茶葉活性成分對(duì)梨火疫病菌的抑制活性及穩(wěn)定性研究

榮 華，劉 龍，郭慶元

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

0 引言

中國是全球種植梨樹的三大起源中心之一，也是全球主要的梨生產(chǎn)區(qū)域，梨種植面積和產(chǎn)量占世界梨栽培面積和總產(chǎn)量的69.1%和68.4%[1]。梨火疫病(Erwinia amylovora)[2]是中國重大檢疫性細(xì)菌病害，該病傳播速度快、寄主多，目前已經(jīng)分布擴(kuò)散在世界近60多個(gè)國家及地區(qū)。近幾年內(nèi)，與中國相毗鄰的國家如：韓國、哈薩克斯坦、日本等相繼有該病害的報(bào)道。

中國是世界茶葉的發(fā)源地，是產(chǎn)茶大國，也是茶葉的出口大國。茶是中國的國飲，是現(xiàn)在世界上消費(fèi)量最大的飲品之一[3]。1949年開始，中國茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，1950年中國茶葉產(chǎn)量達(dá)6.5萬t，隨著技術(shù)的發(fā)展，在2018年茶葉產(chǎn)量高達(dá)272.6萬t[4]。茶葉和茶籽中含有許多活性成分，具有殺菌抑菌[5]的作用,茶活性成分可以對(duì)人的致病菌起到抑制作用，也對(duì)許多植物病原菌有抑制作用[6-7]。茶多酚具有抗氧化[8]、抗衰老、降血糖[9-10]、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤細(xì)胞生長等廣譜作用[11]；殼寡糖是殼聚糖經(jīng)物理化學(xué)或特殊的生物酶降解得到的一種寡糖產(chǎn)品，其易溶于水，功能多[12]，殼寡糖的作用廣泛，可以抑菌、抗氧化、誘導(dǎo)植物抗病性等，動(dòng)物上可以抗病毒、降血脂等現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛運(yùn)用和報(bào)道[13-17]。茶皂素是油茶加工過程中的一種副產(chǎn)物，現(xiàn)已被廣泛利用，是一種天然農(nóng)藥，可作為原料或助劑生產(chǎn)高效低毒的農(nóng)藥[18-19]?，F(xiàn)已有很多研究表明，茶活性物質(zhì)對(duì)細(xì)菌和真菌都具有一定的抑菌作用。但專門針對(duì)植物細(xì)菌性病害的研究報(bào)道尚少。本研究首先選取茶皂素、綠茶提取物茶多酚和殼寡糖對(duì)梨火疫病菌進(jìn)行了抑菌活性測定實(shí)驗(yàn)；為了解綠茶提取物茶多酚對(duì)梨火疫病菌抑菌活性的穩(wěn)定性，進(jìn)一步測定其在不同溫度、pH和不同時(shí)間紫外照射后的抑菌活性，探討其在農(nóng)業(yè)病害防治中推廣使用的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)。由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理系作物病害研究室A409室提供。

殼寡糖：購自山東陸海藍(lán)圣生物科技股份有限公司，含量98%。綠茶提取物茶多酚：購自安徽紅星藥業(yè)股份有限公司，含量98%。茶皂素：購自天利生物科技，含量95%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 在無菌工作臺(tái)中，將接種環(huán)在火焰上灼燒幾次，挑取少許菌苔于裝有液體NA培養(yǎng)基的錐形瓶中，放入搖床混勻，制成菌懸浮液。細(xì)菌用比濁法計(jì)數(shù)，調(diào)整菌懸液的濃度，制成含菌體量為1×106CFU/mL的菌懸液，備用。

1.2.2 茶活性物質(zhì)抑菌力測定 稱取一定量的茶皂素、綠茶提取物茶多酚和殼寡糖粉劑，分別加入無菌水溶解成濃度為400 mg/mL的茶皂素溶液、茶多酚溶液和殼寡糖溶液。然后用無菌水將400 mg/mL的溶液稀釋成如下幾個(gè)濃度備用：200、250、300、350 mg/mL。

用打孔法，在無菌條件下，將100 μL菌懸液加入到固體NA培養(yǎng)基，用無菌三角玻璃棒涂布均勻后分為3個(gè)區(qū)域，分別在每個(gè)區(qū)域中心用8 mm的打孔器打孔，向孔中加入100 μL的茶活性物質(zhì)溶液，移至28℃恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h，觀察病菌生長情況以及抑菌圈直徑，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，記錄數(shù)據(jù)(mm)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值為依據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 綠茶提取物茶多酚對(duì)梨火疫病菌最低抑菌濃度(MIC)的測定 稱取綠茶提取物茶多酚配成以下幾個(gè)濃度備用：8、10、15、20、25、30、35、36、37、38、39、40、50、75、100 mg/mL，以無菌水為對(duì)照。

用打孔法，在無菌條件下，將100 μL菌懸液加入到固體NA培養(yǎng)基，用無菌三角玻璃棒涂布均勻后分為4個(gè)區(qū)域，分別在每個(gè)區(qū)域中心用8 mm的打孔器打孔，向孔中加入100 μL不同濃度的綠茶提取物茶多酚溶液，移至28℃恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h，觀察病菌生長情況以及抑菌圈的大小，設(shè)定以有抑菌圈的最小濃度為最低抑菌濃度[20](MIC)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值為依據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 綠茶提取物茶多酚抑菌穩(wěn)定性的測定

（1）溫度對(duì)綠茶提取物茶多酚抑菌活性影響 采用106CFU/mL梨火疫病菌為指示菌、40 mg/mL綠茶提取物茶多酚溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將綠茶提取物茶多酚分別在10、40、60、80、100℃下處理30 min，以未處理的提取物作為對(duì)照，采用1.2.2方法測定抑菌活性。

（2）pH對(duì)綠茶提取物茶多酚抑菌活性影響 采用106CFU/mL梨火疫病菌為指示菌、40 mg/mL綠茶提取物茶多酚溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH將綠茶提取物茶多酚的pH調(diào)整為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，以未調(diào)節(jié)pH的提取物為對(duì)照(pH=4.72)，采用1.2.2方法測定抑菌活性。

（3）紫外線照射對(duì)綠茶提取物茶多酚抑菌活性影響 采用106CFU/mL梨火疫病菌為指示菌、40 mg/mL綠茶提取物茶多酚溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將綠茶提取物茶多酚原液置于紫外燈光下（20 W，紫外燈距樣品15 cm）分別照射10、20、30、40、50 min，以未進(jìn)行照射的提取物為對(duì)照，采用1.2.2方法測定抑菌活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析，P＜0.05表明具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶活性物質(zhì)對(duì)梨火疫病菌的抑菌活性測定

采用打孔法檢測茶活性物質(zhì)的抑菌活性，根據(jù)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[21]進(jìn)行判斷：抑菌圈直徑≤6 mm為無抑菌活性，＞6 mm判斷為有抑菌活性，10 mm≥抑菌圈直徑＞6 mm視為低度敏感，15 mm≥抑菌圈直徑＞10 mm視為高度敏感。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示100 μL不同濃度的3種茶活性物質(zhì)對(duì)供試細(xì)菌的抑菌活性不同，綠茶提取物茶多酚抑菌效果明顯，對(duì)梨火疫病菌有強(qiáng)抑菌活性且為高度敏感；殼寡糖有抑菌圈但抑制效果不明顯，濃度＞350 mg/mL時(shí)有抑菌活性為低度敏感，濃度≤300 mg/mL時(shí)無抑菌活性；茶皂素對(duì)梨火疫病菌沒有抑菌活性，如圖1、圖2所示。

圖1 100 μL的茶活性物質(zhì)對(duì)梨火疫病菌生長的抑制作用

圖2 100 μL茶活性物質(zhì)對(duì)梨火疫病菌的抑菌效果

進(jìn)一步研究綠茶提取物茶多酚與殼寡糖之間同濃度不同體積下抑菌情況，可知，當(dāng)加入50 μL濃度為400 mg/mL的綠茶提取物茶多酚和殼寡糖，抑菌效果比加入100 μL同濃度溶液時(shí)較差；50 μL綠茶提取物茶多酚濃度≥350 mg/mL時(shí)為高度敏感；50 μL殼寡糖濃度≥400 mg/mL時(shí)有抑菌活性為低度敏感，如圖3、圖4所示。

圖3 50 μL的茶活性物質(zhì)對(duì)梨火疫病菌生長的抑制作用

圖4 50 μL茶活性物質(zhì)對(duì)梨火疫病菌的抑菌效果

2.2 綠茶提取物茶多酚最小抑菌濃度(MIC)

綠茶提取物茶多酚MIC結(jié)果如表1所示。綠茶提取物茶多酚MIC為40 mg/mL。

表1 綠茶提取物茶多酚的最小抑菌濃度

2.3 綠茶提取物茶多酚抑菌活性的穩(wěn)定性探究

2.3.1 溫度對(duì)綠茶提取物茶多酚抑菌活性影響 綠茶提取物茶多酚經(jīng)不同溫度處理后，與對(duì)照相比其抑菌活性雖略有下降，但即使用100℃高溫處理30 min后依然也保持抑菌活性（圖5），說明綠茶提取物茶多酚有較好的熱穩(wěn)定性，在100℃下的溫度不易發(fā)生分解，因此常規(guī)操作溫度下不會(huì)對(duì)其抑菌活性造成影響。

圖5 溫度對(duì)綠茶提取物茶多酚穩(wěn)定性的影響

2.3.2 pH對(duì)綠茶提取物茶多酚抑菌活性影響 綠茶提取物茶多酚對(duì)供試菌在較寬的pH范圍內(nèi)都有抑菌活性，但隨pH的變化有所波動(dòng)（圖6），具體表現(xiàn)為隨著處理pH的升高(2～10)其抑菌活性逐漸降低，當(dāng)pH為2時(shí)抑菌活性達(dá)到最大，其抑菌活性較對(duì)照組升高40%。在弱酸性條件(pH=4、6)下，其抑菌活性較對(duì)照組分別降低21.95%和44.73%；堿性條件下(pH=8、10)其抑菌活性較對(duì)照組下降了60.76%和100%。可能是提取物經(jīng)堿處理后使所含的某些抑菌成分與堿發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致該抑菌成份的抑菌活性消失。

圖6 pH對(duì)綠茶提取物茶多酚穩(wěn)定性的影響

2.3.3 紫外線照射對(duì)綠茶提取物茶多酚抑菌活性影響不同紫外照射時(shí)間對(duì)綠茶提取物茶多酚的影響（圖7），與對(duì)照相比，當(dāng)處理時(shí)間為10、20 min時(shí)，其抑菌活性比較穩(wěn)定，但隨著處理時(shí)間的延長(30、40、50 min)其抑菌活性略有下降。

圖7 紫外線照射時(shí)長對(duì)綠茶提取物茶多酚穩(wěn)定性的影響

3 討論與結(jié)論

茶多酚抑菌作用廣泛，茶多酚的抑菌特點(diǎn)[22]抑菌譜廣泛、抑菌活性強(qiáng)并且不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。對(duì)革蘭氏陰性菌、兼性厭氧菌、產(chǎn)芽孢桿菌等都具有明顯的抑制作用。唐裕芳[23]研究表明茶多酚相對(duì)細(xì)菌由較強(qiáng)烈的抑菌作用，鹽能提高茶多酚的抑菌活性。殼寡糖和茶皂素在前人研究中均有一定的抑菌效果。本研究中茶多酚抑制效果較好，殼寡糖具有一定的抑菌效果與前人研究結(jié)果基本一致，但本研究中茶皂素對(duì)梨火疫病菌沒有抑菌效果與前人研究的結(jié)果不同，有待進(jìn)一步研究茶多酚的抑菌機(jī)理。丁香提取物和訶子的水提物在高溫處理下，也不會(huì)影響其抑菌效果[24-25]，本研究中綠茶提取物茶多酚熱穩(wěn)定性好，與前人研究結(jié)果基本一致，綠茶提取物茶多酚的熱穩(wěn)定性是其后續(xù)資源開發(fā)利用的前提和保障。本試驗(yàn)結(jié)果表明外界pH影響綠茶提取物茶多酚的穩(wěn)定性，在酸性環(huán)境下，其抑菌活性較為穩(wěn)定，偏堿性會(huì)導(dǎo)致其抑菌效果減弱，此結(jié)果與酚類物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性結(jié)果相一致[26]，在堿性環(huán)境下，其潛在的抑菌活性物質(zhì)酚酸類化合物的酚輕基被破壞，水解生成醒類物質(zhì)，導(dǎo)致其抑菌活性降低[27]。前人研究表明，一些功能性植物提取物如原花青素[28]、黃酮[29]、多酚[30]等物質(zhì)在長時(shí)間紫外輻射的環(huán)境中其含量持續(xù)降低，說明目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生了分解；本試驗(yàn)中綠茶提取物茶多酚的抑菌效果隨著紫外照射時(shí)間的增加在減弱，與前人研究基本一致；紫外照射30 min以上，抑菌活性明顯下降，因此，在紫外光滅菌處理時(shí)，盡量不超過20 min。據(jù)報(bào)道，茶葉中的有效成分除了對(duì)植物病原菌等具有較好的抑制作用外，對(duì)腸道中的有益菌群也具有很好的保護(hù)作用。但目前，對(duì)于茶葉活性物質(zhì)對(duì)抑制植物細(xì)菌性病害的研究甚少，本文只針對(duì)綠茶三種提取物對(duì)細(xì)菌的抑菌效果的初步研究，還需繼續(xù)探討其抑菌機(jī)理，進(jìn)一步開發(fā)其在防治上的應(yīng)用，還需進(jìn)一步研究不同品種茶葉對(duì)細(xì)菌的抑制作用，探討不同茶葉所含抑菌因子濃度對(duì)細(xì)菌的抑菌作用，為茶葉作為一種“天然農(nóng)藥”奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同茶活性物質(zhì)對(duì)梨火疫病菌的敏感性亦有較大差別。綠茶提取物茶多酚和殼寡糖對(duì)梨火疫病菌有一定的抑菌效果，且抑菌效果與其濃度成正比關(guān)系，也與加入的液體體積大小有關(guān)，綠茶提取物茶多酚抑菌效果較好，表現(xiàn)為高度敏感，茶皂素對(duì)其沒有抑菌效果；綠茶提取物茶多酚對(duì)梨火疫病菌的MIC為40 mg/mL；抑菌穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，綠茶提取物茶多酚具有良好的抑菌穩(wěn)定性，10～60℃時(shí)抑菌活性保持穩(wěn)定，但經(jīng)高溫度80～100℃處理后，抑菌活性略有下降；在pH=2時(shí)抑菌活性增強(qiáng)，堿性條件下抑菌活性減弱；紫外照射在30 min以上，抑菌活性會(huì)略微下降。本文研究結(jié)果為茶葉活性物質(zhì)抑菌機(jī)理的探究提供了數(shù)據(jù)支撐，為茶活性物質(zhì)對(duì)梨火疫病防治提供了理論依據(jù)。