羅格列酮延緩AKI-CKD轉(zhuǎn)化的作用研究

王 娟 茅 松

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是指腎功能快速下降的一組臨床綜合征，其與終末期腎臟疾病、心血管疾病、高血壓等密切相關(guān)[1]。一項(xiàng)包括154項(xiàng)研究、350萬(wàn)例的大樣本量Meta分析表明，AKI發(fā)生率高達(dá)21.6%，病死率為23.9%。重癥監(jiān)護(hù)患者的AKI發(fā)生率高達(dá)50%[2]。2013年我國(guó)大約有140萬(wàn)例符合改善全球腎臟病預(yù)后組織(kidney disease:improving global outcomes, KDIGO)診斷標(biāo)準(zhǔn)的 AKI 患者在各級(jí)醫(yī)院接受治療，他們的消費(fèi)支出約130億美元，給家庭、社會(huì)以及個(gè)人均造成了沉重的負(fù)擔(dān)[3]。因此，早期識(shí)別、阻斷、延緩AKI進(jìn)展具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，AKI與慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的疾病，但隨著研究的深入，有研究證實(shí)AKI 是CKD乃至終末期腎病(end stage of renal disease，ESRD)的關(guān)鍵性危險(xiǎn)因素[4, 5]。腎臟的持續(xù)缺血、缺氧易導(dǎo)致腎臟慢性化的改變[6]。AKI有可能導(dǎo)致永久性的腎臟損害，進(jìn)而增加發(fā)生慢性腎衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，與沒(méi)有AKI病史患者比較，AKI后CKD風(fēng)險(xiǎn)增加8.8倍，ESRD升高約3.1倍[7]。研究報(bào)道提示，即使輕度AKI表現(xiàn)為明顯的完全恢復(fù)，追蹤調(diào)查3年仍發(fā)現(xiàn)有約1.5%的人群進(jìn)展為CKD，后續(xù)隨訪發(fā)現(xiàn)，血清肌酐的適度增加與CKD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加90%相關(guān)聯(lián)[8]。缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR) 是導(dǎo)致AKI的最常見(jiàn)原因之一，腎移植術(shù)、局部腎切除術(shù)、輸尿管阻塞等臨床診治過(guò)程中均不同程度的存在[9]。因此，尋找有效可靠的手段阻斷IR-AKI的發(fā)生、發(fā)展對(duì)于AKI的早期防治及延緩向CKD進(jìn)展顯得尤為重要。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPAR-γ)是配體依賴型的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體家族。PPAR-γ與配體結(jié)合后，與視黃酸類受體(RxR)形成異二聚體，然后與調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子上游的過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[10]。它的生理作用包括調(diào)節(jié)各種代謝途徑，例如脂質(zhì)的生物合成和葡萄糖代謝[11]。噻唑烷二酮是一種通過(guò)激活PPAR-γ起作用的合成藥物，羅格列酮 (rosiglitazone，RSG) 是其中的經(jīng)典藥物。業(yè)已證實(shí)，PPAR-γ激活對(duì)腎臟可能發(fā)揮保護(hù)作用，且可延緩CKD 的進(jìn)展。因此RSG在AKI-CKD的轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮阻斷作用，筆者進(jìn)一步研究觀察RSG對(duì)急性腎IR模型的時(shí)間序列影響，試圖從源頭上觀察其在AKI-CKD中腎臟纖維化、慢性化損傷、腎功能改變上的影響。

材料與方法

1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：所有實(shí)驗(yàn)均獲得上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)的批準(zhǔn)[動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SYXK(滬)2011-0128]。96只6～8周齡的雄性C57/B6小鼠,購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組(8只)、RSG組(8只)、IR組(40只,1、3、7、14、28天各8只)、IR+RSG組(40只，1、3、7、14、28天各8只)。其中對(duì)照組不作任何處理，與RSG組于RSG灌胃后28天取右腎評(píng)估；RSG組按10mg/kg隔天給予RSG灌胃至28天，后進(jìn)行處理取材右側(cè)腎臟以備評(píng)估；IR組通過(guò)夾閉小鼠右側(cè)腎蒂1h，建立腎臟IR誘導(dǎo)的AKI模型，分別在第1天(IR1,n=8)、第3天(IR3,n=8)、第7天(IR7,n=8)、第14天(IR14,n=8)、第28天(IR28,n=8)進(jìn)行處理取材右側(cè)腎臟以備評(píng)估；IR+RSG組手術(shù)前30min按10mg/kg給予RSG灌胃，手術(shù)造模同IR組，之后隔天給予RSG，劑量為10mg/kg,分別在第1天(IR+RSG1,n=8)、第3天(IR+RSG3,n=8)、第7天(IR+RSG7,n=8)、第14天(IR+RSG14,n=8)、第28天(IR+RSG28,n=8)處理取材右側(cè)腎臟以備評(píng)估。缺血再灌注1、3、7、14、28天分別命名為缺血再灌注1、3、7、14、28組。具體手術(shù)過(guò)程：術(shù)前按10ml/kg腹腔注射0.5%戊巴比妥，待麻藥生效，將小鼠背部朝上固定于鼠板，右側(cè)背部中部備皮，用眼科剪依次劃開(kāi)此處組織，用無(wú)齒鑷分離出右側(cè)腎臟，找到腎蒂，用動(dòng)脈夾夾閉1h，依次縫合切口。

2.血液和尿液生物學(xué)標(biāo)志物測(cè)定：通過(guò)直接心臟穿刺收集血液，并在約-80℃下制備冷凍的血清，直至進(jìn)行批量分析。隨后全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐。按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃于當(dāng)天收取隨機(jī)尿液，收集的尿液在約-80℃凍結(jié)，直到進(jìn)行批次分析。用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法試劑盒(Mouse Albumin ELISA Kit, ab108792, 英國(guó)Abcam公司)檢測(cè)尿微量白蛋白水平,用ELISA試劑盒(肌酐Cr試劑盒，C011-2-1,南京建成生物工程研究所)肌氨酸轉(zhuǎn)化酶法檢測(cè)血清尿素氮水平。

3.組織學(xué)檢查：腎臟組織進(jìn)行了蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色以觀察腎臟損傷程度，行Masson染色觀察組織纖維化程度。

4.腎臟組織基因表達(dá)分析：按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃處理取材右側(cè)腎臟后，速凍于-80℃冰箱。使用Trizol試劑(trizol,15596-018,美國(guó)Invitrogen公司)從組織中純化總RNA樣品。使用DNA酶試劑盒(DNaseⅠ,K1622,RNase-free, 美國(guó)Thermo Scientific公司)去除總RNA樣品中混合第DNA，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand Cdna Synthesis Kit,EN0521,美國(guó)Thermo Scientific公司)生成cDNA，并使用FastStartTM通用SYBR Green預(yù)混液(ROX)(FastStart Universal SYBR Green Master，4913850001，瑞士Roche公司)進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)腎臟纖維化標(biāo)志物(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)表達(dá)水平，使用delta deltaCT方法計(jì)算與空白組的相對(duì)基因表達(dá)。引物設(shè)計(jì)詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列(5′→3′)

5.Western blot法檢測(cè)：用冰冷的PBS洗滌腎組織，并用常規(guī)方法在新添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑(PMSF)的冷RIPA緩沖液中裂解。通過(guò)SDS-PAGE凝膠測(cè)定組織蛋白水平，并用以下抗體印跡：抗β-actin[β-actin (13E5) Rabbit mAb，4970S，美國(guó)Cell Signaling Technology公司]、α-SMA(Rabbit anti-alpha smooth muscle actin antibody，bs-10196R，博奧森生物科技有限公司)、collagenⅠ(Rabbit anti-collagen Ⅰ antibody，bs-10423R，博奧森生物科技有限公司)、collagenⅢ(Rabbit anti-collagen Ⅲ antibody，bs-0948R，博奧森生物科技有限公司),使用ImageJ軟件對(duì)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果進(jìn)行定量。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 8.0(美國(guó))繪制。

結(jié) 果

1.IR誘導(dǎo)了C57 / B6小鼠AKI向CKD的轉(zhuǎn)化：動(dòng)脈夾(小型)夾閉小鼠右側(cè)腎動(dòng)脈1h后去除，血BUN和血肌酐在術(shù)后第1天升高最為明顯，后逐漸下降，第28天，IR組較對(duì)照組仍明顯升高(P<0.05，圖1、圖2)。IR組尿微量白蛋白/尿肌酐術(shù)后第1天逐漸增加，在第7天達(dá)到峰值，后緩慢下降，在第28天IR組數(shù)值仍大于對(duì)照組 (P<0.05,圖3)。組織病理學(xué)(HE)分析顯示，IR組在第1天即出現(xiàn)腎小管損傷，后呈時(shí)間順序性持續(xù)加重(圖4)。Masson染色表明，膠原積累和沉積在第14天明顯增加，后持續(xù)增加(圖4)。RT-PCR分析顯示，collagen Ⅰ于第1天明顯升高，后持續(xù)增高 (P<0.05)，α-SMA與collagenⅢ于第7天明顯升高，后持續(xù)增高 (P<0.05,圖5)。Western blot法檢測(cè)顯示，IR組隨時(shí)間發(fā)展纖維化因子(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)表達(dá)均增多(P<0.05，圖6)。

圖1 IR血尿素氮時(shí)間序列變化與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖2 IR血肌酐時(shí)間序列變化與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖3 IR尿蛋白/肌酐比值時(shí)間序列變化與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖4 IR腎組織病理時(shí)間序列改變(×40)

圖5 IR纖維化因子mRNA時(shí)間序列改變與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖6 IR纖維化因子蛋白表達(dá)水平時(shí)間序列改變與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.羅格列酮可延緩AKI-CKD轉(zhuǎn)化：腎功能評(píng)估表明，對(duì)照組和RSG組腎功能沒(méi)有差別；與對(duì)應(yīng)IR分組(1、3、7、14、28天)比較，IR+RSG分組BUN在1、3、7、14天明顯降低(P<0.05，圖7)，血肌酐在7、28天明顯降低(P<0.05，圖8)。尿微量白蛋白/尿肌酐在術(shù)后3、14天明顯減少(P<0.05,圖9)。組織病理學(xué)(HE)分析顯示，與對(duì)照組比較，RSG組無(wú)明顯改變；與對(duì)應(yīng)IR(1、3、7、14、28天)分組比較，IR+RSG (1、3、7、14、28天)分組腎小管損傷均減少(圖10)。Masson染色表明，與對(duì)照組比較，RSG組無(wú)明顯改變；與對(duì)應(yīng)IR分組(1、3、7、14、28天)比較，IR+RSG分組(1、3、7、14、28天)纖維物沉積減少，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，減少程度越來(lái)越明顯(圖10)。RT-PCR分析顯示，與對(duì)照比較，RSG組未見(jiàn)明顯差異；與IR組28天比較，IR+RSG組28天纖維化因子較IR組表達(dá)明顯減少(P<0.05，圖11)。Western blot法檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，RSG組未見(jiàn)明顯差異；與IR組28天比較，IR+RSG組28天纖維化因子(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)均顯著減少(P<0.05)，詳見(jiàn)圖12。

圖7 RSG干預(yù)對(duì)IR血尿素氮的時(shí)間序列影響與對(duì)照組比較，*P<0.05;與同組RSG-比較，#P<0.05

圖8 RSG干預(yù)對(duì)IR血肌酐的時(shí)間序列影響與對(duì)照組比較，*P<0.05;與同組RSG-比較，#P<0.05

圖9 RSG干預(yù)對(duì)IR尿蛋白/肌酐比值的時(shí)間序列影響與對(duì)照組比較，*P<0.05;與同組RSG-比較，#P<0.05

圖10 RSG干預(yù)對(duì)腎組織病理時(shí)間序列改變(×40)

圖11 28天時(shí)RSG干預(yù)對(duì)IR纖維化因子mRNA的影響與對(duì)照組和RSG組比較，*P<0.05;與IR組比較，#P<0.05

圖12 28天時(shí)RSG干預(yù)對(duì)IR纖維化因子蛋白表達(dá)水平的影響與對(duì)照組和RSG組比較，*P<0.05;與IR組比較，#P<0.05

討 論

AKI是一種發(fā)生率高、合并癥多的疾病，持續(xù)進(jìn)展可能誘導(dǎo)CKD，導(dǎo)致腎功能的持續(xù)惡化，誘發(fā)多系統(tǒng)的功能影響。因此，早期有效阻斷AKI，并延緩其進(jìn)展具有重要意義。IR是導(dǎo)致AKI的重要原因之一，動(dòng)脈夾夾閉腎蒂一段時(shí)間后去除動(dòng)脈夾是導(dǎo)致IR腎損傷的經(jīng)典模型。筆者通過(guò)腎蒂夾閉1h后再松開(kāi)模擬AKI，并試圖分析研究RSG對(duì)AKI-CKD轉(zhuǎn)化的作用。已有研究證實(shí)，雙側(cè)腎蒂夾閉40min或更長(zhǎng)時(shí)間的缺血能夠?qū)е?0天后小鼠無(wú)法存活[12]。雖然雙側(cè)IR模型更加貼近AKI慢性化發(fā)展病程，但是雙側(cè)模型往往不是特別穩(wěn)定，而單側(cè)模型往往損傷小，動(dòng)物的死亡率低，且同樣也能誘導(dǎo)腎臟慢性化的損傷發(fā)生[13]。本研究為更加有效地模擬IR所致的AKI-CKD的轉(zhuǎn)化進(jìn)展，遂行單側(cè)夾閉腎蒂1天。筆者以AKI發(fā)生、發(fā)展的時(shí)間為線索，分別于1、3、7、14、28天觀察其具體變化，形成AKI進(jìn)展至CKD的時(shí)間序列變化。腎臟功能指標(biāo)均于術(shù)后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，后逐漸下降，7天后下降緩慢，但仍顯著大于基礎(chǔ)值(P<0.05)；HE染色所示的腎小管損傷呈現(xiàn)隨時(shí)間加重趨勢(shì)，Masson染色所示的纖維物沉積呈現(xiàn)進(jìn)行性加重趨勢(shì)，纖維化指標(biāo)(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)改變趨勢(shì)在RT-PCR 和Western blot法檢測(cè)結(jié)果與之前一致。本研究中，IR導(dǎo)致的AKI沒(méi)有完全修復(fù)損傷，其表現(xiàn)為腎功能持續(xù)惡化以及纖維化損傷持續(xù)加重，最終轉(zhuǎn)化為CKD。

各種研究表明IR可能誘導(dǎo)AKI向CKD的轉(zhuǎn)化，但并不是所有的IR所誘導(dǎo)的AKI都可轉(zhuǎn)化為CKD，準(zhǔn)確地說(shuō)是在一定觀察期內(nèi)不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，但將觀察期延長(zhǎng)至生命終點(diǎn)，一次特定的AKI是否一定導(dǎo)致CKD值得商榷。一項(xiàng)綜述分析表明，在一定觀察期內(nèi)，輕、中、重度AKI轉(zhuǎn)化為CKD的概率逐漸上升[5]。大量研究表明，腎臟修復(fù)的能力與初始損傷的嚴(yán)重程度、頻率和持續(xù)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[14]。當(dāng)然，醫(yī)療水平、年齡和性別在轉(zhuǎn)化過(guò)程中也發(fā)揮一定作用，但長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，損傷的嚴(yán)重程度是最為重要的影響因子。所以，筆者認(rèn)為，AKI向CKD的轉(zhuǎn)化是一個(gè)綜合損傷累計(jì)的效應(yīng)，當(dāng)達(dá)到一定損傷閾值，累計(jì)損傷大于該閾值即可觸發(fā)向CKD的進(jìn)展。

RSG是一種PPARγ激動(dòng)劑，臨床上廣泛應(yīng)用于2型糖尿病，已被證明可通過(guò)改善抗炎、抗增殖和抗氧化應(yīng)激的作用來(lái)保護(hù)腎臟，且對(duì)腎臟晚期腎病合并癥有保護(hù)作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在尿毒癥環(huán)境中，高磷酸鹽誘導(dǎo)的PPARγ失活是CKD血管內(nèi)側(cè)鈣化發(fā)病機(jī)制中的重要事件，而PPARγ的激活可減輕CKD鈣化[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型中，PPARγ激動(dòng)劑治療可通過(guò)降低腎臟中TGF-β、Ⅳ型膠原和纖連蛋白的表達(dá)來(lái)顯著減輕腎間質(zhì)纖維化[17]。同時(shí)在敗血癥所致的AKI的模型中，研究者發(fā)現(xiàn)缺乏PPARα(與PPARγ同為核受體家族) 的小鼠腎功能更差[18]。在本研究中，RSG預(yù)處理后，腎IR導(dǎo)致的腎臟功能損傷明顯改善，纖維化損傷亦明顯減輕，結(jié)果提示激活RSG預(yù)處理可能有效延緩AKI進(jìn)展，減輕CKD腎纖維化損傷。

本研究以AKI后1、3、7、14、28天的時(shí)間序列為線索，觀察AKI至CKD的動(dòng)態(tài)演變。筆者發(fā)現(xiàn)1～3天是AKI的急性期，之后腎功能有所恢復(fù)，但纖維化損傷持續(xù)加重，腎臟損傷向慢性化發(fā)展，即AKI逐漸轉(zhuǎn)化為CKD。RSG干預(yù)早期即發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，第28天纖維化分子mRNA和蛋白表達(dá)水平較IR組均顯著下降(P均<0.05)，這充分說(shuō)明RSG早期干預(yù)可以有效的延緩IR誘導(dǎo)的AKI-CKD轉(zhuǎn)化, 并且可以有效減輕腎臟纖維化損傷。

一項(xiàng)研究表明，AKI 不但可以誘發(fā)腎纖維化，并且還會(huì)對(duì)肺、心臟和肝臟產(chǎn)生有害的影響[19]。這與筆者發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相吻合，持續(xù)性的AKI損傷刺激導(dǎo)致腎臟慢性化纖維化損傷，最終可能誘發(fā)一些列合并癥。另有研究發(fā)現(xiàn)，RSG雖可降低腎小球?yàn)V過(guò)率，但長(zhǎng)期并不會(huì)因此而損傷腎功能[20]。近年來(lái)研究表明，RSG的舒張血管的功能并不會(huì)直接導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生，相反的還會(huì)不同程度的減少此類事件的發(fā)生[21]。本研究亦發(fā)現(xiàn)RSG早期持續(xù)干預(yù)可有效的改善腎臟損傷，減輕腎臟纖維化慢性損傷，這充分說(shuō)明早期激活PPAR-γ可能是延緩阻斷AKI-CKD轉(zhuǎn)化的有效靶點(diǎn)。本研究進(jìn)行至28天,如果延長(zhǎng)研究時(shí)間可能更有助于進(jìn)一步深入分析延緩AKI-CKD轉(zhuǎn)化后一系列腎臟合并癥的影響，以及對(duì)其遠(yuǎn)期并發(fā)癥的影響。

綜上所述，RSG可有效延緩AKI向CKD的轉(zhuǎn)化，保護(hù)腎功能，減輕腎臟纖維化損傷。線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥刺激等多種因素可能參與了RSG對(duì)腎臟的保護(hù)機(jī)制，但是其具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。AKI-CKD的轉(zhuǎn)化，AKI后對(duì)其他臟器的影響及PPARγ對(duì)AKI及其并發(fā)癥的遠(yuǎn)期影響仍需開(kāi)展進(jìn)一步研究。