先進(jìn)的組學(xué)技術(shù)在植物抗病研究中的應(yīng)用

陳明月，姜 濤，趙冬梅，白 莉，張雪琦，孟 姣

（1黑龍江東方學(xué)院食品工程學(xué)院，哈爾濱 150086；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

組學(xué)技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中先進(jìn)技術(shù)之一。組學(xué)技術(shù)主要包括基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)四個(gè)反面[1]。隨著生物學(xué)研究的不斷深入，單一基因、蛋白功能研究不能完全闡釋生命體錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，組學(xué)技術(shù)從整體角度出發(fā)，探究生物體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，基因及蛋白質(zhì)等分子之間的相互作用[2]。目前組學(xué)技術(shù)成為了解決生物學(xué)難題的有效手段，例如影像組學(xué)技術(shù)、多組學(xué)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于腫瘤及其他疾病的精準(zhǔn)治療，質(zhì)譜技術(shù)、核磁共振技術(shù)應(yīng)用于食品摻假及食源性致病菌檢測，以雙向電泳技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)為主的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)[3-7]。同時(shí)，組學(xué)技術(shù)在藥用植物的鑒定，植物的逆境脅迫和植物優(yōu)勢物種的選育等領(lǐng)域研究也頗多。植物病害嚴(yán)重威脅著植物的生長和發(fā)育，同時(shí)也影響著中國農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)和儲(chǔ)存，其發(fā)生的原因具體分為侵染性病害（細(xì)菌、真菌、病毒和昆蟲侵蝕）和非侵染性病害（光照、水分、溫度和農(nóng)藥）[8]。

由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式、種植制度改變以及環(huán)境污染加劇，一些傳統(tǒng)的病害如稻瘟病、赤霉病和根腐病等植物疾病愈發(fā)嚴(yán)重。如今生物防治例如生防細(xì)菌、生防真菌及生防放線菌的開發(fā)利用越來越受到重視，抗病育種等科學(xué)方法日益改善，但是人們往往對植物抵御病害機(jī)制認(rèn)識(shí)不深入，導(dǎo)致抗病研究受阻。因此明確參與植物抗病的信號傳導(dǎo)途徑，確定關(guān)鍵調(diào)控因子和不同調(diào)控因子形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從而系統(tǒng)地揭示植物抗病性與其生長發(fā)育之間的協(xié)調(diào)關(guān)系極為重要[9]。在探究植物抗病過程中，組學(xué)技術(shù)是探究植物抗病機(jī)理，和抗病前后植物的生長和代謝等生理變化很好的技術(shù)手段。本文主要綜述了組學(xué)技術(shù)在植物抗病研究中的應(yīng)用，對提高植物的抗病性，探究植物抗病機(jī)理及優(yōu)勢物種的選育進(jìn)行了具體闡述。

1 組學(xué)技術(shù)在植物抗病研究中的應(yīng)用

1.1 基因組學(xué)技術(shù)

基因組學(xué)利用生物信息學(xué)技術(shù)對物種的所有基因及基因產(chǎn)物進(jìn)行定量研究、功能分析以及表達(dá)調(diào)控，揭示生物體生命活動(dòng)變化規(guī)律[10-11]。其研究內(nèi)容從結(jié)構(gòu)、功能基因組學(xué)逐漸擴(kuò)大到宏基因組學(xué)和表觀基因組學(xué)等[12-13]?；蚪M學(xué)的研究使我們在了解植物基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化方面取得了巨大的進(jìn)展。下一代測序技術(shù)（NGS）的興起和不斷改進(jìn)，從基因組測序方法到標(biāo)記輔助育種，使得基因組學(xué)廣泛應(yīng)用在作物改良中[14]。通過插入突變和沉默基因策略以及表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)的基因功能，使得功能基因組學(xué)在轉(zhuǎn)基因作物中提供獨(dú)特的應(yīng)用[15]。植物病原體基因組學(xué)可以識(shí)別植物疾病產(chǎn)生的原因，幫助找到病原菌防治方法，減少植物耐藥性的發(fā)生，防止農(nóng)藥污染，同時(shí)促進(jìn)植物清理重金屬或其他化合物污染的土壤[16]。

1.1.1 基因組學(xué)技術(shù)在生物脅迫中的應(yīng)用 XU等[17]利用基因組學(xué)技術(shù)在中國主要品種‘揚(yáng)麥16號’和‘中麥895’的雙單倍體(DH)群體中鑒定抗白粉病的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)。在此研究中發(fā)現(xiàn)的新的QTL及其緊密連鎖標(biāo)記將有助于提高白粉病抗性品種的選育。YU等[18]在比較基因組學(xué)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一種常見正向引物和物種特異性反向引物，建立了一種快速、可靠的多重PCR方法。并且同時(shí)檢測出黃瓜中5種重要病原菌，為黃瓜田間病害診斷提供了一種有效工具。谷子葉瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的，是中國最常見的稻瘟病。TIAN等[19]在‘豫谷5號’的1號、2號和8號染色體上，利用基因組重測序分析鑒定出3個(gè)抗稻瘟病的QTL，分別是QLB-czas1、QLB-czas2和QLB-cazas8，這些新抗性QTL的鑒定將應(yīng)用于新品種選育、谷子抗稻瘟病遺傳控制研究。

1.1.2 基因組學(xué)技術(shù)在生防菌中的應(yīng)用 芽孢桿菌B25是一種有效的玉米病原真菌鐮刀菌(Fusarium verticillioides，F(xiàn)v)生防劑，DOURIET-GáMEZ 等[20]為了確定生物防治所涉及的遺傳性狀，對B25基因組進(jìn)行了測序和分析，同時(shí)對芽孢桿菌屬(Bacillus)中的5種菌株與植物病原真菌生防菌進(jìn)行比較基因組分析，為進(jìn)一步研究B25與Fv相互作用過程中基因表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。噬菌體可對植物病原菌進(jìn)行防治，并且可以降低致病菌的發(fā)病率[21]。侯玉剛[22]從發(fā)病的番茄種植土壤中篩選出4種青枯菌(Ralstonia solanacearum)專性噬菌體，通過對這4種噬菌體的全基因組分析和生物學(xué)特性研究，確定這4種噬菌體均可有效抑制番茄青枯病，并為研制一種新型的抗青枯病藥物提供了理論依據(jù)。

1.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一種基于DNA微陣列技術(shù)(DNA microarray)和測序技術(shù)對信使RNA(mRNA)全基因組表達(dá)水平測量的研究[23]，在整體水平上揭示基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律。主要技術(shù)包括基因表達(dá)系列分析技術(shù)(SAGE)、大規(guī)模平行測序技術(shù)(MPSS)和RNA測序技術(shù)(RNA-seq)[24]。一種新的表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)-微衛(wèi)星標(biāo)記(EST-SSR）被廣泛應(yīng)用于植物的品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建與基因定位克隆等方面[25]。高通量技術(shù)的不斷發(fā)展，使得RNA-seq在植物病原菌及植物與真菌互作研究中有廣泛應(yīng)用[26]，同時(shí)，基于多孔板法和液滴法的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(scRNA-seq)可獲得植物稀有細(xì)胞的基因表達(dá)情況，通過進(jìn)行分離和培養(yǎng)從而用于高通量分析，有助于鑒定植物細(xì)胞類型和探索細(xì)胞生物學(xué)過程[27]。

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在生物脅迫中的應(yīng)用 花生早期葉斑病(ELS)是由花生尾孢菌(Cercospora arachidicola)引起的一種嚴(yán)重的花生葉片病害，嚴(yán)重影響了花生的產(chǎn)量。GONG等[28]利用RNA-seq技術(shù)鑒定了與ELS抗病性相關(guān)的133個(gè)差異表達(dá)基因，其中免疫調(diào)節(jié)因子PAD4在花生早期葉斑病抗性中發(fā)揮重要作用，為植物抗花生葉斑病機(jī)理研究提供科學(xué)依據(jù)。木薯花葉病(CMD)是熱帶主要農(nóng)作物木薯的一種病毒性病害，F(xiàn)REGENE[29]等采用SAGE技術(shù)從木薯子代中提取的大量CMD抗性和易感基因型的mRNA，作為鑒定CMD抗性基因工程的一個(gè)步驟。HU等[30]通過基因芯片技術(shù)鑒定低酸堿度脅迫下小麥幼苗的差異表達(dá)基因，結(jié)果表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，根際堿化可能是小麥幼苗根系對低pH脅迫最早的響應(yīng)過程，為揭示植物質(zhì)子耐毒的分子機(jī)制提供了依據(jù)。甘藍(lán)黑腐病嚴(yán)重影響甘藍(lán)的產(chǎn)量和品質(zhì)，SONG等[31]通過對黑腐病處理后抗性和敏感甘藍(lán)品系之間的綜合轉(zhuǎn)錄組譜分析，表明了NBS-LRR genes,protein kinase genes and expansin genes等在調(diào)節(jié)對黑腐病感染的早期反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，為甘藍(lán)抗黑腐病的遺傳和功能研究提供新的見解。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在生防菌中的應(yīng)用 西瓜枯萎病是一種影響西瓜產(chǎn)量的土傳病害，米丹丹[32]通過平板拮抗和溫室促生防病實(shí)驗(yàn)等方法篩選出生防菌F11，利用RNA-seq技術(shù)揭示F11是通過激活西瓜枯萎病的抗性基因，來提高西瓜對枯萎病的抗性。ZHANG等[33]為了更好地探究叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)的抗病性，對接種AMF的根腐病高發(fā)時(shí)期大豆進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果顯示接種AMF后大豆根系中苯丙氨酸解氨酶、鈣依賴性蛋白激酶和其他防御相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，表明接種AMF促進(jìn)了大豆的發(fā)育增加了植株抗病性。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)是在基因組學(xué)水平上，對蛋白質(zhì)組的表達(dá)、修飾及相互作用的研究，其主要研究內(nèi)容為功能蛋白質(zhì)組和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組[34]。由于蛋白質(zhì)分析是確定其相關(guān)基因功能的最直接方法，因此與基因組序列信息相關(guān)的蛋白質(zhì)組分析是功能基因組學(xué)中一個(gè)非常強(qiáng)大的工具[35]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要包括分離技術(shù)、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)，如蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)(2-DE)、同位素標(biāo)記相對和絕對定量標(biāo)記技術(shù)(iTRAQ)、非定量標(biāo)記技術(shù)(Lable-free)和新興技術(shù)多種全新數(shù)據(jù)非依賴性采集(DIA)等[36]。蛋白質(zhì)組學(xué)在植物與病原菌的相互作用中有所應(yīng)用，如致病性決定因子（效應(yīng)蛋白）、抗病蛋白（抗性和致病相關(guān)蛋白）及其通過翻譯后修飾的調(diào)控作用[37]。同時(shí)，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)提供了更精確地研究植物的技術(shù)手段[38]。

1.3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在生物脅迫中的應(yīng)用 大豆連作容易引發(fā)根腐病，摩西管柄囊霉(Funneliformis mosseae)可有效抑制大豆根腐發(fā)生。BAI等[39]采用iTRAQ和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)對接種了F.mosseae的連作大豆進(jìn)行蛋白質(zhì)差異表達(dá)的分析，為進(jìn)一步研究F.mosseae解決大豆連作障礙提供了理論基礎(chǔ)。鐘俐等[40]利用2-DE技術(shù)對甜瓜白粉病的染病品種和抗病品種的差異蛋白進(jìn)行鑒定分析，對抗病機(jī)理進(jìn)行了深入的研究。玉米赤霉菌(Gibberella zeae)是一種自育子囊菌，能引起玉米等谷類作物的重要疾病，疾病控制需要全面了解玉米有性生殖。LEE等[41]為了鑒定參與這一過程的真菌蛋白質(zhì)，比較了玉米有性生殖的主要調(diào)控因子MAT1-2的野生型菌株和其自身不育菌株的蛋白表達(dá)。采用2-DE和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了13個(gè)蛋白位點(diǎn)蛋白表達(dá)差異。這是迄今為止第一個(gè)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法在玉米中成功地鑒定由MAT1-2調(diào)控的蛋白差異表達(dá)案例。

1.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在非生物脅迫中的應(yīng)用 干旱是嚴(yán)重制約植物生長的環(huán)境因素，為了研究大麥對干旱脅迫的初步反應(yīng)，KAUSAR[42]利用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(2D-PAGE)分析了大麥蛋白質(zhì)譜的變化，結(jié)果表明葉綠體代謝和能量相關(guān)蛋白在干旱脅迫下大麥幼苗的適應(yīng)過程中可能起著重要的作用。鹽脅迫是一種非生物脅迫，土壤中鹽離子濃度的提高導(dǎo)致植物對營養(yǎng)元素和水分吸收降低[43]。陳曉晶等[44]探究了鹽脅迫對燕麥的生理指標(biāo)影響，通過對燕麥進(jìn)行鹽脅迫處理，同時(shí)利用Lable-free技術(shù)分析差異蛋白的表達(dá)，確定響應(yīng)鹽脅迫的相關(guān)蛋白，為探究農(nóng)作物抗鹽機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1.4 代謝組學(xué)技術(shù)

代謝組學(xué)是一門研究完整生命系統(tǒng)的代謝物補(bǔ)體及其對內(nèi)源性因素（如生理和發(fā)育）和外源性因素（如環(huán)境因素和外源性物質(zhì)）變化動(dòng)態(tài)反應(yīng)的新興學(xué)科，代謝物的變化承載著代謝水平、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能方面的豐富信息[45]。代謝組學(xué)廣泛應(yīng)用于植物功能基因組的研究，利用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振技術(shù)(NMR)對生物樣品中的小分子代謝物進(jìn)行定性與定量，可更快尋找植物功能基因，同時(shí)了解植物與環(huán)境之間互作過程，推進(jìn)農(nóng)作物品質(zhì)改良[46-47]。代謝組學(xué)在植物領(lǐng)域大多應(yīng)用在代謝輪廓或代謝物指紋圖譜方面，根據(jù)不同基因型的植物進(jìn)行鑒別和分類，其次可根據(jù)對代謝物的定性與定量分析，來判斷植物的不同生長階段[48]。近年來，代謝組學(xué)聯(lián)合全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)(mGWAS)已經(jīng)不斷應(yīng)用于植物代謝物遺傳多樣性等多方面的研究中，為深入了解不同條件下代謝途徑，提高農(nóng)作物產(chǎn)量與質(zhì)量提供服務(wù)[49]。

1.4.1 代謝組學(xué)技術(shù)在生物脅迫中的應(yīng)用 香蕉炭疽病是香蕉采后最嚴(yán)重的病害之一，LI等[50]對香蕉皮應(yīng)用比較轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)分析方法，對褪黑素處理后的香蕉差異調(diào)控基因和代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究和鑒定，為進(jìn)一步了解褪黑素治療香蕉果實(shí)衰老和炭疽病的發(fā)生提供了理論基礎(chǔ)。KASOTE等[51]為探究西瓜在抗枯萎病過程中引起防御反應(yīng)的關(guān)鍵代謝物，分析了西瓜枯萎病抗性和易感西瓜品種侵染前后葉片組織中激素、褪黑素、酚酸和氨基酸的變化，研究表明茉莉酸甲酯、茉莉酸-異亮氨酸、褪黑素和賴氨酸可能在防御過程中具有關(guān)鍵作用。HEIDARI等[52]采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-QTOF-MS)技術(shù)對不同程度葉斑病抗性甜菜的差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明可以根據(jù)代謝產(chǎn)物區(qū)分敏感和抗性植株，可以更好地了解植物對病害侵染產(chǎn)生的相應(yīng)代謝物，有助于培育抗病作物品種。

1.4.2 代謝組學(xué)技術(shù)在非生物脅迫中的應(yīng)用 CHEN[53]為探究蘋果新生傷口發(fā)生后24 h內(nèi)的代謝變化，采用GC-MS技術(shù)共鑒定了36種代謝成分，并闡述了早期生理變化以及剛受傷蘋果的代謝機(jī)制，提供了促進(jìn)蘋果采后保存和減少其商業(yè)價(jià)值損失的見解。段二龍等[54]利用GC-MS技術(shù)探究在低溫脅迫下木蘭科植物的代謝特性，以不同品種的玉蘭花頂尖為材料分析不同溫度下代謝物差異，為抗寒品種的選育和改良提供依據(jù)。β-谷甾醇(BS)是一種重要的植物生長調(diào)節(jié)劑，LI等[55]通過對BS預(yù)處理的白三葉草進(jìn)行7天水分脅迫。從生理反應(yīng)和代謝組學(xué)的角度探討了BS對白三葉生長和耐水性的影響，為BS誘導(dǎo)的植物生長和耐水性相關(guān)的代謝穩(wěn)態(tài)研究提供了一個(gè)新的視角。

2 展望

植物病害是世界農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要原因。目前植物病害的防治方法主要有：植物免疫、抗病育種、農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、物理機(jī)械防治和生物防治這六種方式[56]。其中抗病育種是一種經(jīng)濟(jì)有效的防治方式。其次生物防治也更為環(huán)保，通過分泌抗菌物質(zhì)、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性和提高植株抗逆性的方法來減少植物病害，具有廣闊的發(fā)展前景[57]。

有研究人員開創(chuàng)了一些新的植物病蟲害監(jiān)測技術(shù)，例如差分遷移譜儀和側(cè)流裝置轉(zhuǎn)、基于噬菌體顯示和生物光子學(xué)的生物傳感器、遙感技術(shù)與基于光譜的方法相結(jié)合的技術(shù)來輔助基于DNA的血清法，為準(zhǔn)確的植物疾病診斷提供了必要的工具[58]。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以在植物抗病中發(fā)揮重要作用，但監(jiān)管問題可能會(huì)阻礙有效的商業(yè)化，雖然組學(xué)技術(shù)成本相對較高，但是隨著科技的發(fā)展有望解決這一問題，并且在未來生物防治劑的商業(yè)化中發(fā)揮重要作用[59]。在植物抗病的蛋白組學(xué)研究過程中，仍有一些低豐富度或低分子量的功能蛋白未被成果鑒定，這取決于質(zhì)譜檢測技術(shù)的靈敏度，同時(shí)一些重要物種基因數(shù)據(jù)庫和植物體內(nèi)代謝物及病原真菌綜合代謝物相關(guān)數(shù)據(jù)庫也需要不斷的補(bǔ)充和完善[60-61]。

一些新興技術(shù)的出現(xiàn)，以及多組學(xué)技術(shù)整合分析，為新時(shí)代植物病毒相互作用的研究帶來了新的契機(jī)。隨著先進(jìn)的組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展和創(chuàng)新，在植物病害的防治研究過程中大量的數(shù)據(jù)表明，組學(xué)技術(shù)在探究植物抗病機(jī)理方面具有重要意義。尤其是在抗性物種的培育和改良中，以環(huán)境保護(hù)為主，提高植物的抗病能力。組學(xué)技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，為現(xiàn)代科技發(fā)展提供了不竭的動(dòng)力源泉，為人類探索生命提供了快捷的方式，使人們解決錯(cuò)綜復(fù)雜的科學(xué)難題成為可能。