黃芩苷納米水凝膠對大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的影響

朱文婷 鄒 茵 李曉丹 徐賢寅

牙周炎是一種由牙周致病微生物引起的慢性炎癥和病變,其特征是牙周炎癥和進(jìn)行性牙槽骨破壞。通常通過潔治或刮治來消除致病因素，而局部治療使用化學(xué)藥物治療無法在牙周帶深處進(jìn)行潔治或刮治。大多數(shù)化學(xué)治療劑都是化學(xué)合成的抗菌類沖洗劑，含漱劑和凝膠類抗菌劑。長期全身和局部應(yīng)用抗生素會(huì)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)菌群落失衡，同時(shí)產(chǎn)生耐藥性，不能促進(jìn)牙槽骨的再生。

中藥或天然物質(zhì)治療牙周炎是近年來的研究重點(diǎn)之一。隨著中藥現(xiàn)代化發(fā)展，越來越多具有抗炎作用的化合物從中草藥中分離提取出來，這表明具有潛在的藥理學(xué)作用。黃芩苷是黃芩的干燥根莖中提取出來的一種黃酮類化合物，因其具有顯著的生物活性，在臨床上廣泛用于抗炎、抑菌、抗腫瘤和心腦血管疾病的治療。臨床研究發(fā)現(xiàn)，局部使用黃芩苷可以減少牙周袋的深度，改善牙齦出血，減少牙周炎癥。然而黃芩苷是一種幾乎不溶于水的黃色結(jié)晶，作為藥物生物利用度低。隨著生物材料學(xué)的迅速發(fā)展，越來越多的生物材料作為新型藥物載體應(yīng)用于藥物研究中。納米載體藥物能深入病變部位，并以預(yù)定的速度釋放，從而改善治療效果，減少不良反應(yīng)。因此研究者開發(fā)了一系列藥物載體，如核鞘結(jié)構(gòu)纖維和粒子、多層結(jié)構(gòu)納米纖維膜、粒子包覆纖維或水凝膠等，與傳統(tǒng)藥物比較，可以有效地利用不溶性藥物。本研究采用乳化-蒸發(fā)法制備黃芩苷納米水凝膠，通過考察其藥物特性，并通過構(gòu)建大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎以研究黃芩苷納米水凝膠對大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的保護(hù)作用。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:Wistar大鼠[SCXK(京)2016-0011]購自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；黃芩苷購自上海阿拉丁生物科技有限公司；膽固醇(cholesterol)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；二油?；蚜字?1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)購自艾偉拓(上海)醫(yī)藥科技有限公司；殼聚糖溶液(相對分子質(zhì)量=50000)購自青島海普生物技術(shù)有限公司；IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α ELISA 試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；十六烷基季銨化羧甲基殼聚糖(hqcmc)由本單位實(shí)驗(yàn)室自制；其他化學(xué)試劑均為分析純購自國藥集團(tuán)。本研究使用 savant modulyo 冷凍干燥機(jī)購自美國Varian公司;電子天平購自德國Sartorius公司;納米粒度分析儀(nanozs90 zetasizer)購自英國Malvern公司；掃描電子顯微鏡購自日本HITACHI公司；紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo Fisher公司；離心機(jī)5415d購自德國Eppendorf公司;微量移液器購自德國Eppendorf公司;移液槍頭和離心管等實(shí)驗(yàn)耗材均購自美國Axygen公司。

2.黃芩苷載藥納米水凝膠制備：采用乳化-揮發(fā)法制備黃芩苷納米粒。將8mg黃芩苷和20mg 的mPEG-PCL載體溶于1ml 氯仿作為有機(jī)相。將上述有機(jī)相滴入3ml 5%的聚乙烯醇溶液中進(jìn)行超聲乳化(17.5W，30s)，得到的o/w乳狀液進(jìn)一步分散在含有1%聚乙烯醇的8ml溶液中，室溫?cái)嚢?h，得到的液體用慢濾紙過濾除去可能的黃芩苷沉淀。將上述液體按3% 的比例加入甘露醇中，冷凍干燥72h，在4℃陰暗條件下貯存。無載藥空白納米粒的制備方法與上述方法相同，但有機(jī)相中未加入黃芩苷。以殼聚糖衍生物和二烯基磷脂為支架，合成了黃芩苷納米球，并將其均勻分散于水溶液中，制成凝膠。

3.黃芩苷納米水凝膠的研究:采用粒度分析儀測定黃芩苷納米微球凝膠的粒徑和和電位。采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察藥物在PBS緩沖溶液中的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并測定不同pH值下藥物在一系列作用次數(shù)下的釋放速率。

4.大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的建立及分組：選取30只SPF級牙體牙列完整、無齲壞及牙周異常的5周齡雄性Wistar大鼠，隨后把動(dòng)物隨機(jī)分為5組(每組6只)，即正常組、模型組(牙周炎對照組)、對照組(空白納米水凝膠)、陽性對照組(洗必泰)和實(shí)驗(yàn)組(黃芩苷納米水凝膠)。采用0.2mm正畸鋼絲結(jié)扎雙側(cè)上頜第二磨牙頸部，結(jié)扎后給予10%的糖水代替飲水，前3天每只大鼠每天喂食20mg氨芐青霉素，以抑制普氏菌和核梭桿菌內(nèi)源性細(xì)菌的有害物質(zhì)。每只大鼠每天注射0.5ml 1.0×10CFU/ml 普氏菌+0.5ml 1.0×10CFU/ml 梭狀芽胞桿菌核酸，連續(xù)給藥3天。模型組大鼠喂飼飼料和水，不加干預(yù)。實(shí)驗(yàn)組給予黃芩苷納米水凝膠，對照組給予空白納米水凝膠，陽性對照組在實(shí)驗(yàn)第1周每2天給予0.5ml 洗必泰，隨后每天1次，連續(xù)3周。

5.觀察其抗炎、抑菌作用:第4周觀察牙齦炎癥和牙周袋深度。采用1967年修訂的Loe與Silness檢測方法檢測牙齦指數(shù):0表示健康牙齦組織，1、2、3分別表示輕度、中度和重度白色牙齦炎癥。用滅菌鑷子將滅菌紙尖插入牙周袋，采集左上頜第二磨牙齦下菌斑，放置約20s后，將紙尖插入含1ml無菌PBS的EP管內(nèi)，涂于相應(yīng)的平板上，計(jì)數(shù)作為病原菌的定植試驗(yàn)。采用添加氨芐青霉素(12g/ml)和5%綿羊血的BHI固體培養(yǎng)基計(jì)數(shù)大鼠口腔內(nèi)的梭桿菌核普菌和梭桿菌數(shù)量。

6.牙周組織學(xué)檢查：采用檸檬酸甲酸鈉脫鈣液對大鼠固定牙周組織(包括牙齒)進(jìn)行脫鈣處理2個(gè)月。標(biāo)本用石蠟包埋，切成5μm厚的切片進(jìn)行HE染色。光鏡下觀察大鼠牙周組織切片，觀察牙周組織的破壞情況。

7.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn):在10μg/ml 不含乙二胺四乙酸 (EDTA) 的蛋白酶抑制劑混合物 (Thermo Scientific) 存在下，使用玻璃勻漿器在補(bǔ)充有 0.05%吐溫20(TWEEN-20)的PBS中勻漿牙齦組織。勻漿組織的懸浮液以 1500r/m 離心，收集上清液。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 試劑盒在收集的上清液中測量IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α蛋白的濃度。

結(jié) 果

1.黃芩苷納米球凝膠的粒徑和形態(tài):納米粒度分析儀檢測結(jié)果顯示，黃芩苷納米球凝膠粒徑分布為100～1000nm，平均為577.0nm，分散指數(shù)PDI為0.81(圖1A)，ZETA電位平均值為46.3mV(圖1B)，SEM顯示黃芩苷納米球凝膠為光滑的膠束，大小約為500nm (圖1C)。

2.黃芩苷納米球凝膠在不同pH值溶液中的釋藥速率:根據(jù)黃芩苷在278nm 處的紫外吸收峰，測定了黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定了樣品中游離黃芩苷的含量(圖2A)。根據(jù)黃芩苷的外加質(zhì)量，計(jì)算黃芩苷納米球凝膠包埋黃芩苷的含量、包埋率和載藥量詳見表1。藥物在0.03mol/L PBS (pH=7.4)緩沖液中的釋放速率分別為2、4、6、8、10、12、14、24、36、48、60、72、84、96和120h。黃芩苷在6h內(nèi)的釋放率為73.67%，黃芩苷納米球凝膠的釋放率為36.03%(圖2B)。結(jié)果表明，黃芩苷納米球凝膠具有良好的緩釋特性，不會(huì)突然釋放。

3.抑菌作用:干預(yù)4周后，所有大鼠模型均出現(xiàn)輕度牙齦炎癥，3組間牙齦指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組牙周袋深度為0.79±0.29mm，對照組為0.75±0.32mm，陽性對照組為0.84±0.22mm，實(shí)驗(yàn)組為0.64±0.17mm。實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=-0.613，<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干預(yù)后第2周和第4周大鼠核梭桿菌和普氏菌細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)生變化。干預(yù)4周后，模型組與對照組以及陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組牙周病原菌明顯減少，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05,表2)。

4.牙周組織觀察：干預(yù)4周后，模型組牙周組織與正常牙周組織比較，牙周骨高度降低，血管擴(kuò)張充血，局部炎性細(xì)胞浸潤。干預(yù)4周后，實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組牙槽骨高度降低，牙周組織有輕度炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組的炎性反應(yīng)程度較輕而對照組炎性反應(yīng)變化不大(圖3)。

5.黃芩苷納米水凝膠對實(shí)驗(yàn)性牙周炎中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)影響：干預(yù)4周后，模型組牙周組織與正常牙周組織比較，牙周組織中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α顯著升高。與模型組比較，對照組無明顯變化，陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組均顯著降低；與陽性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組炎性細(xì)胞因子水平也有顯著降低。

討 論

黃芩苷已經(jīng)被證明具有多種生物學(xué)功能，如抗炎、抗氧化和抗菌的作用，由于其生物學(xué)功能，黃芩苷稱為治療牙周炎提供了一種非常有前景的藥物。為了更好地利用其作用筆者使用了生物聚合物給藥系統(tǒng)，從而提高其生物學(xué)功能。在選擇合適的生物生物聚合物的前提下，筆者考慮了黃芩苷和所用材料之間的協(xié)調(diào)作用。殼聚糖是一種常見的生物材料載體，在口腔疾病治療中發(fā)揮這重要作用。本研究筆者利用乳化-蒸發(fā)法制備黃芩苷納米水凝膠，通過考察其藥物特性，并通過構(gòu)建大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎以研究黃芩苷納米水凝膠對大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的保護(hù)作用。

本研究中首先采用殼聚糖衍生物和二油?；蚜字鳛楣羌懿牧现苽涑砂d黃芩苷納米球水凝膠，在解決其水溶性差的基礎(chǔ)上使其能在局部用藥達(dá)到緩釋的效果，以增強(qiáng)療效。改性后的殼聚糖在水介質(zhì)中發(fā)生微相分離形成的具有疏水性內(nèi)核與親水性外殼的兩親性聚合物，可作為疏水藥物的增溶載體,避免因反應(yīng)引入表面活性劑, 同時(shí)能保護(hù)藥物不被迅速降解,使得藥物能緩慢釋放,而親水性外殼則有助于長時(shí)間保留在血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)。因此以殼聚糖衍生物和二油?；蚜字瑯?gòu)建納米緩釋微球水凝膠，提高了體系對疏水性藥物黃芩苷的包封率，包封率可達(dá)95%以上，載藥率為14.21%±0.25%，同時(shí)粒徑較小約577.0nm，表面ZETA電位為+46.3mV，表面光滑，分散均勻，形狀規(guī)則穩(wěn)定。體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示，藥物緩釋過程中突釋較小，釋放時(shí)間較長，釋放時(shí)間可持續(xù)4天，可在一定程度上避免給藥后藥物吸收的不完全。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將黃芩苷納米球凝膠作用于大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型第2周、第4周進(jìn)行牙周檢查。首先通過對牙周袋深度測量，實(shí)驗(yàn)組牙周袋深度小于模型組和對照組，與陽性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，提示黃芩苷納米球凝膠能抑制炎癥對牙周組織的破壞；隨后對牙周組織致病菌核梭桿菌和普氏菌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)黃芩苷納米微球凝膠能有效的抑制牙周致病菌的發(fā)展。通過組織形態(tài)檢查顯示，黃芩苷水凝膠能顯著改善牙周組織炎癥。研究表明，黃芩苷通過抑制牙齦組織中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎介質(zhì)的表達(dá)來減輕炎癥，減少牙槽骨破壞，促進(jìn)牙周結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，本研究結(jié)果與這一發(fā)現(xiàn)一致，并優(yōu)于陽性對照組。因此，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷納米球凝膠生物利用度高，具有緩釋的特性，能用做牙周炎的局部治療藥物。

綜上所述，黃芩苷納米球凝膠具有較高的載藥量和緩釋效果，能夠改善牙齦炎癥、牙周袋深度、微生物及牙周組織病變，這為凝膠治療牙周疾病提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也證明黃芩苷納米球凝膠具有良好的臨床應(yīng)用前景和價(jià)值。