乳酸菌和纖維素酶微貯發(fā)酵大豆秸稈過程中pH和微生物的變化

白長勝

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005）

大豆秸稈含有豐富的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等營養(yǎng)成分（顧擁建等，2016），是一種應(yīng)用價(jià)值很高的可再生纖維素資源。長期以來，大豆秸稈都沒有得到合理的處置和有效的利用，大部分被焚燒或閑置在田間地頭，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)（李林等，2021；Kim等，2005）。大豆秸稈中粗纖維含量高，木質(zhì)化程度高，質(zhì)地堅(jiān)硬，直接作為飼料時(shí)，消化率低、適口性差，在飼料中應(yīng)用很少（李妍等，2016）。因此，我國的大豆秸稈資源具有巨大的開發(fā)利用潛力。孫國強(qiáng)等（2001）研究表明，用大豆秸稈菌糠替代部分粗飼料可以提高魯西黃牛的增重。汪源泉（2019）發(fā)現(xiàn)，將益生菌發(fā)酵豆秸替代40%普通豆秸能夠提高肉羊的生產(chǎn)性能和肝腎代謝能力。孫忠銀等（1991）發(fā)現(xiàn)，將豆秸揉絲后飼喂奶牛，可以提高奶牛產(chǎn)奶量。相關(guān)研究表明，大豆秸稈經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚砟軌蛱岣咂錉I養(yǎng)價(jià)值，是一種很好的粗飼料。本試驗(yàn)通過乳酸菌和纖維素酶處理大豆秸稈，研究大豆秸稈微貯過程中pH和微生物數(shù)量的變化規(guī)律，旨在為大豆秸稈微貯發(fā)酵飼料的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 乳酸菌RS26和RS33，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院微生物實(shí)驗(yàn)室分離并保存，活性乳酸菌含量1×108CFU/mL。

1.1.2 酶制劑 纖維素酶酶活10000 IU/g，白銀賽諾生物科技有限公司贈(zèng)送。

1.1.3 大豆秸稈2019年10月份在齊齊哈爾地區(qū)采集，為去除黃豆后的大豆全株。

1.1.4 培養(yǎng)基 乳酸菌培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基；細(xì)菌培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）；真菌和霉菌培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；乳酸菌液體培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，分為8個(gè)處理組，每處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)方案詳見表1。

表1 試驗(yàn)分組

1.3 微貯發(fā)酵 將大豆秸稈切碎至2 cm左右，混合均勻，自然風(fēng)干；測其水分，按照微貯發(fā)酵初始水分60%～65%，計(jì)算所需水的添加量，按照初始活菌數(shù)為105CFU/g計(jì)算乳酸菌菌液添加量，然后用微量噴霧器對大豆秸稈分組均勻噴灑，每個(gè)試驗(yàn)組取10 g樣品作為0 h樣檢測，剩余大豆秸稈裝入30 cm×40 cm聚乙烯袋中，按壓密實(shí)，使用真空封口機(jī)抽氣封口；真空密封后，置于室溫（20℃）條件下微貯，8、16、32、64 d后開袋進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.4 指標(biāo)測定 微生物組成及數(shù)量：無菌操作條件下，稱取10 g大豆秸稈原料以及微貯后的飼料樣品于250 mL三角瓶內(nèi)加90 mL滅菌水，180 r/min搖床振蕩30 min，使其充分混勻，取1 mL混合液，將其在滅菌的試管中梯度稀釋，吸取50 μL稀釋液分別涂布到MRS、NA、PDA培養(yǎng)基平板上，檢測乳酸菌、一般細(xì)菌、霉菌和酵母菌，每個(gè)梯度進(jìn)行3次重復(fù)培養(yǎng)。將PDA平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，MRS和NA平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，分別計(jì)數(shù)（《GB4789.2-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》；《GB4789.35-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》；《GB4789.15-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》）。

pH的測定：上述微貯大豆秸稈混合液使用pH計(jì)直接測定pH（李玲玉等，2017）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆秸稈原料附著微生物 采集的大豆秸稈檢測其表面附著的微生物種類和數(shù)量，結(jié)果見表2。

表2 大豆秸稈附著微生物

2.2 大豆秸稈微貯過程中的pH變化 乳酸菌微貯大豆秸稈過程中，能產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，降低微貯飼料的pH，而pH是評價(jià)秸稈發(fā)酵類飼料質(zhì)量的直接指標(biāo)。大豆秸稈微貯飼料的pH越低，說明飼料中的有機(jī)酸含量越高，微貯飼料的品質(zhì)越好。各試驗(yàn)組大豆秸稈微貯過程中pH變化規(guī)律見圖1。

圖1 各試驗(yàn)組發(fā)酵過程中pH變化

由圖1可知，各試驗(yàn)組的pH隨微貯時(shí)間延長而降低，不同的處理方案，其pH變化趨勢不同。8個(gè)試驗(yàn)組在不同的微貯時(shí)間，試驗(yàn)組1的pH都是最高的，說明不添加乳酸菌，僅憑借大豆秸稈上附著的乳酸菌進(jìn)行微貯，乳酸菌增殖緩慢、產(chǎn)生的有機(jī)酸量少；試驗(yàn)組2和3變化趨勢基本一致，在微貯16～32 d時(shí)，pH迅速下降，在微貯32～64 d時(shí)，pH基本穩(wěn)定，可能是原料中可供乳酸菌利用的糖類已基本消耗完，不再產(chǎn)生有機(jī)酸；試驗(yàn)組4在微貯8～32 d時(shí)，pH迅速下降，在微貯32～64 d時(shí)，pH下降緩慢，最終pH與試驗(yàn)組2和3接近，可能是同時(shí)添加兩種乳酸菌，發(fā)酵過程中產(chǎn)生協(xié)同作用，促進(jìn)產(chǎn)酸，但原料中可利用的糖類含量相同，所以最終pH基本一致；試驗(yàn)組5在微貯8～32 d時(shí)，pH迅速下降，微貯32～64 d時(shí)，pH下降速率變慢，最終pH低于試驗(yàn)組2、3和4，可能是纖維素酶將大豆秸稈中的纖維素分解成糖類，使乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸增加；試驗(yàn)組6和7變化趨勢基本一致，在微貯8～32 d時(shí)，pH迅速下降，在微貯32～64 d時(shí)，pH下降速率變慢，在整個(gè)微貯過程中，試驗(yàn)組6和7的pH均低于試驗(yàn)組2和3，說明乳酸菌和纖維素酶可以起到協(xié)同作用，纖維素酶可以降解纖維素，為乳酸菌提供更多的糖類；試驗(yàn)組8的pH在所有微貯時(shí)間都是最低的，在微貯8～32 d時(shí)，pH迅速下降，在微貯32 d時(shí)，pH基本降到最低，隨后保持穩(wěn)定，說明同時(shí)添加兩種乳酸菌和纖維素酶，可以起到更好的協(xié)同作用，有利于微貯發(fā)酵的進(jìn)行。

2.3 大豆秸稈微貯過程中微生物種類與數(shù)量

2.3.1 乳酸菌 由圖2可知，所有試驗(yàn)組隨著微貯時(shí)間增加，乳酸菌數(shù)量增多，前期增長迅速，后期增長緩慢。試驗(yàn)組1不添加外源乳酸菌，其中乳酸菌數(shù)量增長最慢，最終數(shù)量最少；添加乳酸菌，可以直接利用大豆秸稈中的可發(fā)酵糖類，迅速增殖，所以添加1種乳酸菌的試驗(yàn)組2和3比試驗(yàn)組1增長的更迅速，添加兩種乳酸菌的試驗(yàn)組4比添加1種乳酸菌的試驗(yàn)組2和3增長的快；纖維素可以水解大豆秸稈中的纖維素生成糖類，供給乳酸菌作為發(fā)酵底物，所以添加纖維素酶的試驗(yàn)組5比試驗(yàn)組1和添加1種乳酸菌的試驗(yàn)組2和3增長的快，同時(shí)添加乳酸菌和纖維素的試驗(yàn)組6和7比單獨(dú)添加乳酸菌的試驗(yàn)組2和3增長的快，同時(shí)添加兩種乳酸菌和纖維素酶的試驗(yàn)組8乳酸菌增長最快。

圖2 大豆秸稈微貯過程中乳酸菌數(shù)量變化情況

2.3.2 一般細(xì)菌 由圖3可知，所有試驗(yàn)組隨著發(fā)酵時(shí)間增加，一般細(xì)菌數(shù)量開始緩慢下降，然后迅速下降，最后趨于穩(wěn)定。微貯過程中，隨著乳酸菌的生長繁殖，消耗氧氣，并且產(chǎn)生有機(jī)酸使pH下降，無氧條件導(dǎo)致大多數(shù)好氧細(xì)菌死亡，同時(shí)，較低的pH也會(huì)抑制一般細(xì)菌的增殖，所以添加乳酸菌的試驗(yàn)組2和3比試驗(yàn)組1數(shù)量少，添加2種乳酸菌的試驗(yàn)組4比添加1種乳酸菌的試驗(yàn)組2和3數(shù)量少；添加纖維素酶的試驗(yàn)組5比試驗(yàn)組1和添加1種乳酸菌的試驗(yàn)組2和3數(shù)量少，同時(shí)添加乳酸菌和纖維素的試驗(yàn)組6和7比單獨(dú)添加乳酸菌的試驗(yàn)組2和3數(shù)量少，同時(shí)添加兩種乳酸菌和纖維素酶的試驗(yàn)組8一般細(xì)菌最少。

圖3 大豆秸稈微貯過程中一般細(xì)菌數(shù)量變化情況

2.3.3 霉菌和酵母菌 所有試驗(yàn)組均未檢測出霉菌和酵母菌。

3 討論

pH是評價(jià)微貯飼料質(zhì)量最簡單且最重要的指標(biāo)，可反映微貯飼料的可保存期限和受腐敗菌和霉菌影響的程度（廖云瓊等，2021；徐曉東等，2021）。pH越低，有害微生物的生長繁殖受到抑制，獲得的微貯飼料品質(zhì)越優(yōu)良，有利于飼料的保存（胡永強(qiáng)等，2018）。本試驗(yàn)中，微貯64 d后，試驗(yàn)組6、7和8的pH均低于4.5，說明飼料微貯發(fā)酵保存效果較好。在整個(gè)微貯過程中，添加乳酸菌和纖維素酶試驗(yàn)組的pH一直低于只添加乳酸菌試驗(yàn)組。這是由于纖維素酶可分解秸稈中的纖維素生成糖類，乳酸菌可以發(fā)酵這些糖類產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，降低了pH，從而抑制了飼料中有害微生物（腐敗菌、酵母菌、丁酸菌等）的生長繁殖（曾輝等，2018）；只添加乳酸菌的試驗(yàn)組，因?yàn)榇蠖菇斩捴锌扇苄蕴妓衔锖枯^少，提供給乳酸菌繁殖發(fā)酵的底物不充足，因此微貯發(fā)酵效果較差。

乳酸菌是微貯過程中的優(yōu)勢菌群，其能夠抑制腐敗菌的活動(dòng)。乳酸菌繁殖過程消耗氧氣，導(dǎo)致好氧細(xì)菌缺氧死亡，可以減少微貯料中營養(yǎng)物質(zhì)的損失，提高微貯料品質(zhì)。在微貯飼料發(fā)酵過程中酵母菌會(huì)增加干物質(zhì)損失和降低飼料開窖后的有氧穩(wěn)定性，因此抑制酵母菌可以減少干物質(zhì)損失和避免二次發(fā)酵（Tennant等，2017）。霉菌是發(fā)酵飼料產(chǎn)生腐敗霉變的主要微生物，使飼料變色、變味、結(jié)塊及適口性下降，嚴(yán)重破壞飼料的營養(yǎng)價(jià)值（程銀華等，2014），因此，微貯過程中的霉菌數(shù)量應(yīng)盡早消失。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)中，同時(shí)添加乳酸菌和纖維素的試驗(yàn)組乳酸菌數(shù)量比單獨(dú)添加乳酸菌的試驗(yàn)組增長的快，所有試驗(yàn)組均未檢測出霉菌和酵母菌。說明乳酸菌和纖維素酶在微貯過程中有良好的協(xié)同作用，乳酸菌大量繁殖，降低pH，進(jìn)而抑制霉菌、酵母菌等好氧微生物的生長。