產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期雞全基因組甲基化差異及其對肝臟轉(zhuǎn)錄組影響的研究

郭玉龍，職毅豪，李欣妍，董佳佳，李轉(zhuǎn)見,2,3，田亞東,2,3，李 紅,2,3，劉小軍,2,3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，鄭州 450046； 2.河南省雞種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點實驗室，鄭州 450046； 3.河南省家禽育種國際聯(lián)合實驗室，鄭州 450002)

DNA甲基化是指DNA序列上特定的堿基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的催化作用下，通過共價鍵結(jié)合的方式獲得一個甲基基團的化學修飾過程。其中CpG二核苷酸中胞嘧啶(C)上第5位碳原子的甲基化(5 mC)是動、植物等真核生物DNA甲基化的主要形式。基因特定功能元件的甲基化會抑制基因表達，去甲基化則可以使得基因重新表達。研究表明，DNA甲基化參與諸多生物學過程，包括基因印跡、X染色體的失活、基因組穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)座子及逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子沉默及組織特異性基因沉默等。

肝是動物體內(nèi)重要的代謝器官，在脂類分解、合成及運輸?shù)冗^程中均發(fā)揮重要作用。已有的研究表明，DNA甲基化是哺乳動物肝脂質(zhì)代謝的重要調(diào)控機制之一。高脂飲食(HFD)飼喂的小鼠，其肝促炎性半胱天冬酶(1)基因和與能量代謝相關的NADH脫氫酶1β亞基復合物9(9)基因啟動子區(qū)甲基化水平分別顯著降低和升高，從而改變了各自的表達水平。高脂肪蔗糖(HFS)飲食可誘導大鼠肝脂質(zhì)積累，但如果在高脂肪蔗糖飲食中補充甲基供體，會影響小鼠肝脂肪酸合成酶()基因啟動子區(qū)域甲基化水平，進而預防高脂肪蔗糖飲食誘導的肝甘油三酯積累。然而，在一些特定的生理過程中，肝基因表達水平的變化與其甲基化水平并無必然的聯(lián)系。低劑量(1.5 μg·kg)丙二酚S(BPS)處理小鼠可導致其肝374個基因表達水平顯著變化，同時引起58.5%的不同甲基化區(qū)域(DMR)發(fā)生低甲基化。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，包括涉及脂質(zhì)代謝途徑的4個基因(、、6、1)在內(nèi)的18個基因的表達水平受甲基化狀態(tài)影響，但并未發(fā)現(xiàn)這些基因的表達譜和甲基化譜之間存在顯著的關聯(lián)?？梢?，DNA甲基化并不是影響基因轉(zhuǎn)錄的唯一表觀遺傳修飾途徑，還受到其他表觀遺傳修飾的影響。

與哺乳動物相比，雞肝在脂質(zhì)代謝過程中的作用更為重要，超過90%脂肪酸的從頭合成在肝中進行。尤其在產(chǎn)蛋期，在雌激素等生殖激素的協(xié)同作用下，肝脂質(zhì)代謝會更加旺盛，合成大量的甘油三酯、膽固醇和其他脂類，并組裝為極低密度脂蛋白，然后通過血液循環(huán)運輸?shù)缴L中的卵母細胞用于蛋黃的形成。本研究對產(chǎn)蛋前期(20周齡)和產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)雞肝轉(zhuǎn)錄組的比較分析表明，與產(chǎn)蛋前期相比，2 567個基因的表達水平在產(chǎn)蛋高峰期發(fā)生了顯著的變化，這些差異表達基因主要富集于脂質(zhì)代謝生物學過程和代謝通路。但這些基因的表達差異是否與基因組甲基化修飾的改變有關，需要進一步研究。

本研究利用全基因組重亞硫酸鹽測序法(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)分析產(chǎn)蛋前期(20周齡)及產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)盧氏綠殼蛋母雞基因組甲基化模式，結(jié)合肝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探討兩個生理階段基因組甲基化與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關系，為深入研究蛋雞不同生理階段肝代謝的分子調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

試驗動物和樣品采集方法參照文獻[12]。以河南農(nóng)業(yè)大學家禽種質(zhì)資源場飼養(yǎng)的地方品種盧氏綠殼蛋雞為試驗材料，所有試驗雞飼養(yǎng)管理條件一致，自由采食和飲水。根據(jù)盧氏綠殼蛋雞開產(chǎn)日齡及產(chǎn)蛋曲線分析，平均21周齡開始產(chǎn)蛋，28～32周齡達到產(chǎn)蛋高峰。因此，選取產(chǎn)蛋前期(20周齡)及產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)健康盧氏綠殼蛋母雞各3只，頸部靜脈放血處死后，迅速采集肝組織樣品，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 肝全基因組重亞硫酸鹽測序(WGBS)

1.2.1 DNA提取及樣品檢測 利用標準的苯酚-氯仿法提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度，Nanodrop(Life Technologies，美國)檢測DNA的純度(OD/OD比值)，Qubit 2.0(Life Technologies，美國)檢測DNA濃度。

1.2.2 文庫構建 基因組DNA檢測合格后，分別將產(chǎn)蛋前期及產(chǎn)蛋高峰期3個個體的DNA樣品等量混合，加入24 ng陰性對照(λDNA)，使用Covaris S220(Covaris，美國)將基因組DNA隨機打斷至200～300 bp；對打斷后的DNA片段進行末端修復、加A尾，并連接上所有胞嘧啶均經(jīng)過甲基化修飾的測序接頭；隨后進行Bisulfite處理(EZ DNA Methylation Gold Kit，Zymo Research)。未發(fā)生甲基化的C變成U(PCR擴增后變?yōu)門)，而甲基化的C保持不變，最后進行PCR擴增，得到最終的DNA文庫。

1.2.3 文庫質(zhì)檢 文庫構建完成后，將DNA濃度稀釋至1 ng·μL，隨后使用Agilent 2100(Agilent，美國)對文庫的插入片段長度進行檢測，符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2 nmol·L)，以保證文庫質(zhì)量。

1.2.4 上機測序 庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后進行Hiseq測序，測序方式為雙末端測序，由Novogene(北京)完成測序。

1.3 全基因組甲基化測序數(shù)據(jù)分析

1.3.1 參考序列比對分析 參照Bolger等的方法對測序原始數(shù)據(jù)進行過濾，然后利用Bismark軟件(version 0.16.1)將測序的結(jié)果和參考基因組都進行了C→T和G→A(反向互補)的轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的測序結(jié)果和基因組分別進行兩兩比對，計算并輸出每個樣品比對率和Bisulfite(BS)轉(zhuǎn)化率等結(jié)果。

1.3.2 測序深度統(tǒng)計、覆蓋度和胞嘧啶甲基化(mC)分析 每個堿基位點比對到染色體上的讀數(shù)即為該位點的測序深度，并對基因組上每個單堿基位點的覆蓋深度(即支持該位點的reads數(shù))進行計算，據(jù)此得到覆蓋度統(tǒng)計結(jié)果。計算CG、CHH、CHG(H代表A、C或T堿基)3種序列環(huán)境下C位點的測序深度。單個位點甲基化水平計算公式：單個位點甲基化水平=(覆蓋到mC的序列數(shù)/有效覆蓋序列總數(shù))×100。

1.3.3 差異甲基化區(qū)域(DMR)分析 針對無生物學重復的試驗，采用swDMR軟件(http://122.228.158.106/swDMR/)鑒定差異甲基化區(qū)域(differentially methylated region，DMR)。該軟件基于每個位點的甲基化信息(設定reads coverage≥5)，采取滑窗的方法在基因組上掃描，鑒定出甲基化程度存在差異的區(qū)域?；贒MR的重要生物學意義，利用DMR所在的基因組位置與基因組結(jié)構注釋信息，對其進行結(jié)構注釋。不同區(qū)域發(fā)生甲基化其調(diào)控基因表達的方式有所區(qū)別，統(tǒng)計不同功能區(qū)域DMR的數(shù)量。為了更好地了解DNA甲基化與基因表達之間的關系，將基因組劃分為幾個功能區(qū)域，即啟動子(promoter，轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)上游2 kb區(qū)域)，基因體(gene body，5′非翻譯區(qū)(5′UTR)、外顯子(exon)、內(nèi)含子(intron)和3′非翻譯區(qū)(3′UTR))和重復序列(repeat，轉(zhuǎn)座子和其他重復元件)。

1.3.4 差異甲基化基因(differentially methylated gene，DMG)的GO和KEGG富集分析 當DMR所在區(qū)域與特定基因功能元件有重疊時，將相應的基因挑選出來，稱為DMR相關基因(DMGs)。利用GOseq R軟件包對DMGs進行基因本體(GO)富集分析，并對基因長度偏差進行校正，校正后<0.05的GO是DMGs顯著富集項。進一步使用KOBAS軟件檢驗在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路中顯著富集的DMGs。

1.3.5 WGBS和轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)整合分析 將與WGBS同一批次的盧氏綠殼蛋雞產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期轉(zhuǎn)錄組測序原始數(shù)據(jù)已上傳國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)，登記號為GSE70010。對產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期差異表達基因CG、CHG和CHH序列環(huán)境下C位點的甲基化水平進行統(tǒng)計，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組基因表達量的上下四分位數(shù)將基因分為4組：none(FPKM<1)；low(1上四分位數(shù))，默認選取FPKM≥1作為基因是否表達的閾值，分析不同基因表達水平和甲基化水平的相關性，繪制折線圖。基因的甲基化水平按照啟動子(promoter)和基因體(gene body)兩種方式進行統(tǒng)計，分析每個基因的啟動子和基因體區(qū)甲基化水平和基因表達水平的相關性，繪制箱式圖。將基因的甲基化水平值以20%為梯度，按照甲基化水平值大小(甲基化水平值>0)分為5個組別：第一組(1 st group)、第二組(2nd group)、第三組(3rd group)、第四組(4th group)及第五組(5th group)。其中，第一組(1 st group)代表甲基化水平最低，第五組(5th group)代表甲基化水平最高，基因沒有發(fā)生(未)甲基化(unmethylated)代表甲基化水平為0單獨歸為一組。分析不同甲基化水平和基因表達水平的相關性，繪制折線圖。將DMGs與DEGs進行整合，分析基因甲基化不同功能區(qū)域與基因表達的聯(lián)系，篩選與肝脂質(zhì)代謝相關的候選基因。

2 結(jié) 果

2.1 雞肝全基因組甲基化測序結(jié)果與雞參考基因組序列比對分析

產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期盧氏綠殼蛋雞全基因組甲基化測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，平均每個樣品產(chǎn)出過濾后數(shù)據(jù)36.39 Gb，平均每個樣品得到95 572 532條唯一比對序列，平均唯一比對率為73.51%，平均BS轉(zhuǎn)化率為99.84%，≥10×平均覆蓋率為73.50%(表1)。

表1 測序結(jié)果與參考基因組比對情況Table 1 The comparison of reads to the reference genome

2.2 雞肝全基因組DNA甲基化概況

2.2.1 雞肝全基因組甲基化水平分析 產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期兩個生理時期盧氏雞肝全基因組范圍內(nèi)約有4%的胞嘧啶(C)被甲基化(mC)。根據(jù)胞嘧啶(C)序列特征可以將其分為CG、CHH和CHG(H代表A、T或C堿基)3種序列環(huán)境，C位點甲基化主要發(fā)生在CG序列環(huán)境，其次是CHG和CHH(圖1A)。產(chǎn)蛋高峰期mCG百分比(71.40%)要高于產(chǎn)蛋前期(67.73%)，在CHH和CHG序列環(huán)境下，C甲基化比例較低，產(chǎn)蛋前期mCHG和mCHH占比分別為9.39%、22.88%，產(chǎn)蛋高峰期mCHG、mCHH占比分別為7.98%、20.61%(圖1B)。

A.整個基因組中CG、CHG和CHH的平均甲基化水平；B.不同生理階段的不同序列環(huán)境(CG、CHG和CHH)胞嘧啶甲基化百分比A. Average methylation levels of CG, CHG and CHH in the whole genome; B. The proportion of mCG, mCHH and mCHG in different physiological stages圖1 產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期雞全基因組DNA甲基化模式Fig.1 Genome-wide DNA methylation patterns of hens at pre-laying and peak-laying stages

2.2.2 雞全基因組功能區(qū)域甲基化水平分析 為了更好地理解基因外顯子、內(nèi)含子、3′ UTR、5′ UTR和重復序列，將每個基因的各個功能區(qū)域分別等分成20個單位長度，然后對所有的功能元件區(qū)域相應單位長度C位點甲基化水平均值進行統(tǒng)計分析(圖2)。結(jié)果表明，兩生理時期不同基因功能元件在CG、CHG和CHH 3種序列環(huán)境下的甲基化水平變化趨勢一致。DNA甲基化水平在啟動子區(qū)域周圍呈現(xiàn)“V”型趨勢，向基因體區(qū)域上升；同一生理時期不同基因功能元件的甲基化水平存在差異，外顯子、內(nèi)含子、3′ UTR和重復序列甲基化水平較高，啟動子和5′ UTR的甲基化程度較低。

將每個基因的各個功能區(qū)域分別等分成20個單位長度，再計算每個單位長度的甲基化水平求平均值繪制成折線圖。橫坐標代表不同的基因組功能元件，縱坐標為不同序列環(huán)境下各個功能元件的甲基化水平Each element of each gene was divided into 20 bins and the average of all bins in each gene element was obtained. The abscissa represent different gene elements, and the ordinate represent methylation levels of elements in different sequence contexts圖2 甲基化水平在不同基因組功能元件上的分布Fig.2 Methylation levels of various functional regions of gene

2.3 雞肝全基因組差異甲基化區(qū)域(DMR)分析

DMR分析顯示，與產(chǎn)蛋前期相比，產(chǎn)蛋高峰期盧氏綠殼蛋雞全基因組中有670個DMRs，其中，405個超甲基化區(qū)域，265個低甲基化區(qū)域(圖3A)。重復序列及內(nèi)含子區(qū)域在DMRs占主導地位，超甲基化區(qū)域數(shù)量分別為300及174個，低甲基化區(qū)域數(shù)量分別為122及125個(圖3B)。通過對670個DMRs分析，共鑒定到356個有注釋的差異甲基化基因(DMGs)，其中超甲基化211個，低甲基化153個(同一基因不同功能元件可能發(fā)生不同的甲基化)(圖3C)。

A.不同比較組DMR火山圖：橫坐標代表甲基化水平差異，縱坐標代表DMR差異顯著性；B.DMR結(jié)構注釋：橫坐標代表不同功能區(qū)域，縱坐標代表處在不同功能區(qū)域DMR所占的數(shù)量；C.全基因組甲基化測序確定的差異甲基化基因(DMGs)的數(shù)量A. DMR volcano plot for different comparison groups: The abscissa represent differences in methylation levels, and the ordinate represent significant differences in DMR; B. DMR structure notes: The abscissa represent different functional areas, and the ordinate represent the number of DMR in different functional areas; C. The number of differentially methylated genes (DMGs) as determined by WGBS圖3 差異甲基化區(qū)域分析Fig.3 The analysis of differentially methylated regions

2.4 雞肝差異甲基化基因(DMG)功能富集分析

DMGs的GO富集分析表明，超甲基化DMGs主要富集于發(fā)育的正向調(diào)控及細胞形態(tài)改變的調(diào)控等過程(<0.05)，而低甲基化DMGs主要富集于胚胎消化道形態(tài)的發(fā)生、間充質(zhì)細胞增殖的正向調(diào)控(<0.05,圖4A、B)。KEGG通路分析表明，超甲基化DMGs主要參與VEGF信號、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)控、黏著斑及間隙連接等生物學通路(<0.05)，而低甲基化DMGs主要參與淀粉和蔗糖代謝及Wnt信號等生物學通路(<0.05，圖5A、B)。

縱坐標代表GO條目；橫坐標代表基因數(shù)量。柱子長度代表通路的基因數(shù)，柱子越長，基因數(shù)越多。不同顏色代表P值，顏色越紅，P值越小The ordinate represent the GO terms, the abscissa represent the number of genes. The length of column represent the number of genes contained in the particular class, the longer the column indicate the more genes. Different colors represent P value, the redder the color, the smaller the P value圖4 GO富集分類柱狀圖Fig.4 GO enrichment classification histogram

縱坐標代表KEGG通路；橫坐標代表富集因子。圈的大小代表通路的基因數(shù)，圈越大，基因數(shù)越多。不同顏色代表-lg (P-value)，顏色越紅，-lg (P-value) 越大The ordinate represents the KEGG pathways and the abscissa represents the rich factor. The size of circles represent the number of genes contained in the particular class, the larger the circle indicate the more genes. The different colors represent the -lg (P-value), the redder the circles indicate the higher -lg (P-value)圖5 KEGG富集氣泡圖Fig.5 KEGG enrichment bubble chart

2.5 WGBS和RNA-seq數(shù)據(jù)整合分析

2.5.1 雞肝全基因組甲基化與基因表達關聯(lián)分析 為了研究DNA不同區(qū)域甲基化狀態(tài)與基因表達之間的關系，將甲基化數(shù)據(jù)與本課題組先前發(fā)表的肝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行整合分析。

結(jié)果表明，兩個時期雞肝啟動子區(qū)甲基化水平均與基因表達水平顯著負相關(產(chǎn)蛋前期：r=-0.56，=5.14×10；產(chǎn)蛋高峰期：r=-0.48，=1.12×10)，基因體(gene body)甲基化水平也與基因表達水平顯著負相關(產(chǎn)蛋初期：r=-0.78，=3.55×10；產(chǎn)蛋高峰期：r=-0.68，=6.89×10)；隨著甲基化水平降低(5th group～unmethylated)，基因表達水平也會相應升高(圖6A、B)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CG序列環(huán)境下，甲基化水平越低基因表達水平越高，特別是甲基化發(fā)生在啟動子、外顯子及5′ UTR區(qū)域時，但在3′ UTR和內(nèi)含子處甲基化水平與基因表達水平無明顯關系。在CHG和CHH序列環(huán)境下也觀察到相似結(jié)果(圖6C、D)。產(chǎn)蛋前期與產(chǎn)蛋高峰期結(jié)果一致。

A.20周齡甲基化水平組別下的基因表達水平分布圖，基因甲基化水平和表達水平分布盒形圖；C.20周齡在不同區(qū)域的甲基化水平分布圖，橫坐標代表基因功能區(qū)域(gene body)；縱坐標代表不同序列環(huán)境下C位點的甲基化水平，以不同顏色區(qū)分不同的表達水平分組；B、D.30周齡同A、CA. Distribution of gene expression levels under methylation level groups in 20 weeks, the box plots of gene methylation levels and expression level distribution; C. Methylation level distribution of whole genome in 20 weeks, the abscissa represents the functional region of the gene (gene body), the ordinate represent methylation levels of C sites in different sequence environments, with different colors to distinguish different expression level groups; B, D. The same as the A, C in 30 weeks, respectively圖6 甲基化水平與基因表達水平分析Fig.6 Analysis of methylation levels and gene expression levels

2.5.2 DMG與DEG共有基因篩選 前期對盧氏雞產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期肝轉(zhuǎn)錄組的研究表明，與產(chǎn)蛋前期相比，產(chǎn)蛋高峰期有2 567個差異表達基因(DEGs)，包括1 082個上調(diào)基因及1 485個下調(diào)基因。

將全基因組甲基化數(shù)據(jù)中超甲基化基因及低甲基化基因分別與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中下調(diào)表達、上調(diào)表達基因進行整合分析發(fā)現(xiàn)，交集中共有8個超甲基化表達下調(diào)的DMGs(DEGs)，9個低甲基化表達上調(diào)的DMGs(DEGs)(圖7A、B)。其中4個與肝脂質(zhì)代謝相關基因(即1、1、2O、3)的表達水平受到甲基化調(diào)控(表2)。

圖7 肝DMGs和DEGs分析Fig.7 Analysis of DMGs and DEGs in liver

表2 雞肝異甲基化基因與差異表達共有基因信息Table 2 The genes information shared by DMGs and DEGs in chicken liver

3 討 論

DNA甲基化作為重要的表觀遺傳修飾之一，在哺乳動物肝發(fā)育及脂質(zhì)代謝調(diào)控等生理過程的研究較多，但在家禽，尤其是在蛋雞不同生理時期肝全基因組甲基化方面的研究還未見報道。本研究利用WGBS對盧氏綠殼母雞不同生理階段肝全基因組甲基化進行檢測，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，比較分析了產(chǎn)蛋前期與產(chǎn)蛋高峰期盧氏綠殼母雞肝全基因組甲基化差異及其與轉(zhuǎn)錄之間的聯(lián)系，進一步加深了對產(chǎn)蛋期雞肝代謝的表觀調(diào)控機制的理解。

總體而言，產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期全基因組胞嘧啶(C)甲基化(mC)率分別為4.08%和3.82%，兩生理階段甲基化水平差異不顯著。在CG、CHH和CHG 3種序列環(huán)境中，CG序列環(huán)境中C甲基化率最高。同時，雞基因組中甲基化水平在TSS之前急劇下降，而向基因體內(nèi)區(qū)域上升，這與前人研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，雞基因組中>75%的DMR位于內(nèi)含子及重復序列區(qū)域，而位于基因5′UTR、3′UTR和啟動子區(qū)域的DMR較少，這與在人上的研究結(jié)果相似。內(nèi)含子區(qū)域及重復序列區(qū)域甲基化的生物學功能和生理意義還有待進一步研究，以闡明雞肝代謝復雜的表觀調(diào)控機制。

此外，機體可通過改變基因組甲基化狀態(tài)調(diào)控基因的表達，以適應不同的生理和病理條件。本研究中，雖然兩個不同生理時期雞基因組DMGs均富集在與生長發(fā)育及維持細胞基本功能有關的生物學過程，但超甲基化DMGs主要參與VEGF信號、肌動蛋白的細胞骨架調(diào)節(jié)、黏著斑及間隙連接等生物學通路，而低甲基化DMGs主要參與淀粉和蔗糖代謝及Wnt等生物學通路。而淀粉和蔗糖代謝與肝脂質(zhì)代謝密切相關，R-spndin(RSPO)能夠與LGR4/5跨膜受體相互作用激活Wnt/β-catenin通路信號轉(zhuǎn)導，進而促進肝發(fā)育以及參與代謝過程?？梢?，在不同生理階段，可通過基因組中甲基化水平的變化調(diào)控肝中相關基因的功能，以滿足生理需要。

眾所周知，DNA甲基化的主要遺傳效應是基因沉默，但甲基化位點在基因中的位置與其效應密切相關。本研究通過對DNA甲基化圖譜與RNA-seq數(shù)據(jù)之間的相關性進行分析，確定了功能區(qū)域相關DNA甲基化與基因表達的關系，啟動子及基因體區(qū)域甲基化與基因表達顯著負相關，這與已有的研究結(jié)果一致?；騿幼訁^(qū)域的甲基化可抑制基因轉(zhuǎn)錄過程，基因體甲基化可能通過延緩RNA聚合酶Ⅱ的速度導致轉(zhuǎn)錄延伸的速率延緩來影響基因表達水平。也有研究表明，人腦細胞及山羊皮膚組織中基因體甲基化與基因表達的變化無關，甲基化和表達的調(diào)控是一個復雜的過程，受多種因素影響。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋高峰期與產(chǎn)蛋前期母雞肝轉(zhuǎn)錄組相比，有2 567個DEGs，包括1 082個上調(diào)基因及1 485個下調(diào)基因，但只有17個DEGs受到甲基化水平變化的影響。可見，基因組甲基化在產(chǎn)蛋高峰期母雞肝轉(zhuǎn)錄組顯著變化過程中并不起主要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，4個與脂質(zhì)代謝相關基因的表達受到基因組甲基化的調(diào)控。其中HAO1是肝特有的一種具有高脂肪酸氧化酶活性的過氧化物酶，該基因的異常表達會導致肝代謝紊亂，進而促使脂肪肝的形成。而2O基因敲除小鼠對胰島素敏感性增加，血漿總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)和低密度脂蛋白(LDL)水平降低；同時，該基因還參與調(diào)控細胞脂質(zhì)的形成。3參與多種生命活動的調(diào)節(jié)，其作用之一就是參與骨化和脂肪沉積，直接調(diào)節(jié)動物的生長和發(fā)育。1受雌激素調(diào)控參與各種細胞過程(如細胞生長、增殖和分化等)，參與雞生殖系統(tǒng)發(fā)育，對雞生產(chǎn)性能有重要作用。這些基因在盧氏雞產(chǎn)蛋高峰期的甲基化水平均顯著降低，且表達水平均顯著上調(diào)，從而促進產(chǎn)蛋高峰期肝脂質(zhì)代謝。

4 結(jié) 論

本研究利用WGBS測序技術構建了盧氏綠殼蛋雞肝全基因組甲基化圖譜，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，通過比較產(chǎn)蛋前期(20周齡)及產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)的DMRs，鑒定到356個差異甲基化基因(DMGs)，闡述了DNA甲基化在基因表達方面的調(diào)控作用，篩選到4個受甲基化調(diào)控參與肝脂質(zhì)代謝的基因。該研究結(jié)果有助于了解全基因組甲基化在蛋雞不同生理階段肝代謝的表觀遺傳機制。