo on apoptosis of MET-5A cells

2.4 高糖和MSCs-Exo 對Met-5A 細胞IL-6、TNFα 表達的影響

qRT-PCR 結(jié)果顯示（圖4），與正常對照組相比，高糖組細胞IL-6、TNF-α mRNA 的相對表達水平明顯增高（P＜0.01）；與高糖組相比，共培養(yǎng)組Met-5A細胞IL-6、TNF-α 的表達降低（P＜0.05、P＜0.001）。

圖4 高糖和MSCs-Exo 對Met-5A 細胞IL-6、TNF-α 表達的影響Fig.4 Effects of high glucose and MSCs-Exo on the expression of IL-6 and TNF-α in MET-5A cells

2.5 高糖和MSCs-Exo 對細胞培養(yǎng)上清液中炎癥介質(zhì)IL-6 表達的影響

為了進一步驗證高糖和MSCs-Exo 對細胞IL-6的作用，我們通過Elisa 實驗檢測了上述三組細胞培養(yǎng)上清液中IL-6 的水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高糖組細胞的IL-6 水平明顯升高（P＜0.001）；與高糖組相比，共培養(yǎng)組Met-5A 細胞IL-6 的表達降低（P＜0.05）。說明MSCs-Exo 可以降低因高糖誘導(dǎo)的IL-6 的表達升高（圖5）。

圖5 高糖和MSCs-Exo 對細胞培養(yǎng)上清液中炎癥介質(zhì)IL-6 表達的影響Fig.5 Effects of high glucose and MSCs-Exo on the expression of IL-6 in cell culture supernatant

3 討論

腹膜透析是終末期腎病患者重要的替代治療方式之一，與血液透析相比，腹膜透析具有血流動力學(xué)較穩(wěn)定，中分子毒素清除效率好，并可在一定程度上延緩殘存腎功能下降等優(yōu)點[10]。腹膜透析的有效性主要取決于腹膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，目前認為高糖高滲性腹膜透析液的持續(xù)刺激是引起腹膜相關(guān)組織功能改變的重要原因之一[11]。既往的研究已經(jīng)驗證通過向腹腔內(nèi)連續(xù)注射高糖腹透液可以構(gòu)建腹透相關(guān)性腹膜損傷模型[12]。研究認為，高糖引起腹膜損傷可能是多種機制共同作用的結(jié)果，包括長鏈非編碼RNA 差異性表達，激活下游MALAT1 分子表達增高使腹膜纖維化加重[13]；誘導(dǎo)間皮細胞產(chǎn)生活性氧，分泌TGF-β1、VEGF 等細胞因子和炎癥因子，使細胞長期處于炎癥狀態(tài)，通過激活JNK/SAPK 等信號通路最終造成細胞凋亡和腹膜纖維化[4，14]；高糖誘導(dǎo)間皮細胞發(fā)生炎癥自噬以及通過上調(diào)多種microRNA 的表達促進EMT 的發(fā)生[15-16]。本研究顯示，不同濃度的高糖刺激可造成Met-5A 細胞增殖下降，IL-6、TNF-a 上調(diào)和凋亡增加，證實了高糖對腹膜間皮細胞存在促炎和促凋亡作用。但是，其具體的分子機制和作用靶點還需進一步的研究。

MSCs 具有獨特的免疫調(diào)節(jié)活性，可有效干預(yù)炎癥的進程。研究認為，MSCs 可以修復(fù)損傷細胞，通過外泌體或者隧道式納米管發(fā)揮旁分泌作用，在體內(nèi)起到免疫調(diào)控作用，包括抑制T 淋巴細胞的增殖和活化，干預(yù)炎癥小體的活化[17]，調(diào)節(jié)T 細胞和巨噬細胞的極化和凋亡，促進機體從促炎狀態(tài)向抗炎狀態(tài)轉(zhuǎn)化，幫助機體清除病原體[18-19]。MSCs 在很多炎癥的疾病動物模型中均取得了良好的效果，在腹膜纖維化的動物實驗中也證實其可以改善巨噬細胞的極化、下調(diào)促炎癥因子、上調(diào)抗炎癥因子的表達而延緩腹膜纖維化進程并改善腹膜超濾功能[20-21]。但細胞治療中干預(yù)劑量和操作過程難以標準化，潛在的致瘤性以及細胞因子釋放綜合癥等問題，導(dǎo)致干細胞治療的臨床應(yīng)用受限。

外泌體是多種細胞類型釋放的膜外囊泡，由磷脂雙層包圍，直徑約30～130 nm，含有大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、非編碼RNA 等，是細胞間通信的重要信使。MSCs-Exo 與MSCs 一樣具有免疫調(diào)控活性，可以減少促炎癥細胞因子TNFα、NF-κB、IL-1β的表達，升高抗炎癥因子TGF-β、IL-10、PGE2 的水平，并減少Th17 細胞的數(shù)量，上調(diào)Treg T 細胞的數(shù)量[22-23]，影響炎癥小體的活化，并進一步減少巨噬細胞和淋巴細胞在損傷組織中的浸潤，促進巨噬細胞從M1 型向M2 型轉(zhuǎn)化[19]從而發(fā)揮免疫負調(diào)控作用。MSCs-Exo 治療的優(yōu)點：比MSC 具有更低的免疫原性，不會觸發(fā)機體固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)；不具有致瘤性，而且可以突破血腦屏障進入損傷組織[24]。在膿毒血癥的動物模型中，MSCs 來源的外泌體能夠依靠傳遞miR-223 抑制STAT3 激活，降低IL-6 等炎癥因子的水平，也可以通過miR-146a 激活M2 巨噬細胞，提升IL-10 的水平來減輕機體的炎癥反應(yīng)[25]。因此，對MSCs-Exo 的研究有望成為免疫治療未來發(fā)展的方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，MSCs-Exo 與MET-5A 細胞共培養(yǎng)可抑制高糖的促凋亡作用，明顯降低高糖對MET-5A 細胞的損傷作用，抑制高糖導(dǎo)致的炎癥因子表達升高，說明MSCs-Exo 對高糖損傷的人腹膜間皮細胞存在一定的修復(fù)作用，對腹膜間皮細胞的生長發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，為臨床上提高腹膜透析患者的生存率提供了一種新的治療思路。

盡管我們在體外實驗中證實了MSCs-Exo 可有效減輕高糖溶液誘導(dǎo)的腹膜間皮細胞損傷，但其發(fā)揮調(diào)控作用的真正分子機制和下游信號還尚不明確，并且與MSCs 作用的差異性還需要進一步的驗證和研究。MSCs-Exo 作為一種無細胞治療手段，為改善腹膜透析相關(guān)性腹膜炎提供了一種新的可能性。