響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗多糖工藝

白冰瑤，李泉岑，馬欣悅，吳一凡，喬婉怡，王馥葉，張春蘭*

（1.塔里木大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

紅棗（Ziziphus jujuba Mill.）是鼠李科棗屬植物，在我國新疆、陜西、山西、河北等北方地區(qū)大量種植[1]。紅棗可用于日常直接食用或泡酒、熬粥，在食品工業(yè)中一般用于紅棗飲品的制作，在烘焙類食品中也會(huì)添加紅棗[2]。紅棗中富含多糖[3]、皂苷、維生素、多酚[4]、脂肪酸[5]等營養(yǎng)物質(zhì)，其中紅棗多糖是紅棗最重要的活性成分之一[6]。紅棗多糖具有治療糖尿病、抗炎[7]、增強(qiáng)免疫力、抗癌[8]、抗過敏[9]、抗腫瘤活性[10]等生理功能，同時(shí)還表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。

食品加工過程中，紅棗多糖的損失成為需要解決的重要問題。目前在食品工業(yè)中提取多糖的方法大多為傳統(tǒng)溶劑提取或高溫水提法提取。超聲輔助提取多糖最為普遍，此法具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、提取率高的優(yōu)點(diǎn)[11-14]，而高溫水提法由于耗時(shí)長(zhǎng)、藥品用量高且提取率低[15]，已經(jīng)不能滿足市場(chǎng)需要。低共熔溶劑是綠色溶劑，其污染小、藥品易獲得、毒性小、價(jià)格低廉且與其他有機(jī)溶劑相比，有更高的溶解性和擴(kuò)散性[16-19]，因此采用超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗多糖符合日后食品工業(yè)發(fā)展需求。在研究多糖提取過程中，由于不同低共熔溶劑體系的黏稠度及擴(kuò)散性和對(duì)不同品種多糖的溶解能力不同[20-22]，因此需要對(duì)低共熔溶劑體系進(jìn)行探究。本文以新疆阿克蘇紅棗作為研究對(duì)象，選用超聲輔助低共熔溶劑，通過研究不同低共熔溶劑體系、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比以及含水率對(duì)紅棗多糖提取效果影響的規(guī)律，確定最優(yōu)的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿克蘇紅棗：市售。

無水乙醇（分析純）：天津北聯(lián)精細(xì)化工有限公司；硫酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯酚（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；葡萄糖（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；尿素（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸（分析純）：天津市化學(xué)試劑三廠；氯化膽堿、乳酸、1，4-丁二醇、脯氨酸、蘋果酸（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（LE203E/02）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超級(jí)恒溫水浴鍋（HH-501）：江蘇金怡儀器科技有限公司；超聲清洗機(jī)（JP-060S）：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；真空泵（SHZ-DⅢ）：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-3000A）：上海亞榮生化儀器廠；高速臺(tái)式離心機(jī)（TGL-20B）：上海安亭科學(xué)儀器廠；渦旋混勻器（VM-02U）：美國精騏有限公司；分光光度計(jì)（UV-5500PC）：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

紅棗清洗、去核和切片，放入60℃烘箱烘干，烘干后用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩制備紅棗粉。

1.3.2 低共熔溶劑的制備

按照司悅悅[23]的方法，將氯化膽堿分別與乳酸、1，4-丁二醇、尿素、檸檬酸、脯氨酸和蘋果酸按比例混合，在85℃條件下水浴攪拌至形成清澈透明的溶液。

1.3.3 總多糖提取工藝以及低共熔溶劑體系的確定

按照倪玉嬌等[24]的方法并加以改進(jìn)，稱取1.00 g紅棗粉于離心管中，按照料液比1∶20（g/mL），含水率為20%加入低共熔溶劑16 mL，蒸餾水4 mL混合均勻，40℃超聲30 min，4 000 r/min條件下離心20 min，取上清液，加入4倍體積無水乙醇于4℃環(huán)境中醇沉過夜，4 000 r/min離心20 min收集沉淀，用無水乙醇洗滌沉淀3次后，繼續(xù)4 000 r/min離心10 min收集沉淀，沉淀物加水溶解定容至100 mL，測(cè)量其多糖提取率。低共熔溶劑的種類及比例見表1。

表1 低共熔溶劑的種類及比例Table 1 Types and proportions of low eutectic solvents

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 超聲溫度對(duì)紅棗多糖提取率的影響

在超聲時(shí)間 30 min，料液比 1∶20（g/mL），含水量20%的條件下，探究超聲溫度分別為20、30、40、50、60℃對(duì)紅棗多糖提取率的影響。

1.3.4.2 超聲時(shí)間對(duì)紅棗多糖提取率的影響

在超聲溫度 40 ℃，料液比 1∶20（g/mL），含水量20%的條件下，探究超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min對(duì)紅棗多糖提取率的影響。

1.3.4.3 料液比對(duì)紅棗多糖提取率的影響

在超聲溫度40℃，超聲時(shí)間為30 min，含水量20%的條件下，探究料液比分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30（g/mL）對(duì)紅棗多糖提取率的影響。

1.3.4.4 含水量對(duì)紅棗多糖提取率的影響

在超聲溫度40℃，超聲時(shí)間為30 min，料液比為1∶10（g/mL）的條件下，探究含水量分別為 5%、10%、20%、30%、40%對(duì)紅棗多糖提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比、含水量4個(gè)因素，紅棗中的多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，紅棗多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 紅棗多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 2 Response surface experimental factor level of extraction rate of jujube polysaccharide

1.3.6 多糖提取率的計(jì)算

1.3.6.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

根據(jù)郭毓菲等[25]的方法，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖提取率，將葡萄糖放置于105℃烘箱中烘至恒重后，準(zhǔn)確稱取50 mg，配制成1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取不同體積1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液配置成為0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.250、0.500 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1 mL 6%苯酚和5 mL濃硫酸，渦旋混勻，90℃煮沸20 min后，于490 nm處測(cè)量其吸光值。得線性回歸方程為y=9.851 5x-0.018 4，R2=0.998 2，x為葡萄糖濃度，mg/mL；y 為對(duì)應(yīng)吸光值，根據(jù)回歸方程確定紅棗中多糖濃度。

1.3.6.2 多糖提取率的測(cè)定方法及計(jì)算

吸取紅棗粗多糖溶液1mL，稀釋到一定體積。在稀釋后的溶液中吸取1mL，加入1mL6%苯酚和5mL濃硫酸，使用渦旋混勻器進(jìn)行渦旋，避光保存20min后，于490 nm處測(cè)量其吸光值。多糖提取率計(jì)算公式如下。

式中：C為回歸方程計(jì)算得到紅棗多糖的濃度，mg/mL；V為定容的體積，mL；N為稀釋的倍數(shù)；M為原材料的質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)測(cè)定3次，繪圖采用origin 2019b軟件，響應(yīng)面分析軟件為Design-Expert 8.0.6，采用IBM SPSS Statistics26進(jìn)行顯著性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)低共熔溶劑體系的確定

低共熔溶劑種類對(duì)紅棗多糖提取率的影響見圖1。

圖1 低共熔溶劑種類對(duì)紅棗多糖提取率的影響Fig.1 Effect types of deep eutectic solvents on extraction rate of jujube polysaccharide

由圖1可知，不同低共熔溶劑體系中黏稠度、擴(kuò)散性、電極性以及對(duì)多糖的氫鍵作用力不同，導(dǎo)致能溶解到低共熔溶劑中的紅棗多糖提取率不同[26]。通過比較不同低共熔溶劑種類和比例發(fā)現(xiàn)，控制其他條件不變，當(dāng)氯化膽堿與尿素摩爾比為1∶2時(shí)，從紅棗粉中提取的多糖提取率最高，可能是氯化膽堿與尿素的混合體系黏稠度較低和擴(kuò)散性較強(qiáng)，使多糖溶解率升高。因此，確定摩爾比1∶2的氯化膽堿與尿素為提取紅棗多糖的低共熔溶劑體系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲溫度對(duì)紅棗多糖提取率的影響

超聲溫度對(duì)紅棗多糖提取率影響結(jié)果見圖2。

圖2 超聲溫度對(duì)紅棗多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of jujube polysaccharide

紅棗多糖提取率隨著超聲溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在40℃時(shí)多糖提取率最高。這是因?yàn)樵谖催_(dá)到峰值時(shí)，溫度升高，使其多糖溶解速度加快；當(dāng)溫度高于40℃后，隨著溫度繼續(xù)增大可能會(huì)有其他物質(zhì)析出，導(dǎo)致溶液中的黏稠度增加，抑制多糖的溶解，導(dǎo)致多糖提取率降低[27]。因此，紅棗多糖最優(yōu)提取溫度為40℃。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)紅棗多糖提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)紅棗多糖提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)紅棗多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of jujube polysaccharide

由圖3可知，紅棗多糖提取率隨著超聲時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在30 min時(shí)到達(dá)峰值。這主要是由于在30 min之前紅棗多糖未能被溶劑充分溶解，導(dǎo)致多糖提取率較低；30 min后，由于過度超聲可能引起部分多糖降解，糖苷鍵發(fā)生斷裂，細(xì)胞破碎，結(jié)構(gòu)破壞，引起多糖提取率減少[28]。因此，紅棗多糖提取的最優(yōu)超聲時(shí)間為30 min。

2.2.3 料液比對(duì)紅棗多糖提取率的影響

料液比對(duì)紅棗多糖提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對(duì)紅棗多糖提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of jujube polysaccharide

如圖4所示，隨著溶劑用量的不斷增加，紅棗多糖提取率先上升后下降，在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)取得最大值，且料液比在 1∶5（g/mL）～1∶20（g/mL）時(shí)紅棗多糖提取率變化較小。原因是溶劑用量較小時(shí)低共熔溶劑體系達(dá)到飽和，無法溶解更多的紅棗多糖；當(dāng)溶劑用量較大時(shí)紅棗粉與溶劑體系的接觸面積不斷增大，溶解出其他雜質(zhì)，導(dǎo)致多糖溶解被抑制[29]。因此，選擇1∶10（g/mL）為多糖提取的最優(yōu)料液比。

2.2.4 含水量對(duì)紅棗多糖提取率的影響

含水量對(duì)紅棗多糖提取率的影響結(jié)果見圖5。

圖5 含水量對(duì)紅棗多糖提取率的影響Fig.5 Effect of water content on extraction rate of jujube polysaccharide

如圖5所示，紅棗多糖提取率隨著含水量增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在含水量為20%時(shí)達(dá)到最大值。原因可能是含水量太低時(shí)，溶液體系太黏稠，導(dǎo)致多糖無法充分析出[30]；當(dāng)含水量大于20%后，可能因?yàn)楹侍?，使溶液體系中出現(xiàn)了其他的親水混合物，導(dǎo)致低共熔溶劑與多糖之間的作用力下降，引發(fā)多糖提取率減少[31]。因此，紅棗多糖提取工藝的最優(yōu)含水量確定為20%。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取紅棗多糖工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以紅棗多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3。

表3 紅棗多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface design and results of jujube polysaccharide extraction rate

續(xù)表3 紅棗多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 3 Response surface design and results of jujube polysaccharide extraction rate

2.3.2 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析

通過回歸分析，得出紅棗多糖提取率的回歸方程：紅棗多糖提取率=8.14-0.30A+0.41B-0.16C+0.60D-0.11AB-0.68AC-0.54AD+0.23BC-0.47BD-0.025CD-2.48A2-1.63B2-1.19C2-1.62D2。

方差分析結(jié)果見表4。

表4 紅棗多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiment regression model for jujube polysaccharide extraction rate

根據(jù)表4可知 B、D、A2、B2、C2、D2、AC 對(duì)紅棗多糖提取率影響極顯著（P＜0.01）；A、AD對(duì)紅棗多糖提取率影響顯著（P＜0.05）；C、AB、BC、BD、CD 對(duì)紅棗多糖提取率影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值可知，紅棗多糖提取率的影響因素從大到小依次：含水量＞超聲時(shí)間＞超聲溫度＞料液比。由模型P值＜0.000 1，極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.126 9，不顯著；R2以及RAdj2分別為0.960 4和0.920 8，可知該模型擬合度較好。由此可知，該模型可以較真實(shí)的反應(yīng)紅棗中多糖提取率的提取情況。

2.3.3 交互作用分析

各因素交互作用影響結(jié)果見圖6。

圖6 各因素交互作用對(duì)紅棗多糖提取率的影響Fig.6 Effect of interaction of various factors on extraction rate of jujube polysaccharide

通過等高線圖和3D圖可以直觀發(fā)現(xiàn)各因素交互作用對(duì)紅棗多糖提取率的影響。由圖6中的等高線可知，超聲溫度與料液比和含水量之間所呈現(xiàn)的形狀為橢圓形，且等高線較密集；且相對(duì)應(yīng)的3D圖坡度陡峭，表明超聲溫度與料液比和含水量之間的交互作用對(duì)紅棗中的多糖提取率影響較大，與方差分析表中的結(jié)論相符合。

2.3.4 最優(yōu)工藝條件確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面軟件分析得出，紅棗多糖最優(yōu)的提取條件為超聲溫度39.21℃，超聲時(shí)間31.00 min，料液比1∶9.82（g/mL），含水量 21.84%，在此條件下，預(yù)測(cè)的紅棗多糖提取率為8.23%?？紤]實(shí)際情況，調(diào)整提取工藝為超聲溫度 40 ℃，超聲時(shí)間 30 min，料液比 1∶10（g/mL），含水量為20%，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出紅棗多糖提取率為（8.33±0.26）%，與模型中預(yù)期的結(jié)果差異不顯著，表明該優(yōu)化結(jié)果可靠，可以用于提取紅棗多糖的工藝。

3 結(jié)論

在快速發(fā)展的食品工業(yè)中，傳統(tǒng)溶劑提取紅棗多糖已不能滿足市場(chǎng)需要。由于超聲輔助低共熔溶劑提取多糖具有耗時(shí)短、提取簡(jiǎn)單、提取率高的優(yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)采用超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗多糖，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定了以氯化膽堿與尿素摩爾比1∶2為低共熔溶劑體系的優(yōu)化工藝，通過響應(yīng)面法確定了最優(yōu)提取工藝為超聲溫度40℃，超聲時(shí)間30 min，料液比1∶10（g/mL），含水量20%；在此優(yōu)化工藝條件下，多糖提取率高達(dá)8.33%。該工藝為日后食品工業(yè)中紅棗多糖的提取奠定了理論基礎(chǔ)。