柴胡陷胸湯對高脂血清誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷NF-κΒ炎性信號通路表達(dá)的影響

王建湘，廖 楊，易 瓊，陳新宇

動脈粥樣硬化(AS)發(fā)病機(jī)制的研究一直是熱點(diǎn)，目前的研究認(rèn)為動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病[1-2], 炎癥是致動脈粥樣硬化發(fā)病的中介和中心環(huán)節(jié)[3]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是一種公認(rèn)的炎癥細(xì)胞信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄蛋白[4]，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的始發(fā)機(jī)制就是緣于NF-κB的激活[5-6]，通過NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活可促進(jìn)細(xì)胞因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)]、黏附分子[細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞間黏附分子-1(VCAM-1)]等基因的表達(dá)[7-9]，也就是說動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展主要通過NF-κB調(diào)控炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)[10-11]，NF-κB已經(jīng)成為炎性疾病新的治療靶點(diǎn)[12-13]。柴胡陷胸湯是由小柴胡湯與小陷胸湯二方加減而成的中醫(yī)經(jīng)典名方，既往開展的臨床實(shí)踐亦證實(shí)該方對冠心病心絞痛具有較好的治療作用[14-15]。本研究擬通過高脂血清誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)細(xì)胞損傷建立模型，探討柴胡陷胸湯對細(xì)胞損傷時 NF-κB炎性信號通路相關(guān)因子蛋白和基因表達(dá)的影響，以闡明其抗動脈粥樣硬化的作用機(jī)制，從而為其臨床防治動脈粥樣硬化疾病提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株傳代培養(yǎng) ECV304購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，首先在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中將細(xì)胞株復(fù)蘇培養(yǎng)，再在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Sigma 公司，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒均購自上海碧云天公司；人TNF-α購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物由上海Gene Pharma合成；TRIzol RNA分離試劑及實(shí)時定量PCR(RT-PCR)試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific(中國)公司；兔抗人NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1、β-actin、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)H&L辣根過氧化物酶(HRP)均購自英國Abcam公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司，iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置、Power PacTM 基礎(chǔ)電泳儀、GC-800光密度掃描儀、ChemiDoc TMMP成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 含藥血清和高脂血清的制備 柴胡陷胸湯組方：柴胡10 g，法半夏10 g，黃芩10 g，黃連4 g，瓜蔞10 g，木香6 g，九香蟲6 g，丹參15 g，甘草6 g等。將以上原藥材稱量后，先將藥材用相當(dāng)于藥材量的5倍自來水浸泡2 h，煮沸后再以微火煎煮30 min，過濾后收集煎液，原渣再加水煎煮20 min，過濾取汁得第二煎液。將兩次煎液混合，根據(jù)文獻(xiàn)[16-17]，為保證按人-兔等效劑量4倍、8倍、16倍給藥，分別將柴胡陷胸湯藥液水浴濃縮成2.6 g/mL、5.1 g/mL、10.2 g/mL。

選用清潔級健康新西蘭大耳白兔15只，體質(zhì)量1.85～2.25 kg，許可證號：SYXK(湘)2020-0010，隨機(jī)分為正常組、柴胡陷胸湯低劑量組、柴胡陷胸湯中劑量組、柴胡陷胸湯高劑量組、辛伐他汀組，每組3只。其中正常對照組給予蒸餾水，柴胡陷胸湯低劑量組、柴胡陷胸湯中劑量組、柴胡陷胸湯高劑量組分別給予柴胡陷胸湯藥液2.6 g/mL、5.1 g/mL、10.2 g/mL，辛伐他汀組給予辛伐他汀18 mg/(kg·d)。每組均按10 mL/kg體質(zhì)量灌胃給藥，每日2 次，連續(xù)灌胃7 d。末次給藥后2 h自耳部中央動脈放血，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔膜濾器過濾，無菌分裝，制備成與實(shí)驗(yàn)分組相同數(shù)量的含藥血清溶液，低溫(-30 ℃)冷藏備用。每組新西蘭雄性大耳白兔3只，每天每只給予高脂乳劑配方(含5 g膽固醇、5 g蛋黃粉、30 g豬油、2 g豬膽酸鈉、2 g吐溫-80、156 g蒸餾水)，以20 mL/kg連續(xù)灌胃2周[18]，所有動物均自由飲水，2周后，禁食不禁水16 h，以麻醉腹主動脈采血，分離血清，56 ℃滅活30 min，微孔濾膜過濾分裝，制備濃度為50 mL/L高脂血清溶液，放置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 上述ECV304傳代細(xì)胞調(diào)節(jié)至密度為5×105/mL，按每孔100 μL接種于96孔板，待細(xì)胞鋪滿孔底后，分為正常對照組(20%正常兔血清)、高脂血清組(20%正常兔血清預(yù)處理2 h后加入50 mL/L高脂血清20%)、柴胡陷胸湯低劑量組、柴胡陷胸湯中劑量組、柴胡陷胸湯高劑量組、辛伐他汀組，每組設(shè)10個復(fù)孔。其中柴胡陷胸湯低劑量組、柴胡陷胸湯中劑量組、柴胡陷胸湯高劑量組、辛伐他汀組采用各組含藥血清(體積分?jǐn)?shù)為20%)預(yù)處理2 h后加入50 mL/L高脂血清20%，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 內(nèi)皮細(xì)胞存活率檢測 實(shí)驗(yàn)完成后收集各組ECV304細(xì)胞，在培養(yǎng)基中加入20 μL/mL的MTT溶液，吸取經(jīng)過MTT培養(yǎng)后的細(xì)胞上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)溶液，將培養(yǎng)板在搖床上低速振蕩10 min，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在490 nm處檢測各組細(xì)胞的吸光值。

1.5.2 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測NF -κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞經(jīng)藥物處理后用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次，吸盡水分后加入放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)組織細(xì)胞裂解液適量，樣品置于冰上裂解20 min，4 ℃、12 000×g下離心15 min。取上清，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按上樣量計(jì)算，加入5×loading buffer 混勻，煮沸10 min。取變性后的蛋白樣品80 μg上樣電泳，電壓100 V；電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(350 mA，2 h)，50 g/L牛血清清蛋白(BSA)室溫封閉2 h，分別加入NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1、β-actin 4 ℃孵育過夜；次日用10×封閉-洗滌緩沖液(TBST)充分清洗，加入相應(yīng)二抗孵育2 h，TBST緩沖液再次清洗，加入顯影劑進(jìn)行顯影，在暗室中對曝光底片進(jìn)行顯影、定影、烤干和照相。采用凝膠成像掃描系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的密度積分比值(p)表示相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平。

1.5.3 RT-PCR 檢測NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá) 上述實(shí)驗(yàn)干預(yù)24 h后收集各組細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，測定(A260/280)比值。以反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Green I熒光染料進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參照。擴(kuò)增條件為95 ℃ 30 s變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。所用引物序列NF-κB(165 bp)：正向引物 5′-AGTGCAGAGGAAACGTCAGAA-3′，反向引物5′-CATTTTACCACTTGGCAGGAA-3′；TNF-α(199 bp)：正向引物5′-TGGCGTGTTCATCCGTTC-3′，反向引物5′-CTACTTCAGCGTCTCGTGTG-3′；ICAM-1 (390 bp)：正向引物5′-TGAAGGCCACCCCAGAGGACAAC-3′，反向引物5′-CCCATTATGACTGCGGCTGCTGCTACC-3′；VCAM-1(354 bp)：正向引物5′-CCAGAATCTAGATATCTTGCTC-3′，反向引物5′-CAGCCTGTCAAATGGGTATAC-3′；β-actin(540 bp)：正向引物5′-TCACCAGGGCTGCTTTTA-3′，反向引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTT-3′。用2-ΔΔCT法計(jì)算基因表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組內(nèi)皮細(xì)胞存活率比較 與正常對照組相比，高脂血清組內(nèi)皮細(xì)胞存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與高脂血清組相比，柴胡陷胸湯各劑量組和辛伐他汀組細(xì)胞存活率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，且以辛伐他汀組和柴胡陷胸湯高劑量組作用更為明顯。詳見表1。

表1 各組內(nèi)皮細(xì)胞存活率比較(±s) 單位：%

高脂血清組與正常對照組比較，①P<0.01；與高脂血清組比較，②P<0.05，③P<0.01。

2.2 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)比較 正常對照組VCAM-1未見表達(dá)。與正常對照組相比，高脂血清組NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與高脂血清組相比，柴胡陷胸湯各劑量組和辛伐他汀組NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且以辛伐他汀組和柴胡陷胸湯高劑量組作用更為明顯。詳見表2及圖1。

表2 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)比較(±s)

圖1 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)的凝膠電泳圖(A為正常對照組；B為高脂血清組；C為柴胡陷胸湯低劑量組；D為柴胡陷胸湯中劑量組；E為柴胡陷胸湯高劑量組；F為辛伐他汀組)

2.3 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)比較 正常對照組VCAM-1mRNA未見表達(dá)。與正常對照組相比，高脂血清組NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與高脂血清組相比，柴胡陷胸湯各劑量組和辛伐他汀組NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)明顯低于高脂血清組(P<0.05或P<0.01)，且以辛伐他汀組和柴胡陷胸湯高劑量組作用更為明顯。詳見表3及圖2。

表3 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)比較(±s)

圖2 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)電泳圖(M為Marker；A為正常對照組；B為高脂血清組；C為柴胡陷胸湯低劑量組；D為柴胡陷胸湯中劑量組；E為柴胡陷胸湯高劑量組；F為辛伐他汀組)

3 討 論

動脈粥樣硬化病變是起始于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[1-2]，而血管內(nèi)皮損傷后發(fā)生的脂質(zhì)代謝紊亂是動脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)，巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞通過攝取大量脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，隨著泡沫細(xì)胞崩解，一方面形成脂肪條紋和引發(fā)炎癥，另一方面也加劇了斑塊的不穩(wěn)定性。所以，本研究采用體外培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞，由高脂血清介導(dǎo)損傷，可較準(zhǔn)確地反映血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化起始及中心環(huán)節(jié)的病理基礎(chǔ)。而新近研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的初始機(jī)制是由于NF-κB激活，NF-κB激活會上調(diào)黏附分子VCAM-1、ICAM-1的表達(dá)，以介導(dǎo)單核細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞并向內(nèi)皮下遷移，從而造成局部組織損傷和炎癥反應(yīng)，而阻斷NF-κB信號通路能下調(diào)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的黏附因子表達(dá)[19-20]。

NF-κB的Rel家族蛋白包括RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p105-p50)和 NF-κB2 (p100-p52)5個成員，這5種蛋白之間可相互形成同源(如p50/p50)或異源(如p50/p65)二聚體。p50/p65異源二聚體是NF-κB所有形式中最重要的一種，幾乎存在于所有細(xì)胞中，可以起到促進(jìn)促炎因子表達(dá)的作用；而p50/p50同源二聚體與 DNA 結(jié)合后抑制了NF-κB 相關(guān)炎癥基因的表達(dá)。靜息狀態(tài)下，NF-κB與κB抑制劑(I-κB)結(jié)合，不具有活性，貯存在細(xì)胞漿中。NF-κB 的活化包括經(jīng)典和非經(jīng)典兩種途徑。當(dāng)NF-κB通過經(jīng)典途徑I-κB激酶(IKK)復(fù)合物激活時，腫瘤壞死因子、IL-1β和脂多糖等被細(xì)胞膜受體識別后，I-κB激酶復(fù)合物被一系列的級聯(lián)反應(yīng)激活，使IκB磷酸化和泛素化，并從NF-κB與IκB形成的復(fù)合物上解離下來，從而進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄，通過刺激促炎細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子、誘導(dǎo)型酶和促血管生成因子的表達(dá)在宿主先天免疫反應(yīng)中起重要作用[21-22]。

中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化的作用機(jī)制，如調(diào)血脂、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗血小板黏附聚集、抗血栓及抗平滑肌細(xì)胞增殖等，認(rèn)為在本虛標(biāo)實(shí)的基礎(chǔ)上，以痰、瘀、毒標(biāo)實(shí)表現(xiàn)者居多，治療予以活血化瘀、除濕祛痰、清熱解毒為主[23]。柴胡陷胸湯出自《重訂通俗傷寒論》，具有疏肝理氣、清熱化痰、活血寬胸之功效，與中醫(yī)常規(guī)的治療動脈粥樣硬化從“痰”“瘀”“毒”入手密切配合，但更強(qiáng)調(diào)肝失疏泄、氣機(jī)郁滯之病機(jī)，治療從疏肝調(diào)肝入手。方中以柴胡疏肝解郁、條達(dá)肝氣，半夏辛開散結(jié)、化痰消痞，共為君藥；佐以黃芩、黃連清瀉肝郁之火，瓜蔞清熱化痰、寬胸散結(jié)；木香、九香蟲均為行氣止痛之要藥，并能疏解肝氣之郁滯；丹參活血祛瘀，甘草補(bǔ)益心氣，調(diào)和諸藥。上藥合用，共奏疏肝理氣化痰、寬胸活血止痛之功效，使氣滯得散，痰瘀自消，心痛得止[14]?，F(xiàn)代藥理研究也表明，柴胡皂苷可降低高脂血癥中三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)水平[24]；半夏與黃連配伍具有降血脂、下調(diào)NF-κB表達(dá)的作用[25]；黃連素抑制NF-κB通路，下調(diào)血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量，增加一氧化氮(NO)水平，保護(hù)冠心病大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞[26]，減輕血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，達(dá)到防治動脈粥樣硬化形成的目的[27-28]；丹參的有效成分丹參酮ⅡA具有調(diào)節(jié)血脂和抗動脈粥樣硬化的作用，其機(jī)制可能與其參與TNF-α/p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)/NF-κB/視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)信號通路調(diào)控有關(guān)[29]。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，由高脂血清介導(dǎo)損傷的ECV304細(xì)胞存活率明顯降低，而NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)明顯升高；柴胡陷胸湯可明顯提高ECV304細(xì)胞存活率，抑制NF-κB活化，降低NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)，提示柴胡陷胸湯通過阻斷NF-κB信號通路，從而降低下游靶基因TNF-α、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗動脈粥樣硬化作用，這可能是其治療動脈粥樣硬化的重要機(jī)制之一，NF-κB可以成為炎性疾病新的治療靶點(diǎn)。