我國H5和H7N9亞型高致病性禽流感的監(jiān)測及疫情暴發(fā)分析

周 勇，李知新，魯宏偉，孫 燕，李 甜，杜凡姝，蒲 娟*

(1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193； 2.寧夏動物疾病預防控制中心，銀川 750011； 3.銀川海關，銀川 750006)

禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)屬于A型流感病毒(influenza A virus，IAV)，是一種危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展和威脅人類生命健康的重要人獸共患病病原，其基因組由8個節(jié)段的單股負鏈 RNA 組成，可編碼PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1及NS2等多種功能蛋白及附件蛋白，其中，HA和NA是流感病毒的表面蛋白，也是主要的抗原蛋白。根據(jù)它們的抗原性差異，目前發(fā)現(xiàn)的IAV可分為18個HA亞型和11個NA亞型，其自然宿主是野生水禽，但也可感染人類、豬、雞、鴨等多種生物，不過，H17N10和H18N11亞型IAV目前僅在蝙蝠體內發(fā)現(xiàn)。歷史上人類經歷過的4次全球流感大流行當中，目前，認為AIV的基因片段參與了1957年H2N2，1968年H3N2以及2009年H1N1大流行流感病毒的形成。同時，很多亞型的AIV已突破種間屏障，獲得直接感染人的能力，截至2021年9月，全球已報道的能夠直接感染人的AIV多達14種，包括H5(H5N1、H5N6、H5N8)、H7(H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9)、H9N2、H10(H10N3、H10N7、H10N8)、H6N1、H4N8亞型，其中H5、H7亞型AIV感染人類可引起較高的致死率，對公共衛(wèi)生的威脅尤為突出。

H5及H7N9亞型HPAIV引起的禽HPAI死亡率可達100%，一旦發(fā)病，同群動物將被全部撲殺，造成重大的經濟損失。1996年，H5N1亞型HPAIV在廣東省首次被鑒定，在隨后20多年的時間里，H5N1病毒在多種禽類宿主中廣泛流行，已經傳播到全球60多個國家和地區(qū)。1997年，中國香港報道了全球首例人感染H5N1禽流感病例，之后全球多地均報告了人感染病例。除N1以外，H5病毒的NA還主要包括N2、N6、N8等多種亞型，它們的基因大多來源于2.3.4.4分支。自2014年，H5病毒隨候鳥遷徙形成世界性流行。2013年，中國首次暴發(fā)人感染新型H7N9亞型禽流感疫情，并隨即在養(yǎng)殖場和活禽市場分離到大量陽性樣本，溯源分析表明，它的出現(xiàn)與各種亞型AIV在禽群間的流行密切相關。

H5和H7N9等禽流感的防控對于養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展以及人類公共衛(wèi)生均具有重大意義。本文通過對我國內地(不包含港澳臺)流行的H5和H7N9等亞型HPAI的暴發(fā)情況以及監(jiān)測數(shù)據(jù)進行回顧性分析，闡明其流行和發(fā)生規(guī)律，以期為禽流感的預警和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 H5及H7N9病毒HA基因序列的收集與比對

從NCBI和GISAID流感病毒數(shù)據(jù)庫分別下載1996-2021年H5亞型AIV基因序列和2013-2021年H7N9亞型AIV基因序列，然后基于序列名去除兩個數(shù)據(jù)庫中的重復序列。對去重后的序列分別使用MAFFT本地工具進行多序列比對(MSA)，手動糾正比對過程中的移碼錯誤。

1.2 進化樹的構建與美化

將比對好的序列文件使用IQ-TREE本地工具構建最大似然法(ML)進化樹，H5進化樹以A/Goose/Guangdong/1/1996為根，H7N9進化樹以A/Anhui/1/2013為根。疫苗株標注與局部放大圖用Adobe Illustrator軟件進行美化。

1.3 監(jiān)測數(shù)據(jù)、疫苗株數(shù)據(jù)和疫情暴發(fā)數(shù)據(jù)的收集

通過農業(yè)農村部官方網站的疫情發(fā)布、獸醫(yī)公報以及中國獸藥信息網等搜集監(jiān)測數(shù)據(jù)、疫苗株數(shù)據(jù)和疫情暴發(fā)數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計、整理和分析，使用Graphpad prism 8進行圖形制作和排版。

2 結 果

2.1 H5亞型AIV在我國的流行概述

H5亞型AIV是造成我國養(yǎng)禽業(yè)損失的重要病原，其中，主要以H5N1、H5N2、H5N6和H5N8等亞型為主，在我國家禽和野鳥中多次引發(fā)疫情。1996年，葉潤全等從廣東省病死的家鵝體內分離出第一株H5N1亞型HPAIV(A/Goose/Guangdong/1/96)。1997年，香港報道了全球首例人感染高致病性H5N1禽流感病例，為此香港政府緊急撲殺了約150萬只雞、鴨、鵝和鴿，此次疫情共造成18人感染，6人死亡。根據(jù)溯源分析，此次感染人的H5N1重排了H9N2和H6N1亞型AIV的內部基因片段。此后，監(jiān)測結果顯示，H5N1亞型AIV在我國禽群中廣泛流行，2004年1月，廣西壯族自治區(qū)家禽中暴發(fā)H5N1亞型HPAI，在之后的短短20 d，疫情迅速蔓延到全國各地，16個省累計發(fā)生疫情49起，主要集中在廣西、廣東、湖北、湖南、江西、浙江和上海等中國南部和東部地區(qū)。2005年，青海湖候鳥大規(guī)模感染H5N1亞型HPAIV，造成6 000多只候鳥死亡，這是全球首次報道H5N1亞型HPAIV可導致野鳥死亡，引發(fā)全世界廣泛關注。2005年年底，農業(yè)部要求“在全國范圍內對禽類全面實施強制免疫，對所有水禽和散養(yǎng)禽開展集中免疫，免疫密度要達到100%”。之后，我國H5N1疫情暴發(fā)率有所下降。但在2006年和2009年，玉樹縣濕地的斑頭雁和青海湖的野鳥中再度暴發(fā)H5N1亞型HPAI疫情，H5N1的傳播和變異速度之快引發(fā)全球高度關注。2008年，世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)基因特點，將H5分為10個不同的進化分支，分別為Clade 0～9，其中，一些分支下又進化形成了不同的亞分支，不同的分支之間抗原性存在明顯差異。過去20多年間，我國流行的H5毒株主要可分為3個分支(圖1A)，包括Clade7(7.2)、Clade2.3.2和Clade2.3.4.4，據(jù)最新進化分析，2020-2021年我國主要流行2.3.4.4b及2.3.4.4 h分支，而未分離到7分支和2.3.2分支病毒(圖1)。

圖1 我國H5病毒HA基因的遺傳演化及目前流行分支Fig.1 The genetic evolution of the HA gene of H5 virus and the current epidemic clade

2013年12月17日，河北省保定市一個蛋雞養(yǎng)殖場突發(fā)H5N2亞型HPAI疫情，死亡4 000只雞，這是中國內地首例H5N2亞型HPAI疫情。據(jù)農業(yè)農村部獸醫(yī)公報，截至2021年9月，我國內地共報告禽間3起H5N2亞型HPAI疫情，撲殺約22萬相關易感動物。2014年2月，中國首次報道人感染高致病性H5N6禽流感病例。該事件之后，主動監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示H5N6亞型AIV在我國南方活禽市場大量存在，并隨時有感染人的風險，目前H5N6已取代H5N1成為我國禽群中主要流行的H5亞型AIV。2014-2017年，韓國、日本、歐洲及北美等地暴發(fā)了上千起高致病性H5N8亞型禽流感野鳥及家禽疫情，2020年，H5N8亞型HPAIV隨野鳥遷徙傳入我國，雖然尚未引起家禽暴發(fā)，但已導致我國多起野鳥疫情，提示人們需要進一步加強監(jiān)測H5N8在野鳥中的傳播，并密切評估對我國家禽的影響。

2.2 H7N9亞型AIV在我國的流行概述

2013年3月，我國向WHO通報了3例人感染新型H7N9亞型AIV病例，均表現(xiàn)呼吸道感染以及嚴重肺炎和呼吸困難并最終死亡，隨后，我國多個省份陸續(xù)報道了新型H7N9 AIV感染人事件，值得注意的是，此次感染人的H7N9是一種低致病性禽流感病毒。根據(jù)溯源分析，新型H7N9亞型AIV是一種三源重配病毒，其基因與在我國浙江省的鴨體內分離到的H7N3病毒同源性最高，基因則與鴨或野鳥中的H2N9、H4N9、H7N9或H11N9的親緣關系最近，6個內部基因則完全來自于家禽中流行的H9N2亞型AIV。2016年，廣東省首次分離出H7N9亞型HPAIV，鑒于H7N9的這一變化，農業(yè)農村部宣布自2017年秋季起對H7N9亞型HPAI實行強制免疫。在疫苗的保護下，H7N9在禽群中的暴發(fā)率顯著下降。截至2021年9月，禽類中共暴發(fā)H7N9亞型HPAI疫情13起，撲殺約90萬易感動物。H7N9病毒在我國人群中主要引起5波疫情，直至對H7N9亞型HPAI實施強制免疫后，才有效阻斷了H7N9亞型AIV在人群中的傳播。目前，H7N9病毒在我國穩(wěn)定流行，其基因進化形成明顯的長江三角洲及珠江三角洲分支(圖2A)，而高致病性H7N9病毒自2016年起源于珠江三角洲，隨后傳播至全國各地。

圖2 我國H7N9病毒HA基因的遺傳演化及目前流行毒株Fig.2 The genetic evolution of the HA gene of H7N9 virus and the current circulating strains

研究表明，H5和H7N9亞型AIV在我國的一系列流行事件(圖3)與H9N2亞型AIV的廣泛流行密切相關。H9N2經過一系列重排和變異，成為我國目前養(yǎng)殖雞場分離率最高的流感病毒亞型。H9N2病毒不僅可以感染人，它還通過提供全部6個內部基因給H5、H7等亞型流感病毒形成致病性和適應性更強的新型病毒，H9N2病毒和這些新型病毒持續(xù)引發(fā)禽群和人類感染，造成極大的危害，成為我國禽流感防控的一大難題。

圖3 H5和H7N9亞型禽流感在我國的主要流行事件Fig.3 Main epidemic events of H5 and H7N9 subtypes of avian influenza in China

2.3 H5和H7N9亞型禽流感疫苗更新與動態(tài)監(jiān)測

免疫預防和撲殺相結合是我國防控HPAI所采取的主要措施，我國分別于2005年和2017年起對H5和H7N9亞型禽流感實施強制免疫。但由于這兩種亞型AIV抗原性不斷發(fā)生變化，需及時針對流行的優(yōu)勢毒株更新疫苗株。因此，我國強制免疫推薦疫苗會根據(jù)當年的AIV流行趨勢而有所變化。表1統(tǒng)計了自2005年對HPAI實施強制免疫以來的國家強制免疫推薦疫苗的更替及相關供體毒株信息，由于病毒的抗原性變異速度快，截至2021年，H5亞型高致病性禽流感Re系列疫苗已更新至Re-11和Re-12(圖1A)，分別對應2.3.4.4 h分支和2.3.2.1分支毒株。根據(jù)遺傳演化分析發(fā)現(xiàn)，Re-12對應的2.3.2.1分支H5在2020—2021年已經不再流行，而2.3.4.4b分支開始流行且目前尚無對應疫苗，提示H5亞型HPAI需要進行疫苗更新(圖1)。而H7N9亞型禽流感疫苗從2017年的Re-1已更新至Re-3(圖2A，表1，截至2021年)。同樣根據(jù)遺傳演化分析發(fā)現(xiàn)，目前流行的H7N9亞型HPAIV與Re-3雖然進化關系較近(圖2B)，但抗原性已經發(fā)生變化，疫苗可能需要再進行更新。

檢測免疫動物血清抗體有利于評價疫苗免疫的合格率，病原學檢測有利于了解AIV的流行情況，其中活禽市場的監(jiān)測對于評估人類感染AIV風險及病原溯源有著重要意義。農業(yè)農村部每月都會組織各級檢測機構對動物樣品進行數(shù)萬份的血清學檢測和病原學檢測，及時發(fā)現(xiàn)禽流感的流行和變異情況，為禽流感的暴發(fā)提供預警。作者統(tǒng)計了2004-2021年農業(yè)農村部公布的監(jiān)測數(shù)據(jù)，主要包括監(jiān)測樣品總數(shù)、免疫動物血清樣品數(shù)、免疫合格率、非免疫動物血清樣品數(shù)、病原學樣品數(shù)及相關陽性樣品數(shù)及陽性率等。監(jiān)測結果顯示(圖4，表2～4)，我國每年檢測H5及H7N9總樣品數(shù)都超過百萬份(圖4A，D)，其中主要為免疫動物血清樣品及病原學樣品，以用于評判免疫合格率和病原陽性率。數(shù)據(jù)顯示，自2005年和2017年分別對H5和H7N9實施強制免疫以來，我國家禽H5/H7N9亞型疫苗免疫合格率基本保持在90%以上(僅2006、2007和2009年未達90%)(圖4B、E)，有效控制了禽流感疫情的暴發(fā)。同時，H5和H7N9亞型禽流感病原學樣品陽性率也保持在極低的水平(圖4C、F)，2017年H7N9的非免疫血清樣品陽性率陡增(圖4F)，這與H7N9突變?yōu)楦咧虏⌒悦芮邢嚓P。值得注意的是，2021年，H5的病原樣品陽性率有大幅提升(圖4C)。

A. H5亞型樣品監(jiān)測量；B. H5亞型免疫合格率；C. H5亞型病原學樣品陽性率；D. H7N9亞型樣品監(jiān)測量；E. H7N9亞型免疫合格率；F. H7N9亞型病原學及非免疫血清樣品陽性率A. The number of samples of H5 subtype; B. The qualified rate of immunity of H5 subtype; C. The positive rate of pathogenic samples of H5 subtype; D. The number of samples of H7N9 subtype; E. The qualified rate of immune of H7N9 subtype; F. Positive rate of samples of H7N9 subtype圖4 H5和H7N9亞型HPAI的監(jiān)測Fig.4 Surveillance of H5 and H7N9 subtypes of HPAI

2.4 H5和H7N9亞型禽流感暴發(fā)特點分析

2.4.1 各亞型疫情數(shù) 據(jù)官方公布數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2004—2021年，由于H5以及H7N9疫情影響，我國已共計撲殺相關易感動物近1 600萬只(不完全統(tǒng)計)，給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來重大損失(表5)。其中，H5N1亞型AIV是對我國養(yǎng)殖業(yè)造成損失最大的AIV亞型，共有疫情119起，其次是H5N6，共有疫情36起。但最近幾年，H5N1的暴發(fā)趨勢有所放緩，H5N6和H5N8在逐漸抬頭，2020-2021年，我國內地連續(xù)發(fā)生多起H5N6及H5N8野鳥疫情，值得高度關注。

表5 2004年1月-2021年9月各亞型HPAI疫情暴發(fā)情況Table 5 Outbreaks of HPAI epidemics of various subtypes from January 2004 to September 2021

2.4.2 疫情年份分布 按年份統(tǒng)計我國報告的禽間HPAI疫情情況，我國自2004年廣泛暴發(fā)H5N1亞型HPAI之后，陸續(xù)又出現(xiàn)H5N2、H5N6、H7N9、H5N8等HPAI疫情。2004—2006年，HPAI疫情呈現(xiàn)高發(fā)狀態(tài)(2004年50起，2006年16起，2007年19起)，自2005年實施H5亞型HPAI強制免疫后，2007年疫情得到控制。但是從2015年開始，H5亞型HPAI疫情數(shù)量又有所回升(2015年12起，2016年10起，2017年12起，2018年13起)，且H5N6已取代H5N1成為我國流行的主要H5亞型AIV。同時，隨著H5N8的傳入(2021年1—9月份6起)，使得防控形勢更加嚴峻(圖5)。

圖5 2004年1月-2021年9月我國HPAI疫情暴發(fā)數(shù)量Fig.5 Number of HPAI outbreaks in China from January 2004 to September 2021

2.4.3 疫情月份分布 從2004年1月—2021年9月，我國共報告178起HPAI疫情，其中，4—9月共報告54起，10月—次年3月共124起(圖6A)；同時，根據(jù)病原學監(jiān)測結果顯示，陽性樣本大部分都檢出在10月—次年3月，表明禽流感疫情冬春季多發(fā)，符合禽流感病原特性。

A.疫情月份分布；B.疫情宿主分布A. The month distribution of the epidemic; B. The distribution of the host of the epidemic圖6 2004年1月-2021年9月我國HPAI疫情暴發(fā)時間段及宿主分布Fig.6 The time period and host distribution of the HPAI outbreak in China from January 2004 to September 2021

2.4.4 疫情省份分布 按地理位置進行分析，我國大部分省份均暴發(fā)過HPAI疫情，沒有明顯的地域局限性，但存在多發(fā)和少發(fā)的區(qū)別。從南北方來看，湖南、湖北、廣東等南方地區(qū)發(fā)生疫情99起，北方地區(qū)79起，相對而言南方地區(qū)疫情較為多發(fā)，特別是兩湖(湖南、湖北)及廣東地區(qū)(表6)。但在2020—2021年，北方野鳥H5N6及H5N8疫情有所增加，僅2020年年初新疆連續(xù)發(fā)生5起野鳥感染H5N6疫情，2021年，在山東、北京、西藏、陜西和寧夏發(fā)生5起野鳥感染H5N8以及遼寧發(fā)生1起野鳥感染H5N6疫情，而南方只有江蘇發(fā)生1起H5N8野鳥疫情(圖5，表6)，這提示H5N6和H5N8在野鳥中有了進一步傳播，且主要在北方地區(qū)，需要引起重視。

表6 2004年1月-2021年9月我國HPAI疫情暴發(fā)省份分布Table 6 Distribution of HPAI epidemics in provinces from January 2004 to September 2021

2.4.5 疫情宿主分布 根據(jù)暴發(fā)的HPAI疫情統(tǒng)計，雞群中暴發(fā)的疫情次數(shù)最多，共有128起，其次是鴨，共有38起，此外，野鳥疫情也不容忽視，共有26起(圖6B)，且主要集中在2020年之后，僅2020年—2021年9月已報告13起。

2.4.6 H5和H7N9亞型AIV的公共衛(wèi)生學危害 H5和H7N9亞型AIV不僅可以感染禽，同時還可以跨越種間屏障感染人。據(jù)WHO數(shù)據(jù)，2003—2021年12月，全球共報道了863例人感染高致病性H5N1亞型禽流感病例，患者死亡率高達52.8%(456/863)，病例覆蓋東亞、東南亞、西亞以及非洲的18個國家，其中，我國53例，31例死亡，死亡率達58.5%，高于世界平均水平；自2014年4月我國首次報道人感染高致病性H5N6禽流感，截至2021年12月，全球共計報道了53例病例，其中52例發(fā)生在我國，1例來自老撾；2021年2月，俄羅斯境內發(fā)現(xiàn)全球首批7例人感染高致病性H5N8禽流感病例；2013年到2017年，H7N9亞型AIV在我國人群中造成5波嚴重疫情，共造成1 534人感染，在禽群中對H7N9禽流感進行強制免疫后，H7N9人間疫情被阻斷，2018-2021年，僅報道了3例病例，且2019年4月之后無新增病例。截至2021年12月，我國內地累計報告人感染H7N9禽流感病例1 537例，病死率39.8%。

3 小結與展望

禽流感作為一種動物源性人獸共患病，對養(yǎng)禽業(yè)和人類健康均構成嚴重威脅。由于AIV亞型多，且基因組為分節(jié)段的RNA片段，所以很容易發(fā)生突變和重排，且生態(tài)傳播鏈復雜，防控極為困難。總結全文，我國禽流感暴發(fā)具有以下幾個特點。

第一，我國屬于禽流感疫情多發(fā)國，特別是H5和H7N9高致病性禽流感嚴重威脅我國養(yǎng)禽產業(yè)和人類生命健康。我國疫情多發(fā)可能由多個因素共同決定，首先，我國家禽養(yǎng)殖業(yè)體量大，中小規(guī)模居多，部分養(yǎng)殖場基礎設施和生物安全措施相對不足；其次，雖然實施了強制免疫，但仍存在禽流感疫苗免疫空白，水禽免疫密度較低等問題；此外，我國地域遼闊，野生鳥類繁多，并處于三條候鳥遷徙路線上，野鳥作為AIV的自然宿主，體內存在多種亞型流感病毒，在遷徙的過程中，可與遷徙路線上的養(yǎng)殖禽類接觸而造成AIV傳播；另外，地區(qū)間的活禽貿易也會促進AIV的交流和傳播。

第二，我國采取的強制免疫和撲殺相結合的方式能夠有效降低我國HPAI疫情的暴發(fā)，但H5及H7N9病毒的抗原性變異快，需要持續(xù)監(jiān)測，疫苗需要及時迭代。2020年以來，H5N8高致病性禽流感疫情導致韓國和日本撲殺超過2 000多萬只家禽，而我國雖然在野生鳥類中也發(fā)現(xiàn)了H5N8病毒，但在家禽中沒有引起疫情暴發(fā)，研究表明,實施家禽疫苗接種在其中發(fā)揮著關鍵的作用。盡管如此，持續(xù)的野鳥疫情以及病毒的頻繁變異使我們仍需高度重視，需要有針對性地更新疫苗；同時，根據(jù)相關文章數(shù)據(jù)顯示，目前，我國使用的H7N9疫苗與流行的H7N9病毒存在較大抗原差異，需要更新疫苗。

第三，H5及H7N9病毒的暴發(fā)頻率與宿主、氣候以及野鳥遷徙均存在一定關聯(lián)。不同NA亞型的H5對宿主的易感性存在一定差異。同時，禽流感病毒適宜在溫度較低的冬春季節(jié)傳播，而這段時期也剛好是野鳥遷徙的主要時間段，野鳥作為H5病毒長途傳播的重要載體，其遷徙促進了不同地區(qū)的禽流感病毒重配和疫情暴發(fā)。

免疫和撲殺相結合的方式雖然可以有效降低H5和H7N9亞型HPAI的暴發(fā)，降低經濟損失，但禽流感疫情仍時有暴發(fā)，提示僅靠疫苗免疫防控禽流感尚有不足，還需要不斷強化和優(yōu)化禽流感防控體系。首先，做好生物安全是防控禽流感的首要任務。養(yǎng)殖場應建立健全生物安全防控措施，根據(jù)實際情況總結適合本地實際的家禽生物安全防護措施，并加強養(yǎng)殖人員技術和生物安全意識培訓，切實提高防疫能力；其次，由于各種亞型禽流感病毒流行的區(qū)域和感染的宿主存在差異，疫苗免疫后的效果也各不相同，所以疫苗免疫應注重當?shù)貙嶋H的流行狀況，實現(xiàn)精準防控；最后，還應加強防疫部門與生態(tài)部門的聯(lián)動。越來越多的研究表明，環(huán)境因素如植被結構、濕地水質、氣候條件、野鳥群落組成及其密度以及野鳥之間接觸的改變、人文環(huán)境的變化都與禽流感的暴發(fā)存在聯(lián)系。禽流感病毒的流行是病毒-動物-人類以及環(huán)境等多種因素共同作用的結果，采用傳統(tǒng)手段單純從家禽等某一動物種群或從病毒自身特性角度來制定防控措施是遠遠不夠的，必須推動多部門聯(lián)防聯(lián)控。禽流感防控工作是一項長久而艱巨的任務，關系到國計民生，任重而道遠。