基于PK/PD模型對(duì)恩諾沙星可溶性粉在雞混飲給藥方案的藥效再評(píng)價(jià)

高嫣珺，王美紅，聶 雅，王 震，卜仕金

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

危害養(yǎng)雞業(yè)的細(xì)菌性疾病主要是大腸桿菌病與沙門菌病，在育雛期通過適當(dāng)途徑給予抗革蘭陰性菌的抗菌藥物防治此類疾病已成為養(yǎng)雞業(yè)的慣例。氟喹諾酮類藥物是世界上最有價(jià)值、使用最廣泛的一類抗菌藥，恩諾沙星為第三代氟喹諾酮類抗菌藥，對(duì)革蘭陰性菌具有良好的抗菌活性，在獸醫(yī)臨床廣泛用于防控大腸桿菌、沙門菌和支原體等引起的家禽腸道和呼吸道感染。相比于歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，我國(guó)目前大腸桿菌()和沙門菌()等革蘭陰性菌臨床分離株對(duì)氟喹諾酮類耐藥水平較高，山西省部分地區(qū)分離的20株致病性雞源大腸桿菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果顯示，試驗(yàn)菌對(duì)恩諾沙星耐藥率為85%。秦春芝等于山東省分離的93株致病性大腸桿菌，對(duì)恩諾沙星耐藥率為88.63%。高強(qiáng)等于甘肅省肉仔雞中分離得到的大腸桿菌、沙門菌均對(duì)恩諾沙星耐藥。氟喹諾酮類抗菌藥使用情況與細(xì)菌耐藥有一定相關(guān)性，Guo等報(bào)道983株從河北省1日齡雛雞分離的大腸桿菌對(duì)恩諾沙星的平均耐藥率高達(dá)75%，隨著恩諾沙星的使用，耐藥率逐漸提高至100%；而徐耀輝等報(bào)道的從河南省三黃種雞場(chǎng)死胚中分離的173株沙門菌對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星均敏感。在未批準(zhǔn)使用氟喹諾酮類藥物的美國(guó)，大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率低于5%，而在氟喹諾酮類藥物使用合法化的巴西、中國(guó)和歐盟，大腸桿菌的平均耐藥率超過40%。我國(guó)大腸桿菌和沙門菌臨床分離株的高耐藥率是否與養(yǎng)禽業(yè)長(zhǎng)期使用此類藥物較低濃度混飲或混飼給藥有關(guān)？目前，尚無這方面的研究。中國(guó)是世界上最大的抗菌藥生產(chǎn)和使用國(guó)，動(dòng)物占總消費(fèi)量的一半以上，《2020年中國(guó)獸用抗菌藥使用情況報(bào)告》中指出，2020年，中國(guó)境內(nèi)使用的全部獸用抗菌藥總量約為3.2萬t，較 2019 年增長(zhǎng) 6.06%。臨床批準(zhǔn)使用的抗菌藥物耐藥性增加對(duì)這些藥物在未來的使用構(gòu)成重大威脅，動(dòng)物生產(chǎn)在很大程度上仍然依賴于抗菌藥的廣泛使用，立即徹底禁止食品動(dòng)物使用抗菌素將對(duì)動(dòng)物健康、生產(chǎn)力和福利以及食品價(jià)格造成嚴(yán)重后果。在全球細(xì)菌耐藥性增加的同時(shí)新型抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)率顯著下降， PK/PD模型提供了防止細(xì)菌耐藥的策略和方法，最佳的治療方案既能達(dá)到最佳殺菌效果，又能最大限度抑制耐藥菌株的出現(xiàn)。Drusano等建立了將PK/PD研究與Monte Carlo模擬(Monte Carlo simulation，MCS)結(jié)合以確定最佳給藥方案的方法，MCS是一種計(jì)算機(jī)建模過程，它結(jié)合了藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的可變性和細(xì)菌種群內(nèi)的自然MIC分布，該技術(shù)可用于建立細(xì)菌的PK/PD折點(diǎn)，此方法已被FDA、EMEA等多個(gè)新藥審批機(jī)構(gòu)提倡和鼓勵(lì)，并廣泛應(yīng)用于新藥研發(fā)中，同時(shí)在國(guó)內(nèi)外也廣泛應(yīng)用于抗菌藥物的臨床研究中。本研究利用恩諾沙星在1、7和14日齡雛雞混飲給藥的藥動(dòng)學(xué)特征與美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)關(guān)于禽大腸桿菌對(duì)恩諾沙星的敏感性折點(diǎn)值(0.25 μg·mL)構(gòu)建PK/PD模型，結(jié)合MCS綜合評(píng)價(jià)恩諾沙星可溶性粉在雞給藥方案的合理性，不僅能為監(jiān)管部門對(duì)這類制劑上市后再評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)，且對(duì)延長(zhǎng)抗菌藥使用壽命、指導(dǎo)育雛期間合理用藥具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 恩諾沙星與鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)照品(純度≥99.8%)，批號(hào)分別為H0081505、H0101310，購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；恩諾沙星可溶性粉，規(guī)格：10%(以恩諾沙星計(jì))，批號(hào)：E9K191202，購自河北遠(yuǎn)征禾木藥業(yè)有限公司；乙腈、甲醇、色譜純購自美國(guó)TEDIA公司；85%濃磷酸分析純購自德國(guó)CNW公司；氫氧化鈉、三乙胺、分析純購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀(Waters2695，配Waters2475熒光檢測(cè)器)購自美國(guó)Waters公司；電子分析天平(BSI24S)購自德國(guó)賽多利斯天平公司；高速冷凍離心機(jī)(5180R)、微量移液器購自德國(guó)Eppendorf公司；純水儀(UPH-11-20T)購自四川優(yōu)普超純科技有限公司；水浴氮吹儀(N-EVAP)購自美國(guó)Organomation公司；微型旋渦混合儀(WH-3)購自上海滬西分析儀器廠有限公司；KS-250D超聲儀購自寧波科生儀器廠；有機(jī)針式濾器(0.22 μm)購自上海安譜科技有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 健康白羽肉雞，購自江蘇八達(dá)畜禽公司；1日齡雛雞給藥第0天平均體重為(42.0±2.5)g；給藥第4天為(109.0±1.6)g。7日齡雛雞給藥第0天平均體重為(163.0±2.1)g；給藥第4天為(300.0±1.8)g。14日齡雛雞給藥第0天平均體重為(402.0±2.2)g；給藥第4天為(524.0±2.6)g。飼料為雛雞全價(jià)飼料，由揚(yáng)州旺旺飼料廠提供。試驗(yàn)期間，雛雞飼養(yǎng)環(huán)境溫度1日齡為34～37 ℃；7日齡為31～36 ℃；14日齡為28～32 ℃。飼養(yǎng)環(huán)境濕度為42%～68%。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥 600只1日齡雛雞隨機(jī)分為3組，每組200只。第1組處理組于1日齡時(shí)即混飲給藥，第2組處理組飼養(yǎng)至7日齡時(shí)始混飲給藥，第3組處理組飼養(yǎng)至14日齡時(shí)開始混飲給藥。3個(gè)處理組給藥方案均為恩諾沙星可溶性粉臨床推薦劑量的最高限量即75 mg·L(以恩諾沙星計(jì))混飲，連用5 d(第1日記為給藥第0天，第5日記為給藥第4天)。另設(shè)一平行對(duì)照組，根據(jù)其日飲水量和雛雞體重?fù)Q算為24 h藥物攝入量。

混飲藥液現(xiàn)配現(xiàn)用，每日第一次給藥時(shí)間均為上午08：00，根據(jù)雛雞的飲水量及時(shí)補(bǔ)充或更換。

1.2.2 給藥后血樣采集及血漿中恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星含量測(cè)定 在混飲給藥的第0天開始采集血樣，時(shí)間點(diǎn)分別為0 (給藥前)、0.5、1、2、3、4、6、8、12 h；第1、2天混飲給藥期間每日采集血樣時(shí)間點(diǎn)分別為0(給藥前)、3、6、8和12 h；第3天采集血樣時(shí)間點(diǎn)分別為0(給藥前)、0.5、1、2、4、6、8和12 h；第4天采集血樣時(shí)間點(diǎn)分別為0(給藥前)、0.5、1、2、4、6、8、12和24 h。各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取5只雛雞，通過頸靜脈采集血樣，每只雞一次性采血1～2 mL，置于含有肝素鈉的離心管中，4 000 r·min離心10 min分離血漿，于-20 ℃冰箱中凍存待用。

血漿中恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星的含量采用經(jīng)驗(yàn)證的HPLC方法檢測(cè)。色譜參考條件：色譜柱為Agilent HP-C(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.05 mol·L磷酸/三乙胺(pH=3.0)，乙腈(820 mL·L)；流速：0.8 mL·min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)278 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm。準(zhǔn)確度和精密度通過空白血漿樣品添加標(biāo)準(zhǔn)工作液的回收率和變異系數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，測(cè)定結(jié)果帶入當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的含量。

1.2.3 Monte Carlo模擬 使用Crystal ball 11.1軟件進(jìn)行MCS，置信區(qū)間為95%，模擬恩諾沙星對(duì)大腸桿菌的/估值，模擬10 000次。模擬過程中AUC選擇1、7和14日齡雛雞給藥第4天實(shí)測(cè)值，遵循對(duì)數(shù)正態(tài)分布；MIC遵循自定義分布，大腸桿菌分布來源于文獻(xiàn)[24]；以/≥100的估值作為靶值，達(dá)標(biāo)率(target attainment rate,)≥90%表明當(dāng)前給藥方案預(yù)期可獲得滿意療效，并防止細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及分析 使用Phoenix WinNonlin 8.1軟件處理平均血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，采用非房室模型分析方法計(jì)算相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)；使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 雞血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量測(cè)定的HPLC方法驗(yàn)證

空白基質(zhì)、空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)品及1日齡雛雞給藥第4天實(shí)測(cè)色譜圖分別見圖1～3。在本試驗(yàn)所建立的色譜條件下，恩諾沙星的出峰時(shí)間在8.9 min左右，環(huán)丙沙星的出峰時(shí)間在7.0 min左右，待測(cè)組分能夠與溶劑峰及基質(zhì)組分完全分開，且峰形良好。在0.02～2.5 μg·mL濃度，恩諾沙星和環(huán)丙沙星藥物濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系(≥0.999)，檢測(cè)限()和定量限()分別為0.01和0.02 μg·mL。在定量限(0.02 μg·mL)和低、中、高3個(gè)添加濃度(0.05、0.5、2.5 μg·mL)恩諾沙星的平均回收率為95.16%～105.02%，批內(nèi)變異系數(shù)<5.65%，批間變異系數(shù)<5.84%；環(huán)丙沙星的平均回收率為88.42%～100.8%，批內(nèi)變異系數(shù)<5.16%，批間變異系數(shù)<6.58%。

圖1 空白血漿色譜圖Fig.1 Blank plasma chromatogram

A.環(huán)丙沙星色譜峰；B.恩諾沙星色譜峰A. The chromatographic peak of ciprofloxacin; B. The chromatographic peak of enrofloxacin圖2 空白血漿添加混合標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖(0.02 μg·mL-1)Fig.2 Blank plasma added with mixed standard solution chromatogram (0.02 μg·mL-1)

A.環(huán)丙沙星色譜峰；B.恩諾沙星色譜峰A. The chromatographic peak of ciprofloxacin; B. The chromatographic peak of enrofloxacin圖3 1日齡雛雞給藥第4天血漿色譜圖Fig.3 Plasma chromatogram of one day old chicks on the 4th day after administration

2.2 恩諾沙星可溶性粉在雛雞混飲給藥的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

1、7和14日齡雛雞處理組在給藥第0～4天平均血藥濃度分別為0.458～0.629、0.435～0.714和0.391～0.561 μg·mL，給藥第0和第4天的恩諾沙星平均血藥濃度-時(shí)間曲線分別見圖4、5，整個(gè)給藥期間的恩諾沙星平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖6。除1和7日齡雛雞處理組在給藥第1天以及1和14日齡雛雞處理組在給藥第4天的平均血藥濃度有顯著差異外(<0.05)，給藥期間其他時(shí)間段不同日齡雛雞恩諾沙星平均血藥濃度均無顯著差異(≥0.05)。

圖4 1、7和14日齡雛雞處理組在給藥第0天的恩諾沙星平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.4 The mean plasma drug concentration-time curve of 1, 7 and 14 day olds chicks on day 0 of administration

圖5 1、7和14日齡雛雞處理組在給藥第4天的恩諾沙星平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.5 The mean plasma drug concentration-time curves of 1, 7 and 14 day-olds chicks in treatment groups on the 4th day of administration

圖6 1、7和14日齡雛雞處理組在整個(gè)給藥期間的恩諾沙星平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.6 Mean plasma concentration-time curves of 1, 7 and 14 day-olds chicks in treatment groups during the whole administration period

對(duì)1、7和14日齡雛雞處理組第0和4天平均血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)處理獲得相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，見表1。

表1 1、7和14日齡雛雞處理組在給藥第0和4天的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 1 Pharmacokinetic parameters of 1, 7 and 14 day-olds chicks on day 0 and day 4 of administration

鑒于環(huán)丙沙星在雛雞血漿濃度過低，選擇恩諾沙星作為PK計(jì)算標(biāo)志物。

2.3 PK/PD參數(shù)折算值

將本試驗(yàn)所得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與恩諾沙星對(duì)禽大腸桿菌敏感性折點(diǎn)值(0.25 μg·mL)進(jìn)行比值計(jì)算，1、7和14日齡雛雞處理組給藥第4天的/分別為2.40、2.20和1.95，/分別為2.05、1.97和1.73，/分別為49.24、47.28和41.48。

2.4 Monte Carlo模擬結(jié)果

不同日齡雛雞恩諾沙星可溶性粉混飲給藥第4天在大腸桿菌臨床分離株不同范圍內(nèi)的TAR見圖7。恩諾沙星對(duì)≤0.25 μg·mL的大腸桿菌臨床分離株，給藥第4天TAR分別為76.11%、75.21%和75.01%，敏感度為27%～30%；在≤0.12 μg·mL的菌株≥90%。

A. 1日齡雛雞給藥第4天；B. 7日齡雛雞給藥第4天；C. 14日齡雛雞給藥第4天A. Day 4 of administration for 1 day-old chicks; B. Day 4 of administration for 7 day-old chicks; C. Day 4 of administration for 14 day-old chicks圖7 恩諾沙星可溶性粉75 mg·L-1混飲給藥對(duì)大腸桿菌臨床分離株在不同MIC范圍內(nèi)的TARFig.7 The TAR of enrofloxacin at 75 mg·L-1 mixed drinks within different MIC ranges of Escherichia coli clinical isolates

3 討 論

3.1 恩諾沙星可溶性粉混飲給藥在不同日齡雛雞的藥動(dòng)學(xué)特征

恩諾沙星可溶性粉在1、7和14日齡雛雞連續(xù)混飲5 d，在給藥第0天藥物攝入量分別為42.86、54.86和36.24 mg·kg，在給藥第4天藥物攝入量分別為54.52、38.07和35.43 mg·kg。與Kang等報(bào)道恩諾沙星10 mg·kg在肉雞口服給藥(為0.65 h；為3.82 μg·mL)相比，藥物攝入量更多，同時(shí)1、7和14日齡雛雞給藥第0天的與其相比更晚，且更低。1、7和14日齡雛雞首次給藥后，分別于12、24和12 h檢測(cè)出環(huán)丙沙星，整個(gè)試驗(yàn)期間所有雛雞體內(nèi)環(huán)丙沙星的血藥濃度均未超過0.1 μg·mL。3個(gè)日齡處理組雛雞在首次給藥24 h和之后各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度均相對(duì)接近；除1日齡和7日齡雛雞處理組在給藥第1天以及1和14日齡雛雞處理組在給藥第4天的平均血藥濃度有顯著性差異外，其他時(shí)間段不同日齡雛雞處理組的平均血藥濃度均無顯著性差異。結(jié)果表明，恩諾沙星可溶性粉在健康雛雞混飲給藥，雛雞日齡對(duì)恩諾沙星血藥濃度無明顯影響；按推薦給藥方案混飲給藥12 h后才能在雛雞體內(nèi)檢測(cè)出代謝物環(huán)丙沙星，且檢出量很低。

3.2 PK/PD參數(shù)與TAR對(duì)臨床用藥的指導(dǎo)意義

氟喹諾酮類藥物屬于濃度依賴型抗菌藥，評(píng)估此類藥物的主要 PK/PD 參數(shù)為/和/。氟喹諾酮類藥物的PK/PD參數(shù)與療效密切相關(guān)，一般認(rèn)為/>8或/>100時(shí)，抗菌效果良好。同時(shí)，/和/也可用于預(yù)測(cè)治療過程中耐藥性出現(xiàn)的可能性，在Blaser等的研究中，只有/>8時(shí)，細(xì)菌才不易產(chǎn)生耐藥性；Tomas等研究表明，當(dāng)/<100時(shí)，無論使用何種抗菌療法，大約50%的分離微生物在開始治療的4 d內(nèi)獲得耐藥性，且在治療的最初24 h內(nèi)，必須達(dá)到較高的/，才能有效殺滅病原體。Toutain等指出，應(yīng)選擇達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)的構(gòu)建抗菌藥物PK/PD模型，因此使用1、7和14日齡雛雞在給藥第4天的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算。CLSI給出的恩諾沙星對(duì)禽大腸桿菌敏感性折點(diǎn)值為0.25 μg·mL，以和與折點(diǎn)值的比值分別評(píng)價(jià)恩諾沙星混飲給藥方案對(duì)敏感菌的殺滅效果及誘導(dǎo)耐藥性的作用。依據(jù)本試驗(yàn)獲得的PK參數(shù)值，得出 1、7和14日齡雛雞處理組給藥第4天/及/均接近或大于2，理論上對(duì)所有敏感性大腸桿菌均具有抑制或殺滅效果，但未達(dá)最佳比值，無法發(fā)揮最佳治療效果。給藥期間，/為41.48～49.24，亦未達(dá)最佳PK/PD比值，對(duì)部分恩諾沙星敏感性大腸桿菌易誘導(dǎo)耐藥性。將1、7和14日齡雛雞給藥第4天和值代入上述不等式計(jì)算范圍，顯示當(dāng)前給藥方案對(duì)≤0.06 μg·mL的大腸桿菌具有最佳殺滅作用；可限制≤0.10 μg·mL的菌株產(chǎn)生耐藥性；對(duì)≤0.06 μg·mL的菌株發(fā)揮最佳殺菌效果的同時(shí)可避免誘導(dǎo)耐藥。

PK/PD模型對(duì)評(píng)價(jià)抗菌藥物給藥方案具有重要意義，將禽大腸桿菌對(duì)恩諾沙星敏感性折點(diǎn)值作為PK參數(shù)，能夠直接反映當(dāng)前給藥方案對(duì)全部敏感菌的作用。同時(shí)，MCS將PK/PD模型與細(xì)菌自然分布結(jié)合，預(yù)測(cè)抗菌藥物對(duì)臨床感染菌株的療效，是科學(xué)評(píng)價(jià)給藥方案必不可少的環(huán)節(jié)。Booker等發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮類藥物的/能更好地反映PK與PD之間的關(guān)系，因此選用/作為PK/PD參數(shù)進(jìn)行MCS。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道，選擇/≥100作為PK/PD靶值。某種細(xì)菌在某一特定下，≥90%時(shí)，提示該給藥方案對(duì)不高于該的感染菌株達(dá)到預(yù)期治療效果，且能防止耐藥性產(chǎn)生。歐洲藥敏委員會(huì)(EUCAST)MIC數(shù)據(jù)庫(https://mic.eucast.org/)中檢索得到恩諾沙星對(duì)3 039株大腸桿菌的分布中91%分布在0.06 μg·mL及以下，與中國(guó)大腸桿菌臨床分離株的分布有一定區(qū)別，選擇中國(guó)大腸桿菌臨床分離株的分布對(duì)指導(dǎo)臨床用藥更具實(shí)際意義。本研究選擇Sang等2016年于中國(guó)5個(gè)省份肉雞中分離得到的929株大腸桿菌臨床分離株分布，其中，310株大腸桿菌的≤0.25 μg·mL，230株≤0.06 μg·mL。結(jié)果顯示，恩諾沙星對(duì)大腸桿菌臨床分離株的≤0.25 μg·mL時(shí)，1、7和14日齡雛雞給藥期間在75.01%～76.11%，未達(dá)90%，即恩諾沙星可溶性粉按當(dāng)前給藥方案給藥，無法對(duì)恩諾沙星敏感性大腸桿菌發(fā)揮最大殺菌作用，且易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性，僅能在≤0.12 μg·mL的大腸桿菌獲得預(yù)期療效。MCS結(jié)果中的敏感度指模擬過程中各變量的敏感程度，敏感度為27%～30%，表明當(dāng)前給藥方案對(duì)模型存在一定影響。

4 結(jié) 論

本研究在不同日齡雛雞開展恩諾沙星可溶性粉混飲給藥的藥動(dòng)學(xué)研究，獲得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，采用PK/PD與MCS相結(jié)合的方法，評(píng)價(jià)恩諾沙星可溶性粉在雛雞混飲給藥方案對(duì)大腸桿菌的有效性。結(jié)果提示，恩諾沙星可溶性粉當(dāng)前推薦給藥方案在雛雞對(duì)大腸桿菌殺菌效果有限，且易誘導(dǎo)部分敏感菌產(chǎn)生耐藥性，長(zhǎng)期在育雛期使用當(dāng)前給藥方案，將導(dǎo)致我國(guó)雞源大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的高水平耐藥加劇。給藥途徑的改變、新劑型的研發(fā)以及合理使用抗菌藥的科普等對(duì)延長(zhǎng)恩諾沙星使用壽命、減少細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生具有重要意義。