日糧能量水平對湖羊瘤胃發(fā)酵特性和微生物組成的影響

韋 肖，張建童，龍?zhí)茣?，李開嶸，李艷嬌，歐陽克蕙，邱清華*

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省動物營養(yǎng)重點實驗室/動物營養(yǎng)與飼料安全創(chuàng)新團隊，南昌 330045； 2. 贛州綠林灣農(nóng)牧有限公司，贛州 341103)

羊肉是日常生活中常見的畜產(chǎn)品之一，我國的羊肉產(chǎn)量世界排名第一，占世界羊肉總產(chǎn)量的30%左右。2021年國家統(tǒng)計局的數(shù)據(jù)顯示，我國羊肉產(chǎn)量近五年呈逐步增加趨勢，至2020年已達(dá)492萬噸。湖羊適應(yīng)性強、繁殖性能好，是現(xiàn)代集約化舍飼養(yǎng)殖的理想肉羊品種。隨著羊肉消費需求的增加，傳統(tǒng)放牧的肉羊生產(chǎn)模式逐漸轉(zhuǎn)向舍內(nèi)規(guī)?；B(yǎng)殖。反芻動物養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)變常常伴隨著日糧的改變。生產(chǎn)中為追求高生產(chǎn)性能，常采用高比例精料的營養(yǎng)飼喂策略，以滿足反芻動物對能量和其他營養(yǎng)物質(zhì)的需求。然而，高精料飼喂模式下的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量高，進(jìn)入瘤胃后快速發(fā)酵產(chǎn)生大量的乳酸、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)等有機酸使得瘤胃內(nèi)pH下降，進(jìn)而引發(fā)一系列的代謝紊亂，如亞急性瘤胃酸中毒(SARA)和營養(yǎng)性腹瀉，這給生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。瘤胃作為一個厭氧發(fā)酵系統(tǒng)，有著復(fù)雜的微生物區(qū)系，這些微生物在提高反芻動物營養(yǎng)物質(zhì)消化和生產(chǎn)性能及維持動物健康方面起著重要的作用。瘤胃pH、VFA產(chǎn)量和氨態(tài)氮(NH-N)濃度是衡量瘤胃發(fā)酵狀況的主要指標(biāo)，其數(shù)值的高低或大小能夠反映飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵程度和利用狀況。影響瘤胃發(fā)酵的因素有很多，如日糧、動物品種、年齡、氣候和飼養(yǎng)環(huán)境，其中最主要的是飼糧的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)水平，改變?nèi)占Z精粗比是調(diào)節(jié)飼糧結(jié)構(gòu)、改變營養(yǎng)水平的重要手段，不同的日糧類型會使進(jìn)入瘤胃的發(fā)酵底物產(chǎn)生差異，進(jìn)一步影響瘤胃的發(fā)酵類型和產(chǎn)物。目前關(guān)于能量水平對湖羊的影響多集中在生長性能、消化代謝和肉品質(zhì)，而對瘤胃微生物菌群的影響報道較少。因此，本試驗以湖羊為研究對象，通過設(shè)置等氮日糧，研究日糧能量水平對瘤胃發(fā)酵特性和瘤胃微生物菌群的影響，為湖羊育肥期的營養(yǎng)調(diào)控策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 時間和地點

試驗于2021年5～9月在贛州綠林灣農(nóng)牧有限公司開展。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

選取健康、體重相近((17.77±1.15)kg)的湖羊公羊48只，隨機分為2組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)4只羊，每個重復(fù)安排在同一欄中飼養(yǎng)。日糧營養(yǎng)水平參照肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 816—2004)，其中對照組(代謝能ME=8.83 MJ·kg，C組)飼喂試驗羊場常規(guī)日糧，高能組(代謝能ME=10.84 MJ·kg，H組)飼喂高出對照組代謝能20%的日糧。試驗全期105 d，其中預(yù)試期15 d，正試期90 d。

1.3 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Dietary composition and nutrient level (dry matter basis) %

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗開始前用2%的NaOH溶液對羊舍進(jìn)行噴灑消毒，試驗期內(nèi)每周消毒2次。所有羊只均進(jìn)行體內(nèi)和體外驅(qū)蟲，并按照羊場相關(guān)免疫程序?qū)υ囼炑蜻M(jìn)行免疫。在試驗期間，每天飼喂2次(早上8:00和下午16:00)，自由飲水；根據(jù)羊前一天的采食量，飼喂時適當(dāng)調(diào)整各欄的日糧供應(yīng)，確保料槽內(nèi)有10%左右的剩料量。

1.5 樣品采集

在試驗期第90天，每個重復(fù)隨機選取1只羊，禁食12 h后屠宰采集瘤胃液，用于測定瘤胃發(fā)酵參數(shù)以及瘤胃菌群的組成和多樣性。將采集到的瘤胃內(nèi)容物充分混合后用四層紗布進(jìn)行過濾，立即測定瘤胃液pH；取約30 mL用于NH-N、微生物菌體蛋白(MCP)和VFA濃度的測定；另取2 mL于凍存管中用于DNA的提取和測序分析。瘤胃液樣品分裝后迅速放入液氮中，后轉(zhuǎn)移至實驗室-80 ℃冰箱保存。

1.6 測定指標(biāo)及方法

1.6.1 瘤胃液pH 采集瘤胃液后立即使用便攜式pH計測定瘤胃液pH。

1.6.2 氨態(tài)氮(NH-N) 取四層紗布過濾后的瘤胃液1 mL于4 000 r·min離心10 min，后吸取100 μL上清液置于5 mL離心管中，加入300 μL的水，再加入1.6 mL 0.2 mol·L的HCl混合并搖勻，將待測樣品稀釋20倍，取稀釋過的瘤胃液200 μL，依次加入1 mL的A液(0.08 g亞硝基鐵氰化鈉溶解于100 mL的14%水楊酸鈉溶液中)和1 mL的B液(2 mL次氯酸鈉溶液(商品名安替福明，含活性氯5.2%)混于100 mL 0.3 mol·L氫氧化鈉溶液中搖勻)，混勻后靜置10 min，立即在波長700 nm下比色。

1.6.3 微生物菌體蛋白(MCP) 將樣品在室溫下解凍后漩渦振動1 min，在2 100 r·min離心5 min后，取上清2 mL在4 ℃、13 000 r·min條件下離心30 min，棄上清，加入1 mL蒸餾水重懸，再次13 000 r·min離心30 min，棄上清，加1 mL的1% NaOH溶液，洗3次后轉(zhuǎn)移至10 mL的離心管中，然后加3 mL的NaOH于100 ℃水浴鍋中水浴10 min，取1 mL溶液于13 000 r·min離心40 min，之后參照Makkar等描述的福林-苯酚法測定MCP含量。

1.6.4 揮發(fā)性脂肪酸(VFA) 取1.5 mL瘤胃液于2 mL離心管中，在10 000 r·min離心15 min，再取離心后的上清液1.25 mL于2 mL離心管中，加入0.25 mL的25%偏磷酸溶液，充分混勻，在10 000 r·min離心15 min，取上清液于進(jìn)樣瓶中，采用自動進(jìn)樣針吸取0.4 μL注入氣相色譜儀進(jìn)行分析，得到VFA樣品色譜圖，采用峰面積外標(biāo)法計算樣品中各種揮發(fā)性脂肪酸的含量。

1.6.5 瘤胃微生物檢測

1.6.5.1 DNA提取：采用試劑盒法提取瘤胃液中的細(xì)菌DNA，提取步驟嚴(yán)格參照說明書執(zhí)行。DNA樣品先用1%瓊脂糖凝膠電泳定性檢測，然后用分光光度計檢測DNA樣品的濃度和純度。符合上機建庫要求的DNA樣本送至北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1.6.5.2 Illumina MiSeq測序：選取細(xì)菌的V3-V4區(qū)，利用Illumina Miseq PE300高通量測序平臺進(jìn)行雙尾測序。引物及反應(yīng)程序參照Qiu等報道的方法。

1.6.5.3 數(shù)據(jù)分析處理：經(jīng)過雙尾測序的下機數(shù)據(jù)采用QIIME(v 1.9.0)軟件根據(jù)Barcode序列拆分樣本，使用FLASH(v1.2.11)軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和拼接，去除評分低于20、堿基模糊、引物錯配的序列。引物序列長度控制在250～500 bp之間。借助USEARCH(v11.0.667)軟件采用UPARSE算法對優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Units)聚類，相似性設(shè)定為97%。與SILVA 128數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后，利用RDP過濾器基于70%的置信閾值獲取每個OTU對應(yīng)的物種分類信息。利用Mothur軟件(v 1.31.2)進(jìn)行多樣分析，多樣性利用R語言基于Bray-Curtis距離做主坐標(biāo)分析(PCoA)、采用Vegan包進(jìn)行相似性分析(ANOSIM)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

所有試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件采用獨立樣本T檢驗，顯著水平規(guī)定為<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 瘤胃發(fā)酵特性

由表2可知，C組和H組的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量以及乙丙比均無顯著差異(>0.05)，瘤胃pH、NH-N和MCP濃度在H組和C組間也沒有顯著差異(>0.05)。

表2 日糧不同能量水平對湖羊瘤胃發(fā)酵特性的影響Table 2 Effects of different dietary energy levels on rumen fermentation characteristics of Hu sheep

2.2 瘤胃菌群α多樣性指數(shù)

在本次瘤胃液樣本16S rRNA測序得到的優(yōu)質(zhì)序列中，99.8%的優(yōu)質(zhì)序列分布在400～440 bp，覆蓋率均在99%以上，這表明本次樣本的測序量和測序深度合理，測序結(jié)果可信。從表3可知，C組的Chao 1、Observed species、PD whole tree和Shannon指數(shù)顯著高于H組(<0.05)，但兩組在Simpson指數(shù)上無顯著差異(=0.114)。

表3 日糧不同能量水平對湖羊瘤胃菌群α多樣性指數(shù)的影響Table 3 Effects of different dietary energy levels on α-diversity metrics of rumen bacteria of Hu sheep

2.3 瘤胃細(xì)菌門水平相對豐度

表4展示了日糧不同能量水平飼喂下湖羊瘤胃細(xì)菌在門水平上的相對豐度。由表可知，本試驗條件下瘤胃細(xì)菌的主要門有擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，分別占據(jù)66.82%、28.19%和2.90%。C組疣微菌門(Verrucomicrobiota)、螺旋體門(Spirochaetota)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)和藍(lán)藻門(Cyanobacteria)的相對豐度顯著高于H組(<0.05)。

表4 日糧不同能量水平對湖羊瘤胃細(xì)菌門水平相對豐度的影響Table 4 Effects of different dietary energy levels on relative abundance of rumen bacteria at phylum level of Hu sheep

2.4 瘤胃細(xì)菌屬水平相對豐度

瘤胃微生物屬水平上相對豐度大于0.5%的物種列于表5。屬水平上的普雷沃菌屬()、克里斯滕森菌科R-7群(-7)和理研菌屬科RC9腸道群(9)相對豐度最高，分別占據(jù)46.63%、6.41%和5.76%，但組間差異均不顯著(>0.05)。H組的瘤胃球菌屬()和厭氧弧菌屬()相對豐度顯著高于C組(<0.05)。

表5 日糧不同能量水平對湖羊瘤胃細(xì)菌屬水平相對豐度的影響Table 5 Effects of different dietary energy levels on relative abundance of rumen bacteria at genus level of Hu sheep

2.5 多樣性綜合分析

相似性分析(ANOSIM)結(jié)果顯示，H組和C組間的R值為0.7852，值為0.004，說明H組和C組間差異顯著。通過主坐標(biāo)分析(PCoA)發(fā)現(xiàn)，各組間有明顯的聚集(圖1)。

圖1 基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)Fig.1 Principal coordinates analysis (PCoA) based on Bray-Curtis distance

3 討 論

3.1 日糧能量水平對湖羊瘤胃發(fā)酵特性的影響

瘤胃中復(fù)雜的微生物組成和生態(tài)位分布在飼料發(fā)酵和能量代謝中起著關(guān)鍵作用。瘤胃pH是衡量瘤胃內(nèi)環(huán)境變化的一項重要指標(biāo)，受到日糧原料、營養(yǎng)水平、環(huán)境等因素的影響。正常情況下瘤胃液pH的波動范圍為5.5～7.5，瘤胃中的pH會影響瘤胃微生物對底物的利用效率，當(dāng)瘤胃pH<6.2時微生物合成蛋白質(zhì)的效率下降。本試驗中，隨著飼糧能量水平的提高，瘤胃pH在數(shù)值上出現(xiàn)下降，但均在正常范圍內(nèi)且維持在6.2以上，這說明兩種試驗日糧均比較適宜瘤胃微生物的生長。Rabelo等研究發(fā)現(xiàn)，日糧能量水平的提高會降低奶牛瘤胃pH，這是因為飼喂高能量日糧后瘤胃中的總VFA會快速積累，進(jìn)而導(dǎo)致瘤胃pH的下降。在實踐生產(chǎn)中，飼糧精粗比對瘤胃pH影響很大，精料中可快速發(fā)酵的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量高，當(dāng)飼糧中精料比例提高時，瘤胃pH會隨之降低?；袈仿鹊难芯恳舶l(fā)現(xiàn)，隨著日糧能量水平的提高，瘤胃pH在數(shù)值上表現(xiàn)為下降。

瘤胃中NH-N濃度也是評價瘤胃內(nèi)環(huán)境和發(fā)酵狀況的常用參數(shù)，反映的是日糧中蛋白質(zhì)的降解程度與微生物蛋白合成代謝間所達(dá)到的動態(tài)平衡。NH-N在瘤胃中的適宜濃度范圍為5.0～30 mg·dL，過高或者過低時，都不利于瘤胃微生物的生長，過高造成氮浪費，甚至引起動物氨中毒，過低會阻礙瘤胃微生物蛋白的合成，導(dǎo)致動物生長速度緩慢，生產(chǎn)性能降低。張海波和王之盛報道，隨著精料能量水平的提高，高能組肉牛瘤胃NH-N濃度低于低能組，本試驗發(fā)現(xiàn)，提高能量水平只在數(shù)值上降低NH-N濃度，這可能是高能日糧可提供充足的能量、促進(jìn)微生物對NH-N的利用，進(jìn)而使得瘤胃液中的NH-N濃度下降，但這種促進(jìn)作用有限，不足以達(dá)到顯著水平。在本試驗中，日糧中不同的能量水平對單種VFA、總VFA及乙丙比均沒有顯著影響，只在數(shù)值上有所差異。VFA是反芻動物發(fā)酵飼料后的主要產(chǎn)物和能量利用形式，可為反芻動物提供所需能量的70%左右，日糧中的纖維性碳水化合物和非纖維性碳水化合物發(fā)酵的主要產(chǎn)物分別是乙酸和丙酸，兩者產(chǎn)量之和占到總VFA的75%以上，因此乙酸和丙酸在反芻動物生產(chǎn)中有著重要的意義。隨著日糧能量水平的提高，乙酸濃度在數(shù)值上降低，主要是因為高能日糧中的纖維性碳水化合物含量較低，Wang等在飼喂高能日糧的肉牛瘤胃中也發(fā)現(xiàn)乙酸濃度比低能日糧低。在本研究中，與C組相比，H組的乙酸、丙酸和總VFA濃度在數(shù)值上較低，這可能是高能日糧中谷物含量較高，消化吸收速度更快，從而導(dǎo)致在屠宰前的禁食期間下降速度更快，使得最終濃度更低。

3.2 日糧能量水平對湖羊瘤胃菌群α多樣性的影響

多樣性指標(biāo)可用于反映特定樣本或單個群落中物種的豐富度和均勻度。本研究借助Illumina MiSeq PE300測序平臺研究了日糧能量水平對湖羊瘤胃菌群多樣性的影響，試驗得到的稀釋曲線已趨于平緩到達(dá)平臺期，表明樣本的測序量和測序深度合理，測序結(jié)果可以進(jìn)行后續(xù)的研究。Chao 1和Observed species反映的是微生物群落的豐富度。在本試驗中，隨著日糧能量水平的增加，兩者數(shù)值均降低，說明高能日糧會降低瘤胃微生物的豐富度，這與Qiu等的研究結(jié)果一致。Shannon指數(shù)反映的是微生物群落的均勻度，H組的該指數(shù)顯著低于C組，這說明飼喂高能日糧會降低瘤胃微生物群落的均勻度，這與上述研究結(jié)果也一致。本試驗出現(xiàn)瘤胃發(fā)酵特性差異不顯著，但微生物多樣性存在差別的現(xiàn)象，這與Palmonari等的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落組成上的相似性不一定意味著瘤胃發(fā)酵特性也相似的現(xiàn)象是一致的。

3.3 日糧能量水平對湖羊瘤胃微生物組成的影響

目前多數(shù)研究均發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)在成年反芻動物瘤胃菌群中的門水平上占比最高。本試驗共發(fā)現(xiàn)10個門的相對豐度在0.1%以上，其中以擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門(Proteobacteria)這3個門的相對豐度最高，分別占據(jù)66.8%、28.2%和2.9%。擬桿菌門作為第一優(yōu)勢菌門在C組中的相對豐度為70.26%，數(shù)值上高于H組中的63.37%。H組中厚壁菌門的豐度在數(shù)值上較高是因為H組的瘤胃pH較低，而之前的研究發(fā)現(xiàn)，較低的瘤胃pH增加了厚壁菌門在細(xì)菌組成中的比例。變形菌門的相對豐度在門水平上僅次于擬桿菌門和厚壁菌門，但含量遠(yuǎn)低于這兩種門，這與Fernando等的研究一致。Pitta等發(fā)現(xiàn)，變形菌門在瘤胃淀粉分解中起著重要作用，本試驗中的H組淀粉含量較C組高，因此會出現(xiàn)H組中變形菌門的相對豐度在數(shù)值上高于C組。疣微菌門(Verrucomicrobiota)和螺旋體門(Spirochaetota)對于纖維素的降解有著重要的作用，由于C組中的粗料比例高于H組，日糧中的高纖維含量會使得纖維分解菌的含量上升，這解釋了C組中這兩個門的相對豐度較高。

在屬水平上發(fā)現(xiàn)10個相對豐度在1%以上的屬，其中以普雷沃菌屬()和克里斯滕森菌科R-7群(-7)的相對豐度最高，分別占據(jù)46.6%和6.4%，然而日糧能量水平并未對這兩種屬的相對豐度造成影響。之前的研究發(fā)現(xiàn)，普雷沃菌屬在瘤胃微生物中占比最高且可達(dá)瘤胃細(xì)菌數(shù)量的30%左右，本試驗發(fā)現(xiàn)，該屬在H組中的相對含量高達(dá)48.6%，這可能是本試驗中的高能日糧精粗比較高，因為該屬主要參與非纖維性碳水化合物和蛋白質(zhì)的代謝。瘤胃球菌屬()是瘤胃球菌科的一個屬，Liu等報道稱，瘤胃球菌屬在高精料日糧下的相對豐度更高，并推測該屬可能參與瘤胃中淀粉的分解，本試驗的高能組飼糧淀粉含量較高，因此會出現(xiàn)H組瘤胃球菌屬相對豐度比C組更高。厭氧弧菌屬()是反芻動物瘤胃內(nèi)參與脂質(zhì)水解的主要菌屬，可將甘油三酯水解為甘油和脂肪酸。本試驗H組的粗脂肪含量較C組高，因此會出現(xiàn)H組的厭氧弧菌屬的相對豐度高于C組。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，日糧能量水平的提高對湖羊瘤胃發(fā)酵特性沒有顯著影響，但會降低瘤胃微生物的豐富度和均勻度，并影響部分菌屬的相對豐度。