NLRP3炎性小體在脂多糖誘導(dǎo)的高糖心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用及機(jī)制

李 璐 邱 珍 張 藝 田 浩 夏中元

糖尿病患者心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)的發(fā)生率、梗死心肌的面積及充血性心力衰竭的發(fā)生率均顯著高于非糖尿病患者。MIRI合并膿毒癥患者的心肌常同時(shí)面臨供氧不足和氧利用受損的雙重打擊。膿毒癥條件下，病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)和損傷相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns, DAMPs)是缺血再灌注期間心肌損傷加重的重要機(jī)制，而炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激也與膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷密切相關(guān)。

NLRP3炎性小體是一種細(xì)胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物，由Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor protein-3, NLRP3)、含有CARD的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC) 和半胱天冬酶-1前體(pro-caspase-1)組成。NLRP3炎性小體誘導(dǎo)pro-caspase-1進(jìn)行自我切割和活化，刺激促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放，引起炎性細(xì)胞積聚，放大炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。外源性刺激脂多糖(LPS)可通過(guò)誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生、活化NLRP3炎性小體介導(dǎo)炎性反應(yīng)和細(xì)胞焦亡的發(fā)生。糖尿病狀態(tài)下，高血糖引起的代謝紊亂、氧化應(yīng)激增加以及線粒體功能障礙導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加，加重糖尿病心肌損傷。筆者前期研究表明，ROS誘導(dǎo)NLRP3炎性小體激活介導(dǎo)的caspase-1依賴(lài)性細(xì)胞焦亡在糖尿病大鼠MIRI中起重要作用。

本研究擬探討NLRP3炎性小體的激活對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞高糖H/R損傷的作用及其潛在機(jī)制。

材料與方法

1.細(xì)胞與試劑：H9C2大鼠心肌細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海);10%胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;乳酸脫氫酶 (LDH)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 和cell counting kit-8(CCK-8)試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京建成生物科技有限公司；線粒體ROS檢測(cè)采用MitoTracker Red CMXRos試劑盒購(gòu)自上海翔圣生物科技有限公司；Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa Bio公司；NF-κB抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology (CST) 公司；ASC、caspase-1抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology(Santa)公司;IL-1β抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；NLRP3抗體購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司；熒光二抗(山羊抗兔)購(gòu)自美國(guó)CST公司。

2. H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)與分組：H9C2心肌細(xì)胞用含10%的胎牛血清、1%雙抗的DMEM于37℃、5%CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.05%胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞接種在6孔板或96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前12h，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理。細(xì)胞隨機(jī)分為4組，即高糖(H)組(葡萄糖終濃度為30mmol/L的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h)、高糖+缺氧/復(fù)氧(H+H/R)組(高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，于含95%N、5%CO和1%O三氣培養(yǎng)箱中缺氧6h，然后于正常培養(yǎng)箱復(fù)氧4h)、高糖+LPS+缺氧/復(fù)氧(H+LPS+H/R)組(高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，再加入終濃度為1μg/ml的LPS繼續(xù)培養(yǎng)24h，后進(jìn)行缺氧6h復(fù)氧4h操作)和高糖+LPS+BAY11-7082干預(yù)+缺氧/復(fù)氧(H+LPS+BAY+H/R)組(施加LPS處理2h后，給予5μmol/L的BAY11-7082)。

3.心肌細(xì)胞活力檢測(cè)：采用CCK-8測(cè)定試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定。待細(xì)胞H/R刺激結(jié)束后，調(diào)整96孔板中細(xì)胞個(gè)數(shù)約為1×10個(gè)/毫升，每孔100μl培養(yǎng)基中加入10μl CCK-8試劑，于37℃培養(yǎng)箱避光孵育3h，酶標(biāo)儀下測(cè)定450nm處吸光度()值。

4.細(xì)胞培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)水平檢測(cè)：采用LDH測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的LDH活性以評(píng)估細(xì)胞損傷，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，混合試劑后，在室溫下放置5min，酶標(biāo)儀下測(cè)定450nm處吸光度值。

5.線粒體ROS檢測(cè)：采用Mito Tracker Red CMXRos試劑盒檢測(cè)線粒體ROS產(chǎn)生，步驟如下：細(xì)胞刺激結(jié)束后，吸去舊培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，加入染色工作液，于37℃培養(yǎng)箱避光孵育30min；然后棄掉染色工作液，PBS洗3遍，加入新鮮培養(yǎng)基，于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍攝。

6.心肌細(xì)胞NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA 表達(dá)測(cè)定：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LRP3、ASC、caspase-1和IL-1β mRNA表達(dá)。使用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用NLRP3、ASC和caspase-1特異性引物通過(guò)定量RT-PCR儀進(jìn)行總體積20μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。讀取Ct值，用2表示目的基因mRNA相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量。

7.Western blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白水平：使用含有蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制劑混合物的預(yù)冷蛋白裂解液(RIPA)裂解心肌細(xì)胞，4℃下12000r/min離心15min，取上清保存。用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加5×上樣緩沖液混勻煮沸10min。用濃度為10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，并濕轉(zhuǎn)于PVDF膜上。將PVDF膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉1h，分別加入NF-κB(1∶1000)、NLRP3(1∶200)、ASC(1∶200)、caspase-1(1∶200)，IL-1β(1∶1000)的一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次10min，用熒光二抗(1∶15000)室溫孵育1h，TBST洗滌3次，每次10min。采用Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀檢測(cè)蛋白條帶，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.各組心肌細(xì)胞活力、上清LDH水平和線粒體ROS產(chǎn)生水平比較：與H組比較，H+H/R組細(xì)胞活性降低，LDH水平升高，線粒體ROS產(chǎn)生增加(<0.05)；LPS處理后，H+LPS+H/R組與H+H/R組比較，細(xì)胞活性進(jìn)一步降低，LDH水平進(jìn)一步升高，線粒體ROS水平進(jìn)一步增加(<0.05)；使用BAY11-7082干預(yù)后，H+LPS+BAY+H/R組與H+LPS+H/R組比較，細(xì)胞活性增加，LDH水平下降，線粒體ROS產(chǎn)生減少(<0.05，圖1)。

2.各組心肌細(xì)胞NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA 表達(dá)的比較：與H組比較，H+H/R組細(xì)胞NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA 表達(dá)上調(diào)(<0.05)；LPS處理后，H+LPS+H/R組NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β mRNA表達(dá)較H+H/R組上調(diào)(<0.05)。BAY11-7082干預(yù)后，與H+LPS+H/R組比較，H+LPS+BAY+H/R組細(xì)胞ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA表達(dá)下調(diào)(<0.05)，NLRP3 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表1。

3.各組心肌細(xì)胞NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)比較：與H組比較，H+H/R組心肌細(xì)胞NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)上調(diào)(<0.05)；LPS處理后，H+LPS+H/R組心肌細(xì)胞NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)較H+H/R組顯著上調(diào)(<0.05)；BAY11-7082干預(yù)后，與H+LPS+H/R組比較，H+LPS+BAY+H/R組細(xì)胞NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(<0.05)，詳見(jiàn)圖2、表2。

討 論

與非糖尿病患者比較，糖尿病患者罹患心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)更高，預(yù)后更差。缺血性心臟病患者在膿毒癥期間氧耗的增加可以導(dǎo)致更加嚴(yán)重的急性冠狀動(dòng)脈綜合征。LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的抗原成分，也是Toll樣受體4激活劑，可以促進(jìn)各種炎性細(xì)胞因子的上調(diào)，而這些細(xì)胞因子在炎性反應(yīng)的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。雖然相關(guān)研究表明，LPS處理可加重MIRI和H9C2心肌細(xì)胞損傷，但其與糖尿病狀態(tài)下的MIRI研究鮮有報(bào)道。因此，本研究中使用1μg/ml的LPS刺激H9C2心肌細(xì)胞，結(jié)果表明LPS可以顯著降低細(xì)胞活力，增加LDH水平，進(jìn)而加重高糖下H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷。

NLRP3炎性小體作為炎性反應(yīng)的介質(zhì)，可以識(shí)別LPS、ATP、葡萄糖、ROS等PAMP和DAMP的刺激。NLRP3炎性小體的活化機(jī)制涉及NLRP3寡聚化、ASC募集和caspase-1活化，活化的caspase-1切割白IL-1β和IL-18前體，將其激活成為有活性的IL-1β和IL-18,并通過(guò)GSDMD細(xì)胞膜孔道將其釋放至細(xì)胞外，招募更多炎性細(xì)胞，擴(kuò)大炎性反應(yīng),引發(fā)下游促炎信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終可使細(xì)胞發(fā)生自噬或焦亡等程序性死亡。近年來(lái)研究表明，抑制NLRP3介導(dǎo)的焦亡作用，可以減輕藥物誘導(dǎo)或心肌梗死后的心肌損傷。

ROS可介導(dǎo)細(xì)胞自噬、焦亡和炎性反應(yīng)的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的損傷主要依賴(lài)過(guò)量生成的ROS。此外，糖尿病的高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)增加了氧化應(yīng)激水平，導(dǎo)致糖尿病心肌中各種細(xì)胞因子的過(guò)度產(chǎn)生。因此，高血糖增加ROS的產(chǎn)生，引發(fā)caspase-1依賴(lài)性的細(xì)胞焦亡可能是糖尿病性心肌病的重要病理機(jī)制之一。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3激活誘導(dǎo)的caspase-1依賴(lài)性細(xì)胞焦亡導(dǎo)致糖尿病MIRI的發(fā)生與發(fā)展。本研究中筆者用LPS作為PAMP信號(hào)刺激H9C2心肌細(xì)胞，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)LPS處理的H9C2心肌細(xì)胞在高糖H/R刺激下，心肌細(xì)胞活性明顯降低，LDH釋放水平、線粒體ROS產(chǎn)生明顯增加，NLRP3、caspase-1和IL-1β的表達(dá)明顯上調(diào)， H9C2心肌細(xì)胞損傷明顯加重。因此，筆者推測(cè)LPS作為PAMP因子可通過(guò)增加線粒體ROS產(chǎn)生激活NLRP3炎性小體，誘導(dǎo)caspase-1和IL-1β炎性反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而加重高糖H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷。

NF-κB的持續(xù)激活在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖/凋亡和炎性反應(yīng)期間炎性細(xì)胞因子水平增加中具有重要作用，也是NLRP3的上游激活因子。BAY11-7082是NF-κB的選擇性抑制劑，它不可逆地抑制NF-κB磷酸化并直接抑制ATP酶活性，從而使ASC寡聚化并激活caspase-1，從而減少NLRP3炎性小體激活。BAY11-7082是一種有效的炎性小體抑制劑，可通過(guò)抑制NF-κB活性進(jìn)而抑制NLRP3炎性小體活性，明顯減輕組織炎性損傷。因此，筆者選擇BAY-11-7082作為NLRP3炎性小體抑制劑，探究NLRP3炎性小體在LPS加重H9C2心肌細(xì)胞高糖H/R損傷的作用機(jī)制。筆者發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用炎性體抑制劑BAY11-7082后，心肌細(xì)胞活性明顯增加，LDH水平和線粒體ROS的產(chǎn)生明顯減少，并且NF-κB、NLPR3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)。以上結(jié)果表明，BAY11-7082作為炎性小體抑制劑可以抑制NLRP3炎性小體活化，進(jìn)而減輕LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞高糖H/R損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，LPS通過(guò)增加線粒體ROS 產(chǎn)生，激活NLRP3炎性小體介導(dǎo)的caspase-1信號(hào)途徑，加重高糖H/R誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷。同時(shí)筆者還發(fā)現(xiàn)，BAY11-7082炎性體抑制劑可通過(guò)抑制NLRP3炎性小體激活來(lái)減輕LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞高糖H/R損傷。因此，NLRP3炎性小體可能是減輕膿毒癥期間心肌I/R損傷的新的治療靶點(diǎn)。然而，本研究為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，存在著一定的局限性，還有待于進(jìn)一步開(kāi)展臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。