唇腭裂小鼠模型的研究進展

馬亞萍 吳鏑

【提要】 唇腭裂屬于最常見的先天性頜面畸形，在亞洲人群中的發(fā)病率較高。在胚胎發(fā)育過程中，小鼠與人類頜面部的發(fā)育過程有許多相似之處，因此唇腭裂 小鼠模型一直是研究人類唇腭裂疾病的重要工具。小鼠模型擁有數(shù)量多、壽命長、生長周期短、易獲得等一系列優(yōu)勢，但也存在模型類型有限等問題。目前，建立唇腭裂小鼠模型的方法很多，較常用的有外科手術建立唇腭裂小鼠模型；運用基因工程技術（Genetic engineering technology）建立唇腭裂小鼠模型，如基因敲除技術、轉基因技術等；運用致畸劑作用于孕鼠（如地塞米松、二噁英等），從而影響胚胎小鼠的發(fā)育，以建立唇腭裂小鼠模型等。本文就目前建立唇腭裂小鼠模型的方法進行綜述。

唇腭裂是最常見的頜面部先天畸形，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率大約為14.92/10 000，亞洲人群的發(fā)病率大約是1.19/1 000，高于非洲人及高加索人[1]。唇腭裂的分類方法眾多，如根據(jù)是否伴有身體其他畸形，唇腭裂可分為綜合征型唇腭裂（Syndromic cleft lip and palate，SCLP）以及非綜合征型唇腭裂（Non-syndromic cleft lip and palate，NSCLP）；根據(jù)組織胚胎來源不同，唇腭裂還可分為單純腭裂、唇裂（伴或不伴有腭裂）。

唇腭裂的病因和遺傳與環(huán)境因素相關。遺傳學研究已經(jīng)定位到多個與唇腭裂發(fā)生發(fā)展有關的基因和區(qū)域，較明確的有IRF6、VAX1、8q24 等。各類動物模型成為探究唇腭裂發(fā)生發(fā)展和手術治療的重要研究方法。常用的動物模型有靈長類動物，以及大鼠、貓、犬和兔等。這些動物模型各有優(yōu)勢，其中靈長類動物的面部形態(tài)與人類最為接近，但是費用高、樣本量少、性價比低；貓與人類顱頜面生長機制相似；小鼠則是最廣泛應用的動物模型之一[2-3]。

1 唇腭裂小鼠模型的建立方法

小鼠胚胎唇腭部的發(fā)育過程與人類相似，影響唇腭部發(fā)育的因素復雜。小鼠上腭的生長發(fā)育過程發(fā)生在胚胎的第11.5～17.5 天；第11.5 天腭突開始發(fā)育；第12.5 天時腭突開始垂直向下生長；第14.5 天時，雙側腭突已發(fā)育至水平位置；第15.5 天時，雙側腭突開始融合；第17.5 天時雙側腭突融合基本完成。在建立唇腭裂小鼠模型的過程中，我們可以通過外科手術或是影響胚胎發(fā)育的方式來完成模型的建立。

1.1 后天性唇腭裂小鼠模型的建立

通過外科手術的方式建立唇腭裂小鼠模型，主要分為兩種：①有裂模型，通過外科手術將唇與腭板離斷形成縫隙，以模仿先天性唇腭裂所造成的顱面畸形；②無裂模型，借助外科手術模擬唇腭裂治療過程中的某一階段唇腭部的形態(tài)，如模仿Langenbeck 腭裂修復術式所造成的減張切開創(chuàng)面和手術損傷后的軟腭[3-4]。

1.2 先天性唇腭裂小鼠模型的建立

先天性唇腭裂小鼠模型的建立對于唇腭裂的病因學研究及其發(fā)生發(fā)展過程的研究更具價值。常用方法：①通過各種方式培育出唇腭裂發(fā)生率高的小鼠品系；②運用基因工程技術培育特定基因型的唇腭裂小鼠；③運用致畸劑誘導唇腭裂發(fā)生。

1.2.1 篩選出特定種系的小鼠以自然產(chǎn)出先天性唇腭裂幼崽

篩選出自發(fā)率高的特定種系小鼠以產(chǎn)出先天性唇腭裂幼崽，如傳統(tǒng)的近交系小鼠A/J、CL/Fr 品系具有自發(fā)唇腭裂傾向，自然發(fā)生率分別為8%～10%和18%～26%[4]。研究表明，用七氟烷影響A/J 小鼠的胚胎發(fā)育過程時，A/J 小鼠的唇裂發(fā)生率可達50%左右，且A/J 小鼠的畸形率會隨著七氟烷濃度的升高而略有增加但并不顯著[5]。CL/Fr 小鼠的唇裂發(fā)生率只有23%，而運用6-AN 處理后發(fā)生率高達94%，可能是6-AN 使上皮細胞表面光滑，造成細胞間連接減少，同時促進細胞死亡；并且還可能導致外鼻突及內(nèi)鼻突縮小，影響鼻突的正常融合；此外，還可導致上皮細胞及間充質細胞密度增加等細胞改變[6]。FVB 小鼠、A/WySn 小鼠也是常用的自發(fā)唇腭裂小鼠模型。

1.2.2 運用基因工程技術建立唇腭裂小鼠模型

1.2.2.1 唇腭裂基因工程小鼠的制備方法

主要通過基因工程技術手段，如基因敲除、條件性基因敲除、轉基因、基因敲入等，對小鼠基因組進行一定的人為干預，由此產(chǎn)生各種表型的唇腭裂小鼠模型。

基因敲除技術的應用最為廣泛，即將外源性基因插入靶基因的特定位點，造成靶基因失活，從而形成特定的唇腭裂小鼠模型。如用一個含有l(wèi)acZ 基因以及新表達盒的目的基因插入表達載體Osr2 外顯子中，置換出部分外顯子，導致Osr2基因失活，然后把表達載體線性化通過電穿孔的方法注入到囊胚的ES 細胞中，從而得到F0 嵌合體小鼠，進行不斷的交配篩選而獲得Ors2tm1Jian/tm1Jian純合小鼠[7]。

條件性基因敲除技術目前以趨于完善，可使靶基因的表達擁有時空特異性。其中較常見的便是Cre-loxP 小鼠的應用，即讓GeneFlox/+小鼠（靶基因側翼含有成對的loxp 位點的雜合小鼠）與組織特異性Cre+的工具小鼠交配后，通過一系列的雜交選育獲得突變小鼠，然后通過誘導可在特定的組織或細胞中敲除目的基因，如在神經(jīng)嵴中特異性敲除eprhin-B1基因，從而獲得具有組織特異性的eprhin-B1-/-唇腭裂小鼠模型。

轉基因技術是指用顯微注射針將線性化的外源DNA 片段直接注入小鼠受精卵的原核中，使外源基因隨機整合到小鼠基因組中而獲得轉基因小鼠。如TTF-2 轉基因小鼠模型的制備，先選取TTF-2 為目的基因片段，建立表達載體pBROAD3-TTF-2，將促排卵雌鼠與雄鼠交配后得到受精卵，通過顯微注射技術將表達載體置入受精卵內(nèi)，運用PCR 技術及Southern blot 技術，發(fā)現(xiàn)基因表達陽性的小鼠中一部分為唇腭裂表型。

1.2.2.2 唇腭裂基因工程小鼠的形成機制

腭板的生長可粗略分為6 個期，分別是發(fā)生期、垂直生長期、上抬期、水平生長期、融合期和分化成熟期。這些階段受到影響有可能形成唇腭裂小鼠。①影響腭板生長，如Msx1-/-小鼠。Msx1 主要介導上皮細胞與間質細胞之間的相互作用，在顱面骨骼及牙齒的發(fā)育中起到重要作用。純合Msx1-/-小鼠會在剛出生后24 h 內(nèi)死亡。其引起腭裂的主要機制是前腭間質細胞的增殖受損，分子機制可能是由于缺乏Bmp4 的表達，而使Msx1-/-小鼠重新表達Bmp4 可以減少Msx1-/-小鼠的腭裂表型及新生鼠死亡[8]。除了完全繼發(fā)腭裂，Msx1-/-小鼠還會出現(xiàn)其他的顱面畸形。這也是其引起繼發(fā)腭裂的原因之一。其機制可能是影響了上頜骨的牙槽突及牙的發(fā)育，這些結構都緊鄰腭板，在一定程度上也影響腭板的生長[9]。有研究表明野生型小鼠中Ors2 基因表達于上頜中部，并在腭突生長時表達強烈，至腭突上抬及融合時其表達下降[10]。此外常見的小鼠模型還有EphB1-/-、EphB2lacZ/lacZ;EphB3-/-小鼠等。②影響腭板抬升，細胞遷移在腭板的定向抬升中扮演重要角色，Wnt5a 在細胞遷移中發(fā)揮重要作用。Wnt5a-/-小鼠呈現(xiàn)出完全繼發(fā)腭裂。研究表明，Ror2-/-小鼠也呈現(xiàn)出完全繼發(fā)腭裂表型[11]。其主要機制可能為Wnt5a 與Ror2 相互作用激活非經(jīng)典的Wnt 信號通路，在腭前后軸內(nèi)對細胞遷移產(chǎn)生趨化作用從而阻礙了腭后部細胞向前遷移，中間部細胞向兩側遷移。此外常見的小鼠模型還有VlK-/-、Adamts9-/-;bt/bt 小鼠等。③影響板融合，有研究表明Wnt9a-/-、Ror1hyp/hyp、Ror1hyp/hyp;Wnt9a-/-、Ror2-/-、Ror1-/-基因型小鼠均可產(chǎn)出繼發(fā)腭裂表型的唇腭裂小鼠。其中Ror2-/-小鼠表現(xiàn)為繼發(fā)腭裂表型可能是因為Shh 的表達下降[12]。TGFβ/Smads 通路是影響腭板發(fā)育的重要通路[13]。其中TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3 均有促進腭板融合的功能。此外還有研究表明TGFβ3-/-的小鼠在胚胎發(fā)育第15.5天時腭板的前、中、后三部分均未出現(xiàn)融合，而野生型小鼠在此時已經(jīng)出現(xiàn)了腭板融合[14-15]。還有Snai1+/-、Snai2-/-、Jeff+/-、Smad2+/-小鼠也是常見的模型。

1.2.3 運用藥物誘導建立小鼠的唇腭裂模型

在母體孕期（通常為胚胎發(fā)育第12～15 天，此時為小鼠胚胎唇腭部發(fā)育的關鍵時期）給予各類致畸藥物，以獲得先天性的唇腭裂小鼠模型。藥物的種類、劑量，以及給藥時間和方式均會影響唇腭裂的表現(xiàn)型。

研究表明，地塞米松可單獨致畸小鼠，且小鼠的畸形率受劑量影響。地塞米松達6.0 mg·kg-1時，C57BL/6J 胎鼠的腭裂畸形率可達38%[16]。此外，二噁英和糖皮質激素合用可以提高胎鼠的致畸率[17]，二噁英和糖皮質激素合用的情況下，高劑量一次性給藥相較于低劑量連續(xù)給藥在操作上給孕鼠帶來的影響更小，胎鼠死胎率顯著降低，孕鼠流產(chǎn)率也較低，腭裂小鼠模型更穩(wěn)定[18]。維甲酸也是小鼠腭裂模型常用的誘導劑，昆明胎鼠發(fā)育第10 天對維甲酸的敏感度最高，當維甲酸劑量為50 mg·kg-1，孕鼠全部存活，死胎率為10.34%，活胎小鼠的腭裂發(fā)生率為95.34%，以此濃度建立的腭裂小鼠模型效益較高[19-20]。維甲酸誘導BALB/c 近交系小鼠建立腭裂模型時，在胚胎發(fā)育第10 天，一次性管飼維甲酸50 mg·kg-1，小鼠腭裂形成效率較高[21]。不同品系小鼠給予可的松后的致畸率不同，A/J 與SWV 品系小鼠腭裂致畸率可達100%，而其他小鼠（如C57BL/6J、A.B6F1、B6.AF1）的致畸率往往較低，表明小鼠自身基因也是影響腭裂發(fā)生率的獨立因素。A/J 小鼠的高腭裂產(chǎn)生率可能與腭板融合延遲有關[22]。

2 小鼠模型的優(yōu)勢及劣勢

小鼠現(xiàn)作為國內(nèi)外應用最多的動物模型之一，其優(yōu)勢在于：①小鼠壽命1～3 年，生長周期和孕育周期短；生產(chǎn)數(shù)量多，個體差異??；容易獲得，易于飼養(yǎng)。②小鼠的早期顱面發(fā)育與人類相似，可用于研究人類胚胎唇腭的發(fā)育的相關研究。其劣勢在于：①小鼠模型并不能準確建立人類唇腭裂中各類綜合征型及非綜合征型的唇裂或腭裂模型。②部分基因功能繁多，基因敲除后可影響顱面其他部位的發(fā)育，從而無法判斷其作用究竟是影響了腭板的發(fā)育還是因為腭旁組織的畸形而繼發(fā)腭畸形[23]。③部分小鼠模型胚胎過早，導致無法觀察腭板及唇部發(fā)育過程，如BMP2 基因敲除小鼠可在胚胎發(fā)育第7.5～10.5 天死亡，此時腭板還未發(fā)育[24]。

3 總結與展望

目前已經(jīng)探索了多種小鼠唇腭裂模型，從綜合征型至非綜合征型唇腭裂模型均有長足的發(fā)展，對唇腭裂的病因及治療研究起到了重要作用。值得注意的是，各類方法建立小鼠唇腭裂模型時胎鼠及新生小鼠死亡率較高，不利于后續(xù)進一步的研究。此外，即使小鼠腭裂模型成功建立，但在研究唇腭裂治療方法、患者智力發(fā)展、發(fā)音構音功能、心理影響等方面，小鼠模型的作用極為有限，建模的經(jīng)濟效益較低。