沙蔥及其提取物對舍飼肉羊腎周脂肪膻味物質(zhì)代謝組特征的影響

劉旺景，唐德富*，敖長金

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018)

我國是羊肉生產(chǎn)大國，占全世界生產(chǎn)總量的24%，其次是澳大利亞(8%)和新西蘭(5%)。與其他畜產(chǎn)品(肉和奶)相比，綿羊、山羊肉及其相關制品因具有獨特營養(yǎng)成分、感官特性而深受消費者市場的歡迎，但同時也具有特殊的風味即膻味，致使部分消費者難以接受而拒絕消費。眾多研究結果指向，揮發(fā)性的4-烷基支鏈脂肪酸：4-甲基辛(MOA)、4-甲基壬酸(MNA)、4-乙基辛酸(EOA)被認為是羊肉膻味的主要貢獻者。羊肉膻味受品種、性別、年齡以及日糧等諸多因素的影響，但日糧因素往往比遺傳因素更能直接對羊肉膻味產(chǎn)生影響。與放牧條件下采食黑麥草和三葉草的公羊羔羊相比，舍飼條件下采食濃縮飼料(苜蓿顆?；蛴衩?的公羊羔羊皮下脂肪中的MOA和MNA濃度更高，這也是舍飼肉羊風味下降，膻味程度加劇的主要原因。舍飼條件下肉羊飼糧中谷物類等濃縮飼料的比例顯著增加，肉羊瘤胃微生物能夠發(fā)酵谷物中的淀粉產(chǎn)生大量的丙酸，正常情況下丙酸可被用于糖異生途徑，當丙酸的產(chǎn)生量超過肝的代謝閾值時，過量的丙酸作為前體物合成丙二酰輔酶A和甲基-丙二酰輔酶A，脂肪酸合成酶通常情況下利用乙酰輔酶A為起始底物合成支鏈脂肪酸，同時也可利用甲基-丙二酰輔酶A合成支鏈脂肪酸。對于羊肉膻味的研究目前的瓶頸主要在于與膻味相關物質(zhì)在羊肉所占的比例僅以mg·kg來計量，用常規(guī)的檢測和分析方法很難對其進行準確分析，并且檢測成本較高。目前針對舍飼肉羊腎周脂肪膻味代謝組學的特征研究較少，因此本試驗重點解析不同膻味水平舍飼肉羊腎周脂肪代謝組學特征，以期為膻味物質(zhì)代謝產(chǎn)物標記物的篩選及進一步研究沙蔥醇提物調(diào)控膻味的途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沙蔥粉的制備流程：新鮮沙蔥采摘自甘肅省民勤縣，運回實驗室除去雜草，洗凈烘干(65 ℃)，粉碎備用。沙蔥水提物和沙蔥醇提物參照劉旺景等方法為實驗室自制。

1.2 試驗設計及動物飼養(yǎng)管理

選取3月齡體重相近((23.67±3.43)kg)，健康、體況良好的小尾寒羊公羔60只，隨機分為4組，每組15只。對照組飼喂基礎日糧(CK)，試驗組以每只羊計，每天分別在基礎日糧中添加沙蔥粉(AMR)10 g，沙蔥水提物(AWE)3.4 g和沙蔥醇提物(AFE)2.8 g。本試驗中沙蔥粉添加量參考盧媛試驗所得的舍飼肉羊最適沙蔥粉添加劑量，沙蔥水提物和沙蔥醇提物的添加劑量根據(jù)沙蔥水提物和沙蔥醇提物的提取率換算所得?；A日糧參照NRC(2007)營養(yǎng)需要量進行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗持續(xù)75 d，其中預試期15 d，正試期60 d，基礎日糧每日于07:00和19:00分兩次等量飼喂，根據(jù)剩料量調(diào)整飼喂量，控制每個圈舍剩料量為飼喂量的10%，飼喂期間保證羊只自由采食和飲水，期間4組肉羊的飼養(yǎng)條件和環(huán)境均一致。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (dry matter basis) %

1.3 樣品采集與測定

正試期結束后從每組挑選6只體重相近的小尾寒羊進行屠宰(=24)，屠宰前24 h內(nèi)禁止采食，2 h內(nèi)禁止飲水。屠宰1 h后取背部皮下脂肪(6-7腰椎肌肉上方的脂肪組織)、尾部脂肪(中央位置)、腎周脂肪和大網(wǎng)膜脂肪(中央位置)20～30 g分裝于凍存管中放在-80 ℃條件下保存，用于3種支鏈脂肪酸(MOA、MNA和EOA)的含量及代謝組學特征的檢測。

1.3.1 3種支鏈脂肪酸的檢測 3種支鏈脂肪酸的定性主要由相應標準物的保留時間進行確定。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry analysis)檢測各脂肪組織中3種支鏈脂肪酸的含量，具體參照Kaffarnik等的方法。根據(jù)各組支鏈脂肪酸的含量選擇極高膻味水平組(HLOF)樣本和極低膻味水平組(LLOF)樣本，進行后續(xù)的代謝組學特征分析。

1.3.2 代謝組學特征分析

1.3.2.1 樣品前處理：根據(jù)支鏈脂肪酸的檢測結果，選擇HLOF樣本和LLOF樣本進行代謝組學特征分析，具體方法：將各組所屠宰的6只羊的組織樣本混合，每組制備6個重復樣本。分別從每個重復樣本中稱取60 mg，加入內(nèi)標(L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg·mL；Lyso PC17:0，0.01 mg·mL，均為甲醇配置)各20 μL和600 μL的甲醇：水(V∶V=4∶1)；加入兩個小鋼珠，在-20 ℃放置2 min預冷，加入研磨機(60 Hz,2 min)；超聲提取10 min；-20 ℃靜置30 min；離心10 min(13 000 r·min，4 ℃)，用注射器吸取200 μL上清液，使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移到LC進樣小瓶，-80 ℃下保存，直到進行LC-MS分析。質(zhì)控樣本(QC)由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個QC體積與樣本相同。

1.3.2.2 LC-MS分析條件：試驗分析儀器為ACQUITY UPLC超高效液相串聯(lián)AB Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀組成的液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。色譜條件，色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；柱溫：45 ℃；流動相：A-水(含0.1%甲酸)，B-乙腈/甲醇(2/3)(/)(含0.1%甲酸)；流速：0.4 mL·min；進樣體積：5 μL。質(zhì)譜條件：離子源，ESI；樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負離子掃描模式。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對照組和試驗組小尾寒羊各部位脂肪組織中支鏈脂肪酸的含量采用SAS 9.2軟件中的ANOVA程序進行單因素方差分析，>0.1為差異不顯著，0.05≤<0.1有差異趨勢，<0.05為差異顯著，差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較。UNIFI 1.8.1. 軟件用于原始數(shù)據(jù)的采集經(jīng)Progenesis QI v2.3 軟件處理后，利用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)來區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。OPLS-DA 分析中，變量權重值(variable important in projection，VIP)可用來衡量各代謝物的表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，一般以VIP>1的代謝物被認為是差異代謝物。進一步利用T檢驗驗證組間差異代謝物是否具有顯著性。篩選的標準為OPLS-DA模型第一主成分的VIP 值>41，T 檢驗的值<0.05根據(jù)VIP值對差異代謝物表達量進行可視化分析。利用差異代謝物的 KEGG ID 進行通路富集分析，獲得代謝通路富集結果。

2 結 果

2.1 日糧添加沙蔥及其提取物對舍飼肉羊各部位脂肪組織中3種支鏈脂肪酸的影響

由表2可知，AMR、AWE和AFE組腎周脂肪中MOA(<0.001)、MNA(=0.044)和EOA(<0.001)的含量顯著低于CK組，其中，AFE組腎周脂肪中MOA的含量最低為2.31 μg·g；AMR、AWE和AFE組尾部脂肪中MOA、MNA和EOA的含量與CK組相比無顯著性差異(>0.05)；AMR、AWE和AFE組背部皮下脂肪中MOA(<0.001)和EOA(<0.001)的含量顯著低于CK組，4組間MNA的含量無顯著性差異(>0.05)；AMR、AWE和AFE組大網(wǎng)膜脂肪中MOA(<0.001)和EOA(=0.002)的含量顯著低于CK組，另外，AMR、AWE和AFE組大網(wǎng)膜脂肪中MNA(=0.062)的含量與CK組相比有顯著降低的趨勢。綜上所述，沙蔥及其提取物對腎周脂肪中3種支鏈脂肪酸含量的影響最為顯著，并且沙蔥醇提物對改善腎周脂肪膻味效果最佳，因此選擇CK組腎周脂肪為極高膻味水平組(HLOF)樣本，選擇AFE組腎周脂肪為極低膻味水平組(LLOF)樣本，進行后續(xù)的代謝組學特征分析。

表2 日糧中添加沙蔥及其提取物對舍飼肉羊不同部位脂肪組織中3種支鏈脂肪酸含量的影響Table 2 Effect of dietary supplementation with Allium mongolicum Regel and its extracts on the concentrations of three branched-chain fatty acids in the different adipose tissues of captive meat sheep μg·g-1

2.2 差異代謝物分析

2.2.1 PLS-DA分析和OPLS-DA分析 偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)是一種有監(jiān)督的判別統(tǒng)計方法，該方法運用偏最小二乘回歸建立代謝物表達量與樣本分組之間的關系模型，來實現(xiàn)對樣品類別的預測。參數(shù)R2X (cum)能對模型有效性進行評判，除了參數(shù)R2X (cum)能對模型有效性進行評判外，還包括解釋率R2Y (cum)和預測率Q2 (cum)，PLS-DA模型能更好地解釋和預測兩組樣本之間的差異，代表模型預測能力越好，由圖1(左)可知，該模型解釋率和預測率良好。正交偏最小二乘方-判別分析OPLS-DA是有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法，由圖1(右)可知兩組樣本在OPLS-DA得分圖上具有顯著的差異，該模型解釋率和預測率良好。

圖1 小尾寒羊腎周脂肪(CK組 vs. AFE組)PLS-DA得分圖和OPLS-DA得分圖Fig.1 PLS-DA and OPLS-DA score plot of perirenal adipose tissue samples (CK group vs. AFE group) in Small-tailed Han sheep

2.2.2 OPLS-DA模型的響應排序檢驗 為防止模型過擬合，采用7次循環(huán)交互驗證(7-fold cross validation)和200次響應排序檢驗(response permutation testing，RPT)的方法來考察模型的質(zhì)量。使用RPT檢驗時，一般要求這種情況的Q2小于0。由圖2可知，R2=0.82，Q2=-0.077，模型不存在過擬合現(xiàn)象。

圖2 Permutation圖Fig.2 Graph of Permutation

2.2.3 單變量統(tǒng)計分析 利用火山圖對CK組(HLOF)和AFE組(LLOF)代謝物表達量的變異進行可視化，有利于篩選差異代謝產(chǎn)物，如圖3所示，其中紅色圓點代表在試驗組中顯著上調(diào)的差異代謝產(chǎn)物(<0.05)，藍色圓點代表顯著下調(diào)的差異代謝產(chǎn)物(<0.05)，灰色點代表不顯著的差異代謝產(chǎn)物(>0.05)。采用多維分析和單維分析相結合的辦法，來篩選組間差異代謝產(chǎn)物。篩選的標準為OPLS-DA模型第一主成分的VIP值>1，T檢驗的值<0.05。共篩選出差異代謝物共94個，其中56個代謝物下調(diào)，38個代謝物上調(diào)。差異代謝物的分類見圖4，由圖可知，脂類和類脂類分子占比55%、有機雜環(huán)類占比13%、有機酸及其衍生物占比10%、苯甲酸鹽類化合物占比6%、有機氮化合物占比4%、有機硫化合物占比3%、有機氧化合物占比1%、其他化合物占比8%。

圖3 小尾寒羊腎周脂肪(HLOF組 vs. LLOF組)差異代謝物火山圖Fig.3 Volcano map of different metabolites of perirenal adipose tissue samples (HLOF group vs. LLOF group) in Small-tailed Han sheep

圖4 小尾寒羊腎周脂肪(HLOF組 vs. LLOF組)差異代謝物分類圖Fig.4 Classification of the significantly varying metabolites of perirenal adipose tissue samples (HLOF group vs. LLOF group) in Small-tailed Han sheep

2.2.4 差異代謝物的篩選 為了更直觀地展示樣本之間的關系及代謝物在不同樣本之間的表達差異，本研究對所有顯著差異代謝物表達量進行層次聚類(Hierarchical Clustering)，根據(jù)VIP值對top50差異代謝物表達量進行可視化分析，結果如圖5。橫坐標表示樣本名稱，縱坐標表示差異代謝物，每個試驗組6個生物學重復。左側(cè)的樹狀結構表示差異代謝物之間的相似度聚類關系。顏色從綠到紅表示代謝物的表達豐度從低到高，即顏色越紅表示差異代謝物的表達豐度越高。由圖可知，正、負離子模式下Top-50代謝物被分為兩類，一類代謝物的表達量上調(diào)，而另一類代謝物的表達量下調(diào)。極低膻味組(LLOF)TOP-50差異代謝物中表達量上調(diào)的代謝物為19個，按物質(zhì)分類判定其中，甘油磷脂類化合物4個，分別為：[PI(16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)), PI(18:1(9Z)/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)), PS(18:0/18:1(9Z)), PI(18:1(9Z)/20:3(8Z,11Z,14Z)) ]、脂肪?；?個，分別為：[二十四烷酸(Tetracosanoic acid), 二十二烷酸(Behenic acid), (S)-2-乙酰乳酸((S)-2-Acetolactate), 2-amino-2,3,7-trideoxy-D-lyxo-hept-6-ulosonic acid, 3Z,6Z,9Z,12Z,15Z-Tricosapentaene]；甘油糖脂3個，分別為[DG(18:0/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0), DG(18:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0), PS(18:0/18:1(9Z))]；鞘磷脂2個分別為[C16 二氫(神經(jīng))鞘氨醇(C16 Sphinganine), (3’-sulfo)Galbeta-Cer(d18:1/16:0(2OH))]；有機氮化合物1個為N,N-Dimethylaniline；丙烯醇脂類1個為葉綠醇(Phytol)；苯甲酸鹽1個為非爾氨酯(Felbamate)；未分類化合物2個，分別為[Xestoaminol C, 苯甲烴銨(Benzalkonium)]。表達量下調(diào)的代謝物為31個，其中，甘油磷脂類化合物7個，分別[LysoPE(22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0:0), PI(20:1(11Z)/0:0), (4E,8E,10E-d18:3)sphingosine, 1-Oleoylglycerophosphoserine, PC(16:0/16:0), PS(O-16:0/20:2(11Z,14Z)), PC(20:2(11Z,14Z)/18:0)]；脂肪?；?個，分別為[蓖麻油酸(Ricinoleic acid), Linoleamide, Cer(d18:0/14:0), Ethyl 9-hexadecenoate]；有機酸及其衍生物4個，分別為[N-Arachidonoyl tyrosine, D-4’-Phosphopantothenate, L-2-Amino-3-(1-pyrazolyl) propanoic acid, 1-(Malonylamino)cyclopropanecarboxylic acid]；有機雜環(huán)類化合物3個，分別為[咪唑丙烯酸(Urocanic acid), Isoniazid, N-Methyl-1H-indole-3-propanamide]；苯甲酸鹽3個，分別為[2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol, 乙基苯酚(4-Ethylphenol), m-Chlorohippuric acid]；丙烯醇脂類1個為[雷公藤紅素(Celastrol)]；鞘磷脂1個[4E,14Z-Sphingadiene]；有機氮化合物1個為[組氨醇(L-Histidinol)]；有機氧化合物1個[Adlupone]；有機硫化合物1個為[二丁基二硫化物(Dibutyl disulfide)]、其它類化合物5個，分別為[4-羥基-6-甲基吡喃-2-酮(4-Hydroxy-6-methylpyran-2-one), 7-氯犬尿酸(7-Chlorokynurenic acid), PC(16:1(9Z)/20:3(5Z,8Z,11Z)), PC(16:1(9Z)/20:3(8Z,11Z,14Z)), 4-氨基-5-羥甲基-2-甲基嘧啶(4-Amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine)]。

圖5 HLOF組與LLOF組TOP-50差異代謝物熱圖Fig.5 Top-50 differential metabolites thermogram between HLOF group and LLOF group

2.2.5 代謝通路富集分析 基于KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進行代謝通路富集分析。代謝通路中值為該代謝通路富集的顯著性。紅線示意值為0.01，藍線示意值為0.05，條柱的頂端高于藍線時，其所代表的信號通路具有顯著性。由圖6可知，差異代謝物主要涉及的代謝通路包括：逆行內(nèi)源性大麻素信號轉(zhuǎn)導(Retrograde endocannabinoid signaling)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、癌癥中的膽堿代謝(Choline metabolism in cancer)、阿米巴類感染(Amoebiasis)、組氨酸代謝(Histidine metabolism)、甘油磷脂代謝(Glycerophospholipid metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、亞油酸代謝(Linoleic acid metabolism)和泛酸和輔酶A生物合成(Pantothenate and CoA biosynthesis)。

圖6 TOP-10代謝通路富集圖Fig.6 Top-10 metabolic pathway enrichment map

代謝通路中值為該代謝通路富集的顯著性，選擇顯著性富集pathway進行氣泡圖繪制。由圖7分析可知，在TOP-10代謝通路中，富集到Retrograde endocannabinoid signaling代謝通路的代謝物有3個，分別是磷脂酰膽堿(下調(diào))，二酰甘油(上調(diào))和磷脂酰乙醇胺(下調(diào))；富集到Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection代謝通路的代謝物有2個，分別是二酰甘油(上調(diào))和磷脂酰乙醇胺(下調(diào))；富集到Choline metabolism in cancer通路的代謝物有2個，分別是磷脂酰膽堿(下調(diào))和二酰甘油(上調(diào))；富集到Amoebiasis代謝通路的代謝物有2個，分別是二酰甘油(上調(diào))和磷脂酰絲氨酸(上調(diào))；富集到Histidine metabolism通路的代謝物有3個，分別是尿酸(下調(diào))、L-組氨酸(下調(diào))和1-甲基組胺(下調(diào))；富集到Glycerophospholipid metabolism通路的代謝物有3個，分別是磷脂酰膽堿(下調(diào))，磷脂酰乙醇胺(下調(diào))和磷脂酰絲氨酸(上調(diào))；富集到Arginine and proline metabolism代謝通路的代謝物有3個，分別是N-乙酰-L-谷氨酸5-半醛(上調(diào))，1-吡咯啉-2-羧酸鹽(上調(diào))和4-(L-γ-谷氨酸氨基)丁酸酯(上調(diào))；富集到EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)代謝通路的代謝物有1個，是二酰甘油(上調(diào))；富集到亞油酸代謝(Linoleic acid metabolism)通路的代謝物有2個，分別是磷脂酰膽堿(下調(diào))和9-順式，11-反癸二烯酸酯(下調(diào))；富集到Pantothenate and CoA biosynthesis代謝通路的代謝物有2個，分別是D-4′-磷酸泛酸鹽(下調(diào))和(S)-2-羥基-2-甲基-3-氧代丁酸酯(上調(diào))。

圖7 TOP-20差異代謝物氣泡圖Fig.7 Top-20 bubble chart of differential metabolites

2.2.6 主要差異代謝產(chǎn)物與3種支鏈脂肪酸含量的相關性分析 由表3可知，MOA與尿酸([ρ]=0.68,=0.001)、L-組氨酸([ρ]=0.70,=0.012)、1-甲基組胺([ρ]=0.57,=0.033)、磷脂酰膽堿([ρ]=0.62,=0.035)、磷脂酰乙醇胺([ρ]=0.54,=0.044)、9-順式,11-反癸二烯酸酯([ρ]=0.50,=0.001)呈顯著正相關，與二酰甘油([ρ]=-0.49,=0.016)、磷脂酰絲氨酸([ρ]=-0.64,=0.029)呈顯著負相關，與其他代謝產(chǎn)物均無顯著相關性。EOA與尿酸([ρ]=0.61,=0.016)、L-組氨酸([ρ]=0.72,=0.023)、1-甲基組胺([ρ]=0.68,=0.026)、磷脂酰膽堿([ρ]=0.58,=0.018)、磷脂酰乙醇胺([ρ]=0.61,=0.001)、9-順式,11-反癸二烯酸酯([ρ]=0.47,=0.022)呈顯著正相關，與二酰甘油([ρ]=-0.45,=0.029)、磷脂酰絲氨酸([ρ]=-0.58,=0.031)呈顯著負相關，與其他代謝產(chǎn)物均無顯著相關性。MOA與尿酸([ρ]=0.59,=0.049)、L-組氨酸([ρ]=0.50,=0.056)、1-甲基組胺([ρ]=0.56,=0.058)、磷脂酰膽堿([ρ]=0.67,=0.014)、磷脂酰乙醇胺([ρ]=0.49,=0.016)、9-順式,11-反癸二烯酸酯([ρ]=0.45,=0.029)、4-(L-γ-谷氨酸氨基)丁酸酯([ρ]=0.36,=0.026)呈顯著正相關，與二酰甘油([ρ]=-0.51,=0.004)、磷脂酰絲氨酸([ρ]=-0.57,=0.033)呈顯著負相關，與其他代謝產(chǎn)物均無顯著相關性。

表3 腎周脂肪主要差異代謝物與3種支鏈脂肪酸含量的相關性分析Table 3 Correlation analysis between main differential metabolites and the contents of three branched-chain fatty acids in perirenal adipose tissue

3 討 論

3.1 沙蔥及其提取物對3種支鏈脂肪酸含量的影響

羊肉中致膻物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和探究一直是肉羊和食品領域研究的熱點問題。Wong等首次報道引起羊肉特殊風味的物質(zhì)主要是3種支鏈脂肪酸，即MOA、EOA和MNA，同時也指出，碳鏈長度在7～9之間不同酸(如：辛酸及其異構體、2-甲基辛酸、6-甲基辛酸、壬酸、4,6-二甲基辛酸、壬酸及其異構體和8-甲基壬酸)的組合也會產(chǎn)生類似于羊肉膻味的不良氣味。3種支鏈脂肪酸的合成途徑中，丙酸是重要的前體物之一，Berthelot等研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加丙酸鹽能夠顯著提高綿羊體脂中支鏈脂肪酸的沉積量，試驗證實了丙酸是合成奇數(shù)碳脂肪酸和甲基支鏈脂肪酸的重要前體物。Young等研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中谷物添加比例增加時，羔羊肌內(nèi)脂肪和體脂中也將沉積更多的支鏈脂肪酸。眾所周知，瘤胃微生物發(fā)酵谷物中的碳水化合物產(chǎn)生大量的丙酸，產(chǎn)生的丙酸被瘤胃上皮細胞吸收進入門靜脈，而后被運送到肝，其中一部分丙酸可被氧化或用于糖異生為機體提供能量，但隨著肝中丙酸供應量的不斷增加，肝對丙酸的提取量由85%降低至75%，導致丙酸在外周組織中的可利用比例增加3倍，多余的丙酸被轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A和琥珀酸的中間體甲基丙二酰輔酶A。在脂肪酸的合成中，脂肪酸合成酶通常使用丙二酰輔酶A作為從頭合成直鏈脂肪酸，可利用甲基-丙二酰輔酶A或乙基-丙二酰輔酶A取代丙二酰輔酶A作為脂肪酸從頭合成的前體物，生成甲基-或者乙基支鏈脂肪酸。由此看來，丙酸的生成量是影響支鏈脂肪酸合成的重要物質(zhì)基礎，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥及其提取物能夠有效降低綿羊肌內(nèi)脂肪中支鏈脂肪酸的含量，改善羊肉膻味，同時進一步研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥及其提取物能夠改變綿羊瘤胃發(fā)酵類型，豐富瘤胃液菌群的多樣性，對丙酸生成量的影響可能是降低羊肉膻味的原因之一。另外在支鏈脂肪酸的合成中，提高丙二酰輔酶A脫羧酶的活性能夠降低組織對丙二酰輔酶A的攝取和利用，從而使甲基-丙二酰輔酶A的可用性成比例增加，增加支鏈脂肪酸的合成量，由此推測，沙蔥及其提取物中的活性成分可能降低丙二酰輔酶A脫羧酶的活性，避免脂肪酸合成底物中丙二酸輔酶A被該酶提前降解，因此，降低甲基-丙二酰輔酶A或乙基-丙二酰輔酶A參與合成支鏈脂肪酸的幾率。

組織中支鏈脂肪酸除了來自于脂肪酸的從頭合成，還可來源于小腸吸收的食物、微生物代謝和支鏈氨基酸的降解, 支鏈脂肪酸合成途徑中的丙二酰輔酶A是異亮氨酸和纈氨酸的降解產(chǎn)物，支鏈氨基酸的降解是通過支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶的脫氨基作用開始的，降解產(chǎn)物支鏈酮酸隨后在線粒體中代謝，在支鏈酮酸脫氫酶復合物作用下生成?；o酶A，有研究表明，在支鏈脂肪酸合成的同時，支鏈氨基酸的分解代謝同步上調(diào)，其分解代謝產(chǎn)物為三羧酸循環(huán)和乙酰輔酶A的的產(chǎn)生提供碳源，因此，支鏈氨基酸的代謝影響著支鏈脂肪酸的合成，這為探究沙蔥及其提取物降低綿羊體脂支鏈脂肪酸合成機理提供新的思路。Wallace等研究發(fā)現(xiàn)，肝和大腦中甲基-支鏈脂肪酸的含量低于脂肪組織，這表明支鏈脂肪酸的合成具有組織特異性。Alves等報道，極端惡劣條件下達馬拉肥尾羊會動員尾部儲存的脂肪來維持機體能量需求，長此以往尾部形成獨特的局部脂肪代謝機制，同時檢測發(fā)現(xiàn)，尾部脂肪中含有高水平的支鏈脂肪酸，本研究發(fā)現(xiàn)沙蔥及其提取物對尾部脂肪中MOA、MNA和EOA的含量沒有顯著性影響，提示小尾寒羊這種耐粗飼、適應能力強的物種可能同樣存在局部脂肪代謝機制，更深層次的機制有待進一步探究。

3.2 不同膻味水平下舍飼肉羊腎周脂肪的代謝組學分析

氨基酸是機體生命活動中的重要組成成分，是蛋白質(zhì)合成和分解的單位和產(chǎn)物，氨基酸通過脫氨和轉(zhuǎn)氨作用分解為α-酮酸進而合成糖類、脂類和一些非必需氨基酸，部分氨基酸為4-烷基支鏈脂肪酸的合成提供支鏈碳架結構。本研究發(fā)現(xiàn)，LLOF組與HLOF組相比差異代謝產(chǎn)物尿酸、L-組氨酸和1-甲基組胺三者均表達下調(diào)，尿酸和1-甲基組胺為L-組氨酸代謝的下游產(chǎn)物參與組氨酸代謝，提示沙蔥醇提物可能通過調(diào)控組氨酸代謝途徑中相關代謝產(chǎn)物的表達，進而影響4-烷基支鏈脂肪酸的合成。磷脂酰膽堿(卵磷脂)是一種內(nèi)源性的小半抗原分子，廣泛存在于各組織中，它是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑中膽堿的前體物，是甘油磷脂代謝途徑中膽堿和胞苷二磷酸膽堿的中間產(chǎn)物，也是亞油酸代謝途徑中亞油酸鹽合成的前體物，而9-順式，11-反癸二烯酸酯是亞油酸的下游產(chǎn)物。在亞油酸代謝途徑中磷脂酰膽堿和9-順式，11-反癸二烯酸酯表達豐度下調(diào)，提示沙蔥提取物可能參與調(diào)控腎周脂肪中的亞油酸代謝途徑，降低亞油酸含量，導致膻味物質(zhì)硬脂酸的合成量下降。磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)同樣參與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑，在甘油磷脂代謝途徑中，是通過磷酯酰絲氨酸的脫羧作用形成的，在動物中，它是通過CDP乙醇胺和1, 2-甘油二酯的反應生成的。磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸都是細胞膜的重要組成成分，如人類紅細胞膜上就有磷脂酰膽堿(占19%)、鞘磷脂(占8%)、磷脂酰乙醇胺(占16%)和磷脂酰絲氨酸(占10%)，同樣在低等生物中，甲基支鏈脂肪酸在控制細胞膜的流動性等方面發(fā)揮著十分重要的作用，并有助于其神經(jīng)發(fā)育。相關性研究發(fā)現(xiàn)，3種支鏈脂肪酸含量與組氨酸代謝通路中的尿酸和1-甲基組、L-組氨酸；與甘油磷脂代謝通路中的磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸；與EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥代謝通路中的二酰甘油；與亞油酸代謝通路中的9-順式，11-反癸二烯酸酯顯著相關。Xue等研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥提取物的攝入并沒有直接調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，而是能夠通過影響綿羊脂肪組織的甲基化水平和lncRNA的表達間接調(diào)控動物機體能量代謝、信號通路和細胞增殖等相關過程，而這些都是脂質(zhì)代謝的上游調(diào)節(jié)通路，這可能是3種支鏈脂肪酸與上述通路中的代謝產(chǎn)物顯著相關，但相關性不強的主要原因。李樹穎等研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖對小鼠細胞氨基酸代謝途徑具有調(diào)節(jié)作用。沙蔥及其提取物對舍飼肉羊腎周脂肪組織中氨基酸的調(diào)節(jié)可能與黃芪多糖具有構效相似性。綜上所述，沙蔥醇提物可能通過調(diào)控舍飼肉羊機體脂肪酸及氨基酸代謝通路，調(diào)控相關代謝產(chǎn)物的合成，進而影響4-烷基支鏈脂肪酸的合成，從而改善羊肉膻味。

4 結 論

本試驗條件下，沙蔥及其提取物能夠改善除尾部脂肪外其它部位脂肪組織中(腎周脂肪、背部皮下脂肪和大網(wǎng)膜脂肪)3種支鏈脂肪酸，其中沙蔥醇提物對降低腎周脂肪中3種支鏈脂肪酸的沉積效果最佳。代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥醇提物可能通過調(diào)控舍飼肉羊機體脂肪酸及氨基酸代謝通路，調(diào)控相關代謝產(chǎn)物的合成，進而影響4-烷基支鏈脂肪酸的合成，從而改善羊肉膻味。