綿羊FecB突變檢測方法的建立及高繁灘羊核心群的構(gòu)建

周世衛(wèi)，吳庭杰，王 倩，蔡 蓓，韓賽錚，吳彥虎，王小龍*，陳玉林*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌 712100； 2.寧夏畜牧工作站，銀川 750000)

我國肉羊飼養(yǎng)數(shù)量較多，但每年仍需從新西蘭和澳大利亞等國家大量進(jìn)口羊肉，表明我國的羊肉產(chǎn)量并不能滿足居民的需求。在羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，通過提高母羊產(chǎn)羔數(shù)來提高羊肉年產(chǎn)量是解決我國羊肉供需不平衡的有效策略之一。近年來，研究人員針對綿羊的繁殖性狀進(jìn)行了大量研究。是綿羊中鑒定出的第一個高繁殖力主效基因。1950年，澳大利亞的相關(guān)人員從選育出的比普通綿羊群體產(chǎn)羔率高出30%的群體中首次發(fā)現(xiàn)基因并進(jìn)行研究。1982年，正式被國際綿羊和山羊遺傳學(xué)命名委員會命名FecB。Souza等研究發(fā)現(xiàn)，基因來源于骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B (bone morphogenetic protein receptor type 1B，1B)，該基因外顯子第746位A突變?yōu)镚即為， g.A746G突變的存在降低了顆粒細(xì)胞對BMP4刺激AMH產(chǎn)生的反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)母體排卵。研究表明，綿羊-1B基因的等位基因以劑量依賴性提高排卵率，進(jìn)而提高產(chǎn)羔數(shù)。

在基因的檢測技術(shù)探索早期，學(xué)術(shù)界常采用PCR-Sanger測序法進(jìn)行綿羊的基因分型，但這種測序方法在批量使用時成本較高，且結(jié)果的判斷對測序公司的業(yè)務(wù)水平依賴過大。劉秋月等建立了檢測突變的SNaPshot和TaqMan探針法，其中SNaPshot法在使用過程中假陰性和假陽性結(jié)果出現(xiàn)的頻次較高，準(zhǔn)確度低，TaqMan探針法可進(jìn)行大批量的高效檢測，也是近年來廣泛應(yīng)用于檢測綿羊突變的技術(shù)，但成本較高且探針合成周期較長。Zhou等利用TaqMan探針法檢驗突變，并統(tǒng)計分析了不同基因型群體的產(chǎn)羔率，發(fā)現(xiàn)突變顯著影響綿羊的繁殖性能。熒光定量PCR技術(shù)是一種新型核酸定量技術(shù)，具有高靈敏度、高特異性以及可定量分析等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于不同研究的多個領(lǐng)域，是基因檢測的重要工具。在PCR擴增過程中，引物的特異性嚴(yán)重影響擴增的效率，借助這一特性，開發(fā)基于熒光qPCR技術(shù)檢測基因型的方法，以期實現(xiàn)突變簡便易行、廉價有效及批量化的檢測。

產(chǎn)羔、肉和毛皮是綿羊的3大重要經(jīng)濟性狀，其中產(chǎn)羔數(shù)性狀在生產(chǎn)性能中所占權(quán)重最大。產(chǎn)羔數(shù)對養(yǎng)羊業(yè)經(jīng)濟效益的貢獻(xiàn)可達(dá)到74%～96%，產(chǎn)雙羔所獲的經(jīng)濟效益是產(chǎn)單羔的1.6倍以上。目前，作為廣泛認(rèn)知的綿羊多羔主效基因無疑成為了提高綿羊高繁性能的熱點。我國學(xué)者已對很多地方綿羊品種進(jìn)行了檢測，至少發(fā)現(xiàn)9個品種存在突變，但該突變主要存在于小尾寒羊和湖羊中，而灘羊、巴美肉羊等群體中突變的存在率很低。因此，開發(fā)一種簡單快速、高精準(zhǔn)度、成本低廉的綿羊分型方法用于對繁殖力較低群體進(jìn)行高繁個體的篩選勢在必行。本研究根據(jù)基因的核苷酸序列設(shè)計兩對特異性擴增引物，建立了基于熒光qPCR進(jìn)行突變分型的方法，與之前的多種檢測方法相比，具有簡便、準(zhǔn)確、高效和低成本等優(yōu)勢，并通過該技術(shù)篩選我國優(yōu)質(zhì)的地方綿羊品種灘羊中的突變個體，組建優(yōu)質(zhì)的突變高繁灘羊群體，為我國地方綿羊品種的種質(zhì)創(chuàng)新和繁殖性能提升奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 85只已知基因型的健康、適繁雌性灘羊基因組DNA樣本由本實驗室保存，其中包含25個BB型，38個B+型，22個++型。

采用頸靜脈采血法，使用含有EDTA2K抗凝劑的采血管在寧夏吳忠市紅寺堡區(qū)天源良種羊繁育養(yǎng)殖有限公司收集939個灘羊血液樣本，凍存后帶回實驗室。采用血液基因組提取試劑盒提取灘羊基因組DNA，溶于無酶水中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器和試劑 臺式離心機(5424R，Eppendorf公司)，核酸定量儀(Maestro Nano，MaestroGen公司)，實時熒光定量PCR儀(LightCycler96，Roche公司)，冰箱(DW-40 W255，海爾公司)。

血液基因組DNA提取試劑盒(CW0542，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，2×SYBR FAST qPCR Master Mix(A301-05，Gen Star公司)，KOD-Plus-Neo(TOYOBO，KOD-401))高保真酶，瓊脂糖，DL500 DNA marker(TaKaRa，3590A)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 以NCBI數(shù)據(jù)庫中基因的核苷酸序列為參照，設(shè)計PP1、PP2和PP3引物(表1)并委托陜西中科羽瞳生物科技有限公司合成。PP1的反向引物3′端與++型的基因位點相匹配，命名為++型引物；PP2反向引物的3′端和BB型的基因位點相匹配，命名為BB型引物；PP1和PP2共用同一條上游引物。BB型代表基因CDS區(qū)第746位堿基發(fā)生A至G的突變(g.A746G)，導(dǎo)致FecB蛋白第249的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?p.Q249R)，++型代表基因的CDS區(qū)第746位堿基未發(fā)生改變，仍為A。PP3的擴增產(chǎn)物包含突變位點，命名為PCR-Sanger測序引物。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 qPCR法檢測基因型 分別以939只待測或85只已知基因型的灘羊血液基因組DNA為模板在體系1和體系2中進(jìn)行qPCR擴增并采集熒光信號，其中體系1采用++型引物，即PP1，體系2采用BB型引物，即PP2。反應(yīng)體系中待測樣品基因組DNA 1 μL(30～50 ng·μL)，SYBR FAST qPCR Master Mix 5 μL，10 μmol·L的正向引物0.3 μL，10 μmol·L反向引物0.3 μL，去離子水3.4 μL，總體系為10 μL。體系1和體系2同時按照如下程序進(jìn)行擴增：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，40個循環(huán)。

1.2.3 TaqMan探針法檢測基因型 以85個已知基因型的灘羊基因組DNA為模板，使用TaqMan探針法檢測基因型，詳細(xì)操作步驟見參考文獻(xiàn)[14-15]。

1.2.4 PCR-Sanger法檢測基因型 以85個已知基因型的灘羊血液基因組DNA為模板，使用PCR-Sanger測序引物和高保真酶進(jìn)行PCR擴增，擴增體系中待測樣品基因組DNA 2 μL(30～50 ng·μL)，2 mmol·LdNTPs 2.5 μL，25 mmol·LMgSO3 μL，10 μmol·L的正向引物1 μL，10 μmol·L反向引物1 μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2.5 μL，KOD-Plus-Neo 0.5 μL，去離子水12.5 μL，總體系為25 μL。擴增程序為95 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s(每個循環(huán)下降0.2 ℃)，68 ℃延伸25 s，共34個循環(huán)，68 ℃延伸5 min，4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)25 g·L瓊脂糖凝膠電泳鑒定合格后送上海生工生物工程股份有限公司使用FecB-F引物進(jìn)行Sanger測序。

1.2.5 產(chǎn)羔率的統(tǒng)計 對939只灘羊群體中的584只不同基因型母羊在發(fā)情后通過人工授精的方式進(jìn)行配種，記錄不同基因型母羊妊娠及產(chǎn)羔數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

所有數(shù)據(jù)使用Excel 2016進(jìn)行初步整理。等位基因頻率按如下公式計算：B等位基因頻率=(2×BB基因型個體數(shù)量+ B+型個體數(shù)量)/(2×群體數(shù)量)，+等位基因頻率=(2×++基因型個體數(shù)量+B+型個體數(shù)量)/(2×群體數(shù)量)。不同基因型母羊群體產(chǎn)羔率采用卡方檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 基于熒光qPCR的灘羊FecB基因分型

在qPCR進(jìn)行過程中，每擴增一次采集一次熒光信號。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系1和2中擴增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度呈比例增加，根據(jù)體系1和2中熒光信號達(dá)到閾值的先后順序判定待測樣品的基因型。當(dāng)體系1的熒光信號強度先達(dá)到閾值時，判定待測樣品基因為++型(即正常型)(圖1a)；當(dāng)體系1和2的熒光信號同時達(dá)到閾值時，判定待測樣品基因為B+型(即突變雜合型)(圖1b)；當(dāng)體系2的熒光信號強度先達(dá)到閾值時，判定待測樣品基因為BB型(即純合突變型)(圖1c)。

a. ++型熒光信號強度曲線；b. B+型熒光信號強度曲線；c. BB型熒光信號強度曲線a. qPCR fluorescence signal intensity curve of ++ genotype samples; b. qPCR fluorescence signal intensity curve of B+ genotype samples; c. qPCR fluorescence signal intensity curve of BB genotype samples圖1 不同基因型樣品的qPCR熒光信號強度曲線Fig.1 qPCR fluorescence signal intensity curves of different genotype samples

對85只已知基因型的灘羊血液基因組DNA分別使用PCR-Sanger測序、TaqMan探針和熒光定量qPCR技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示PCR-Sanger測序法對BB型、B+型及++型的檢測準(zhǔn)確率分別為100%、94.7%和100%；TaqMan探針法對BB型、B+型及++型的檢測準(zhǔn)確率分別為96.0%、97.4%和100%；qPCR法對BB型、B+型及++型的檢測準(zhǔn)確率均為100%(表2)，表明本研究建立的熒光qPCR技術(shù)對綿羊基因進(jìn)行分型時準(zhǔn)確率更高。

表2 比較3種不同檢測方法的準(zhǔn)確率Table 2 Comparison of accuracy of 3 detection methods

2.2 借助自主開發(fā)的熒光qPCR技術(shù)鑒定灘羊中的FecB突變

由于突變可以提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)，將其用于育種能帶來巨大的經(jīng)濟效益。目前已證實該突變存在于各種高繁殖力綿羊中，主要包括印度的Bonpala綿羊，澳大利亞的Booroola Merino綿羊，伊朗的Kalehkoohi綿羊，中國的湖羊、小尾寒羊和策勒黑羊等。對939只灘羊使用熒光定量qPCR技術(shù)進(jìn)行突變鑒定，結(jié)果顯示584只雌性灘羊中存在3只純合突變(p.Q249R)個體，35只雜合突變個體，546只野生型個體；355只雄性灘羊中存在3只純合突變個體，22只雜合突變個體，330只野生型個體。因此，在檢測的灘羊自然群體中純合突變率僅為0.64%(6/939)，雜合突變率為6.07%(57/939)，野生型為93.29%(876/939)；B等位基因的頻率僅為0.04，+等位基因頻率為0.96(表3)。

表3 FecB基因分布情況Table 3 Genotype and allele frequency of FecB gene

2.3 不同F(xiàn)ecB基因型灘羊的產(chǎn)羔率

在584只不同基因型的雌性灘羊自然發(fā)情后通過人工授精的方式配種并記錄產(chǎn)羔數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示3只BB型母羊全部妊娠，共獲得5只羔羊，產(chǎn)羔率達(dá)166.67%；35只B+型母羊中32只妊娠，獲得49只羔羊，產(chǎn)羔率為153.12%；546只++型母羊中501只妊娠，獲得530只羔羊，產(chǎn)羔率僅為105.78%，卡方檢驗結(jié)果表明，BB型及B+型母羊群體的產(chǎn)羔率極顯著高于++型母羊群體(<0.01)，BB型及B+型母羊群體間的產(chǎn)羔率無顯著差異(=0.65)(表4)。

表4 不同F(xiàn)ecB基因型母羊群體的產(chǎn)羔率Table 4 Lambing rate of ewes with different FecB genotypes

3 討 論

家畜的產(chǎn)仔數(shù)是一個具有巨大經(jīng)濟價值的數(shù)量性狀，受到遺傳背景、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料等多種因素的影響，其中遺傳背景最重要，不同綿羊品種間的繁殖力差異顯著。攜帶基因的綿羊群體具有較高繁殖力，可以大幅提高養(yǎng)殖戶或企業(yè)的經(jīng)濟效益。據(jù)不完全統(tǒng)計，世界上綿羊品種產(chǎn)羔率超過200%以上的僅有10余個。其中布魯拉美利奴優(yōu)秀綿羊種群的平均產(chǎn)羔率可達(dá)350%，我國也擁有以多羔著稱的湖羊和小尾寒羊等高繁殖力綿羊品種，其平均產(chǎn)羔率在250%以上，但國內(nèi)其他大部分品種以產(chǎn)單羔為主。灘羊?qū)儆谖覈湫偷牡头敝沉d羊品種，成年母羊通常每年一胎且每胎單羔，嚴(yán)重制約著灘羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此提高灘羊的繁殖效率是推動灘羊產(chǎn)業(yè)效益倍增的重要前提。由于綿羊產(chǎn)羔性狀的遺傳力僅為0.1左右，傳統(tǒng)選擇方法受到性別和年齡的制約，所以利用常規(guī)育種技術(shù)改良產(chǎn)羔性狀很難在短期內(nèi)獲得較大突破。因此，利用現(xiàn)代分子育種技術(shù)快速提高羊群產(chǎn)羔數(shù)是養(yǎng)羊業(yè)迅速發(fā)展的重要保障。

3.1 FecB突變檢測技術(shù)差異

PCR-RFLP和PCR-SSCP是兩種最先應(yīng)用于基因型檢測的方法，兩者均需要先提取DNA，再利用特異性引物擴增包含突變位點的目標(biāo)產(chǎn)物。兩者的不同在于RFLP法需要利用限制性內(nèi)切酶對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)條帶大小判定基因突變情況。SSCP法需將所得PCR產(chǎn)物變性或進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，最后根據(jù)條帶位置來判定FecB基因是否突變。顯然兩者都需要大量的人工操作，不能進(jìn)行大批量檢測且效率低。SNaPshot檢測技術(shù)通過單堿基延伸技術(shù)結(jié)合測序結(jié)果判斷基因突變情況，但檢測結(jié)果會出現(xiàn)假陽性或假陰性。近年來，TaqMan探針法在檢測基因突變中廣泛使用，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入2種帶有不同熒光基團的探針與目的等位基因配對，根據(jù)所檢測到的熒光值來判斷基因的突變類型。TaqMan探針法具有快速、高效率、操作簡便等優(yōu)點，但因為合成探針價格昂貴，所以檢測成本較高。PCR-Sanger測序法分型具有高準(zhǔn)確率、快速等優(yōu)勢，但PCR產(chǎn)物易受污染，且Sanger測序成本高。因此，借助引物特異性影響擴增效率的基本原理，本研究開發(fā)的基于熒光qPCR技術(shù)檢測基因型的方法與PCR-RFLP和PCR-SSCP法相比假陽性率低，操作簡單，與TaqMan探針法相比僅需合成3條引物，所以大大降低了檢測成本，同時兼具快速高效、簡單精準(zhǔn)的特點。因此，基于熒光qPCR技術(shù)檢測基因型的方法可節(jié)省大量科研資源，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 熒光qPCR檢測技術(shù)的應(yīng)用

產(chǎn)羔性狀是綿羊產(chǎn)羔、肉、毛皮這3大重要經(jīng)濟性狀之一，其所占權(quán)重最大，對養(yǎng)羊業(yè)經(jīng)濟效益的貢獻(xiàn)可達(dá)到74%～96%，據(jù)不完全統(tǒng)計，產(chǎn)雙羔群體所獲得的經(jīng)濟效益是產(chǎn)單羔群體的1.6倍以上?；蛲ㄟ^提高雌性綿羊的排卵數(shù)而直接影響產(chǎn)羔數(shù)，因此通過分子選育在羊群中固定該基因可為養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟效益。在中國的地方綿羊品種中，至少9個品種存在基因突變。隨著種業(yè)振興戰(zhàn)略的布局，優(yōu)良高繁母羊的選配及核心群組建需大批量地篩選基因突變綿羊，且當(dāng)前高繁母羊新品種的育種大部分集中在篩選不同綿羊位點的分子標(biāo)記，本研究建立的熒光qPCR檢測基因突變的方法為此提供了牢實可靠的技術(shù)支撐。

3.3 灘羊FecB基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，綿羊的產(chǎn)羔數(shù)受主效基因和微效多基因共同控制，目前已經(jīng)定位到的主要基因包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白15、-1B(即)、糖基化酶β-1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2、生長分化因子9基因和促卵泡激素受體等，這些基因分別影響著不同綿羊品種的產(chǎn)羔性狀。研究發(fā)現(xiàn)，上述基因中-基因突變體對綿羊多胎的影響遠(yuǎn)大于其他基因，多數(shù)多胎綿羊群體中突變是提高繁殖力的“主效基因”。柳淑芳等研究發(fā)現(xiàn)，湖羊和阿勒泰羊中位點的BB基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)比++基因型個體平均多1.174只，B+基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)比++基因型個體平均多1.016只。Davis等研究發(fā)現(xiàn)，與綿羊產(chǎn)羔數(shù)呈顯著或極顯著相關(guān)(<0.05或<0.01)，因此可用于綿羊人工選育中改善其繁殖力的分子標(biāo)記。本研究對灘羊不同基因型群體母羊的產(chǎn)羔數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，BB和B+基因型母羊群體的產(chǎn)羔率顯著高于++基因型母羊群體，這些結(jié)果與在湖羊、小尾寒羊等綿羊品種上研究結(jié)果一致。本研究中，BB與B+基因型母羊群體產(chǎn)羔率無顯著性差異，這一結(jié)果與BB基因型的母羊樣本數(shù)量較少有很大的關(guān)系。綜上，突變影響著灘羊產(chǎn)羔數(shù)，未來可作為提高灘羊繁殖力的重要分子標(biāo)記，提升灘羊產(chǎn)業(yè)的提質(zhì)增效。Gootwine等發(fā)現(xiàn)BB型綿羊出生重明顯低于B+和++型且斷奶后生長較緩慢，但基因?qū)Υ松L性能的影響會隨著羔羊月齡的增長而減弱。因此，要注重實際生產(chǎn)過程中突變攜帶羔羊的早期飼養(yǎng)管理。

4 結(jié) 論

本研究建立了檢測綿羊突變簡便易行、廉價有效且可批量操作的熒光qPCR方法。利用此技術(shù)，在939只灘羊群體中篩選到63只突變?yōu)┭?，?gòu)建了高繁灘羊核心群，并證實灘羊的突變可顯著提高母羊的產(chǎn)羔率。為篩選低繁殖力綿羊品種的突變，加快本品種高繁殖力核心群的構(gòu)建，打好綿羊種業(yè)振興翻身仗奠定堅實基礎(chǔ)。