吐納麝香(6-乙?；?1,1,2,4,4,7-六甲基四氫萘)對人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT間隙連接通訊的影響

宿驚濤，劉雯，鄭美，肖雨蒙，杭曉明,*

1.大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，大連 116026

2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275

6-乙?；?1,1,2,4,4,7-六甲基四氫萘(CAS:1506-02-1)，又稱吐納麝香(tonalide,AHTN)，是一種人工合成的半揮發(fā)性環(huán)狀有機化合物，具有與天然麝香相似的氣味，被廣泛應(yīng)用于個人護理品和空氣清新劑等產(chǎn)品中[1-2]。AHTN具有與持久性有機污染物(persistent organic pollutants,POPs)類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)(圖1)，自然狀態(tài)下很難進行化學(xué)和生物降解。目前，在大氣[1-2]、室內(nèi)灰塵[3]、水環(huán)境[4-7]、污泥和沉積物[5-6,8-9]等環(huán)境介質(zhì)中均檢測到AHTN的存在。AHTN具有親脂性，很容易發(fā)生生物富集，目前已在魚類[6,10-11]、貝類[12-14]、人體的母乳[9,15-16]、脂肪組織[15,17-19]和血液[20-21]中發(fā)現(xiàn)AHTN的蓄積。根據(jù)Hu等[21]的研究，AHTN在中國11個城市人群血液的中位濃度為0.53 ng·g-1，換算后約為10-8mol·L-1濃度范圍。

對AHTN的毒性研究已有近30年的歷史，主要集中在基礎(chǔ)毒性[22]、內(nèi)臟毒性[23]、酶活性毒性[24]、氧化損傷毒性[25]、神經(jīng)毒性[26]以及內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[27]等方面。研究顯示，AHTN具有弱雌激素活性，且由雌激素受體(estrogen receptor,ER)介導(dǎo)[27-28]。Schreurs等[29]利用體外報告基因檢測發(fā)現(xiàn)AHTN是弱的ERα激動劑和ERβ拮抗劑。Li等[30]對人體腎上腺皮質(zhì)癌細胞H295R在AHTN暴露后類固醇激素及類固醇生成途徑相關(guān)基因的表達進行了定量分析，發(fā)現(xiàn)AHTN主要通過抑制3βHSD2和CYP21來抑制孕酮和皮質(zhì)醇的產(chǎn)生。此外，Schreurs等[31]發(fā)現(xiàn)0.01、0.1和1 μmol·L-1AHTN暴露對斑馬魚的ER產(chǎn)生劑量依賴的拮抗作用，0.01 μmol·L-1AHTN暴露會產(chǎn)生抗孕激素效應(yīng)[32]。

AHTN的暴露途徑為皮膚接觸、食物攝入和吸入吸收[33]。其中，皮膚接觸是AHTN進入人體最主要的途徑[33-34]。研究表明，AHTN的皮膚暴露量約為5.96 μg·kg-1·d-1[34]。目前AHTN對皮膚的毒性研究非常有限，據(jù)香料材料研究所(Research Institute for Fragrance Materials,RIFM)的報告顯示，AHTN對大鼠和家兔急性皮膚毒性的LD50分別為7.94 g·kg-1和>5 g·kg-1[35]。鑒于富含人工麝香的日化品引起皮膚過敏的案例時有報道，有必要開展其對人體皮膚效應(yīng)的深入研究。

細胞間隙連接通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)是調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、凋亡、致癌作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥及免疫反應(yīng)的重要生物學(xué)機制，是近年來皮膚毒性的重要研究內(nèi)容。GJIC通道由連接蛋白(Connexin,Cx)構(gòu)成，Cx的表達或磷酸化狀態(tài)的改變，會引起多種皮膚疾病[36]。Cx26和Cx43是人角質(zhì)形成細胞間隙連接的主要成分，Cx26表達的改變會增加皮膚癌的易感性，Cx43是一種預(yù)防皮膚癌發(fā)病的保護因子[36]。雌激素可以通過ER介導(dǎo)的基因組[37]和非基因組機制[38]調(diào)節(jié)Cx在細胞中的表達、分布和功能狀態(tài)，進而影響細胞的GJIC功能。其中，基因組機制主要調(diào)節(jié)Cx的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達[37]，非基因組機制(如MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路等)主要調(diào)節(jié)Cx的磷酸化狀態(tài)、空間結(jié)構(gòu)及降解等[38]。

本研究采用人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT，探究環(huán)境相關(guān)濃度AHTN對皮膚細胞GJIC功能的影響及可能的分子機制，為客觀評價AHTN的生物毒性和致癌風(fēng)險提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學(xué)藥品和試劑

分析純AHTN購自上海源葉，雌二醇(E2)、二甲基亞砜(DMSO)和熒光黃染料購自Sigma，ERα抑制劑ICI182780購自MCE。細胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；特級胎牛血清購自萬澤；青鏈霉素混合液和胰蛋白酶-EDTA消化液購自Solarbio。分子生物學(xué)試劑均購自博瑞德，IP裂解液、PMSF和BCA蛋白濃度試劑盒購自碧云天；氯仿、異丙醇等化學(xué)試劑均購自上海生工，所用抗體購于江蘇親科和武漢三鷹公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT由大連海事大學(xué)環(huán)境系統(tǒng)生物學(xué)研究所提供，采用10% FBS、1%鏈霉素和青霉素及88% DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的Thermo 3110細胞培養(yǎng)箱(賽默飛，美國)進行培養(yǎng)。

1.3 暴露處理

采用0.1% DMSO為助溶劑，分別配制10-3mol·L-1AHTN和10-2mol·L-1E2母液，超凈臺中使用0.22 μm的濾膜過濾器抽濾，再用DMSO逐級稀釋為10-4～10-7mol·L-1AHTN和10-6mol·L-1E2工作液。工作液與細胞培養(yǎng)基按1∶1 000的比例稀釋后用于暴露處理，即AHTN的暴露濃度為10-7～10-10mol·L-1，10-9mol·L-1E2為陽性對照，0.1% DMSO為空白對照。每個處理組均6個平行重復(fù)。

1.4 細胞活性檢測

MTT法測定細胞存活率。吸出培養(yǎng)基，PBS溶液清洗3遍，加入150 μL配好的培養(yǎng)基和50 μL 1×MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄上清。加入150 μL DMSO溶液溶解甲瓚，用Molecular Devices SpectraMax M5酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國)測定490 nm波長下各孔的光吸收，計算細胞存活率。細胞存活率=(暴露孔OD/對照孔OD)×100%。

1.5 GJIC功能檢測

細胞劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)(scrape-loading and dye transfer,SLDT)檢測GJIC功能。吸出培養(yǎng)基，PBS溶液清洗3遍，加入質(zhì)量濃度為0.05%熒光黃染料1 mL。用銳利手術(shù)刀片輕劃3次，放入37 ℃培養(yǎng)箱避光標(biāo)記10 min。吸出熒光黃染料，PBS沖洗細胞3次，去除游離熒光染料及脫落的細胞。加入4%多聚甲醛溶液1 mL，室溫固定10 min，棄去固定液。每孔加入1 mL PBS溶液，倒置熒光顯微鏡(Nikon TE2000E)下觀察并拍照(藍色激發(fā)波長為470 nm，綠色發(fā)射波長為505 nm)。熒光圖片采用Photoshop軟件進行反相處理，Image J軟件進行熒光強度數(shù)字化。

1.6 實時熒光定量PCR檢測

Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA，采用SYBR Green為DNA結(jié)合染料，實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測相關(guān)基因的表達。引物設(shè)計使用Primer Express(ABI)進行(表1)，Gapdh為內(nèi)參基因。預(yù)實驗確定引物特異性及擴增效率。RT-qPCR使用ABI7300進行，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40個循環(huán)。獲得的Ct值采用2-△△Ct法進行分析。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法

蛋白定量分析采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法。提取總蛋白，Bradford法進行蛋白定量。Bio-Rad 164-5056電泳儀進行SDS-PAGE，分離膠濃度為10%。轉(zhuǎn)膜、封閉后，與一抗雜交過夜。一抗?jié)舛确謩e：GAPDH(1∶000)，PI3K和AKT(1∶2000)，Cx43、p-AKT和p-Cx43(1∶1000)，ERα、p-PI3K、MEK和ERK(1∶500)，Cx26、p-MEK和p-ERK(1∶250)。TBST清洗后，分別與二抗(1∶2000)雜交1 h。清洗及發(fā)光顯色后，采用UVP GelDoc-It 310凝膠成像系統(tǒng)進行圖像采集，Image J軟件進行條帶的灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗至少進行3次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)以mean±SD表示。統(tǒng)計分析采用T-TEST進行，*P≤0.05、**P≤0.01，具有“顯著性”差異。GraphPad Prism 8軟件繪制圖片。

2 結(jié)果(Results)

2.1 AHTN暴露對HaCaT細胞活性的影響

與DMSO對照組相比，10-8mol·L-1AHTN暴露24 h和10-9mol·L-1AHTN暴露48 h均可顯著促進HaCaT細胞的增殖(P≤0.01)，細胞存活率分別增加12%和13%(圖2)，增殖效率略遜于10-9mol·L-1E2陽性對照組。而10-6mol·L-1AHTN暴露48 h顯著抑制HaCaT細胞的增殖(P≤0.01)，細胞存活率較對照組降低10%(圖2(b))。

圖2 AHTN暴露對HaCaT細胞活性的影響注：DMSO表示二甲基亞砜，E2表示雌二醇，AHTN表示吐納麝香；(a)暴露24 h，(b)暴露48 h；**表示P≤0.01。Fig.2 Effects of AHTN exposure on cell viability in HaCaTNote:DMSO stands for dimethyl sulfoxide,E2 stands for estradiol,and AHTN stands for tonalide;(a) 24 h exposure,(b) 48 h exposure;**represents P≤0.01.

2.2 AHTN暴露對HaCaT細胞GJIC功能的影響

SLDT檢測結(jié)果顯示，10-8mol·L-1AHTN暴露24 h，熒光強度較DMSO對照組上調(diào)8%(圖3(a)和(b))，10-9mol·L-1和10-8mol·L-1AHTN暴露48 h，熒光強度較對照組分別減弱13%和9%(圖3(c)和(d))；而10-9mol·L-1E2暴露均會導(dǎo)致熒光強度增強，24 h增強14%(圖3(a)和(b))，48 h增強6%(圖3(c)和(d))。由此可見，10-8mol·L-1AHTN對HaCaT細胞GJIC功能的影響與10-9mol·L-1E2類似，均隨著暴露時間的延長，熒光強度逐漸降低。

對熒光染料的傳輸范圍進行分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，10-8mol·L-1AHTN暴露24 h熒光染料傳輸了一層細胞(圖3(a))，其余組均沒有明顯的傳輸現(xiàn)象；而10-9mol·L-1E2陽性對照組在24 h和48 h均發(fā)現(xiàn)熒光染料傳輸了一層細胞(圖3(a)和(c))。

圖3 AHTN暴露對HaCaT細胞的細胞間隙連接通訊(GJIC)功能的影響注：(a) 暴露24 h后顯微成像圖(bar=100 μm)，(b) 暴露24 h后熒光強度變化率，(c) 暴露48 h后顯微成像圖(bar=100 μm)，(d) 暴露48 h后熒光強度變化率；*表示P≤0.05，**表示P≤0.01。Fig.3 Effects of AHTN exposure on gap junction intercellular communication (GJIC) function in HaCaTNote:(a) Microscopic images of 24 h exposure (bar=100 μm),(b) Change rate of fluorescence intensity after 24 h exposure,(c) Microscopic images of 48 h exposure (bar=100 μm),(d) Change rate of fluorescence intensity after 48 h exposure;*represents P≤0.05,and **represents P≤0.01.

2.3 AHTN通過ERα介導(dǎo)的基因組途徑影響HaCaT細胞的GJIC功能

分別采用RT-qPCR和Western blot，檢測10-8mol·L-1和10-9mol·L-1AHTN暴露對ERα及其下游連接蛋白(Cx26和Cx43)表達的影響。結(jié)果表明，10-8mol·L-1AHTN暴露24 h，ERα、Cx26和Cx43的基因和蛋白水平均發(fā)生顯著性上調(diào)(圖4(a)和(c))。但暴露時間延長至48 h后，10-9mol·L-1和10-8mol·L-1AHTN暴露僅顯著上調(diào)ERα的基因和蛋白水平(圖4(b)和(d))，而Cx26和Cx43的基因和蛋白水平均發(fā)生顯著性下調(diào)(圖4(b)和(d))。陽性對照10-9mol·L-1E2暴露則始終會導(dǎo)致ERα、Cx26和Cx43基因和蛋白水平的顯著上調(diào)(圖4)。

圖4 AHTN暴露對HaCaT細胞ERα及相關(guān)Cx表達的影響注：(a)暴露24 h基因表達情況，(b)暴露48 h基因表達情況，(c)暴露24 h蛋白表達情況，(d)暴露48 h蛋白表達情況；*表示P≤0.05，**表示P≤0.01。Fig.4 Expression of ERα and related connexins in HaCaT cells after exposure to AHTNNote:(a) Gene expression after 24 h exposure,(b) Gene expression after 48 h exposure,(c) Protein expression after 24 h exposure,(d) Protein expression after 48 h exposure;*represents P≤0.05,and **represents P≤0.01.

為驗證ERα在AHTN對HaCaT細胞GJIC功能影響中的作用，加入ERα抑制劑ICIl82780重新進行SLDT實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10-8mol·L-1AHTN與抑制劑聯(lián)合暴露24 h，熒光強度較未加抑制劑組下降10%(圖5(a))；10-9mol·L-1和10-8mol·L-1AHTN與抑制劑聯(lián)合暴露48 h，熒光強度較未加抑制劑組分別降低10%和16%(圖5(b))。而抑制劑的加入會導(dǎo)致10-9mol·L-1E2的熒光強度大幅降低，24 h下降10%(圖5(a))，48 h下降18%(圖5(b))。

圖5 ERα抑制劑對HaCaT細胞GJIC功能的影響注：(a)暴露24 h，(b)暴露48 h；bar=100 μm；*表示P≤0.05，**表示P≤0.01。Fig.5 Effects of ERα inhibitor on GJIC function in HaCaTNote:(a) 24 h exposure,(b) 48 h exposure;bar=100 μm;*represents P≤0.05,and **represents P≤0.01.

2.4 AHTN通過激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路影響HaCaT細胞的GJIC功能

為探究AHTN對HaCaT細胞GJIC功能影響的其他分子機制，選取與GJIC調(diào)控相關(guān)的2條重要信號傳導(dǎo)通路，對其級聯(lián)分子進行定量分析。結(jié)果表明，10-8mol·L-1AHTN暴露24 h和48 h，以及10-9mol·L-1AHTN暴露48 h，對MAPK/ERK信號通路中級聯(lián)分子MEK和ERK的含量無顯著性影響，但均可導(dǎo)致其磷酸化水平(p-MEK和p-ERK)的顯著上調(diào)(圖6(a)和(b))。對PI3K/AKT信號通路的分析則表明，上述AHTN暴露既能導(dǎo)致級聯(lián)分子PI3K和AKT含量的增加，也會導(dǎo)致二者磷酸化水平(p-PI3K和p-AKT)的顯著上調(diào)(圖6(c)和(d))。Cx43作為2條通路下游的靶分子，其磷酸化水平(p-Cx43)在上述AHTN暴露后均發(fā)生顯著性上調(diào)(圖6)。

圖6 AHTN暴露對HaCaT細胞MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路的影響注：(a)暴露24 h對MAPK/ERK通路的檢測，(b)暴露48 h對MAPK/ERK通路的檢測，(c)暴露24 h對PI3K/AKT通路的檢測，(d)暴露48 h對PI3K/AKT通路的檢測；*表示P≤0.05，**表示P≤0.01。Fig.6 Effects of AHTN exposure on MAPK/ERK and PI3K/AKT pathways in HaCaTNote:(a) Analysis of MAPK/ERK pathway after 24 h exposure,(b) Analysis of MAPK/ERK pathway after 48 h exposure,(c) Analysis of PI3K/AKT pathway after 24 h exposure,(d) Analysis of PI3K/AKT pathway after 48 h exposure;*represents P≤0.05,and **represents P≤0.01.

3 討論(Discussion)

AHTN在中國城市人群血液的中位濃度為0.53 ng·g-1[21]，中國臺灣地區(qū)AHTN的皮膚暴露量約為5.96 μg·kg-1·d-1[34]，據(jù)此，我們推算AHTN在表皮中的暴露劑量在10-8mol·L-1數(shù)量級。本文探究了10-10～10-7mol·L-1AHTN對人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT的影響。結(jié)果表明，與許多天然激素和環(huán)境內(nèi)分泌干擾物類似[39]，AHTN表現(xiàn)出低劑量刺激、高劑量抑制細胞活性的特點(圖2)?，F(xiàn)有研究表明，AHTN對不同細胞內(nèi)分泌干擾的濃度范圍與效應(yīng)不同。10-5mol·L-1AHTN暴露可導(dǎo)致人乳腺癌MCF-7細胞增殖[27]，0.25、2.5和25 μmol·L-1AHTN暴露會引起人腎上腺皮質(zhì)癌細胞系H295R的增殖[30]。本研究使用的HaCaT細胞，與正常皮膚角質(zhì)形成細胞特性類似，可無限傳代，不具有腫瘤特性[40]。本研究結(jié)果表明環(huán)境相關(guān)濃度的AHTN暴露可導(dǎo)致HaCaT細胞活性的改變，且具有復(fù)雜的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

GJIC功能對細胞具有重要的生理作用，其功能異常會誘發(fā)癌癥，皮膚瘢痕癌的發(fā)生發(fā)展與GJIC功能的變化相關(guān)[41]。SLDT是檢測GJIC功能最常用的方法之一，具有實驗周期短、設(shè)備需求少等特點，被廣泛應(yīng)用于體外毒性研究中。在本研究中，環(huán)境相關(guān)濃度(10-8mol·L-1)AHTN暴露24 h和48 h出現(xiàn)相反的變化趨勢。為避免因誤差所致，我們進行了3次重復(fù)實驗，并分別采用熒光成像、熒光強度分析和熒光染料傳輸范圍3種不同的表征方法，均證明10-8mol·L-1AHTN暴露24 h，導(dǎo)致GJIC功能短暫性增強，暴露48 h后，GJIC功能逐漸受到抑制(圖3)。上述結(jié)果與AHTN對HaCaT細胞活性的影響趨勢(圖2)相同。與本研究結(jié)果類似，Zhang等[42]在雙酚A的研究中發(fā)現(xiàn)，暴露48 h可抑制HaCaT細胞的GJIC功能，而24 h未檢測到顯著性改變。

GJIC功能受多種因素調(diào)控。研究表明，雌激素可通過ER介導(dǎo)的基因組[37]和非基因組機制[38]調(diào)節(jié)Cx在細胞中的表達、分布和功能狀態(tài)，進而影響細胞的GJIC功能。

為探究AHTN對HaCaT細胞GJIC功能影響的分子機制，首先對10-8mol·L-1和10-9mol·L-1AHTN暴露后的ERα進行了定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERα基因和蛋白的表達均發(fā)生顯著上調(diào)(圖4)，而加入ERα抑制劑后，GJIC功能受到不同程度的抑制(圖5)，說明AHTN對HaCaT細胞GJIC功能的影響是由ERα介導(dǎo)的。對ERα介導(dǎo)基因組途徑中的下游分子(連接蛋白Cx26和Cx43)進行定量分析發(fā)現(xiàn)，10-8mol·L-1AHTN暴露48 h，二者的基因和蛋白水平均發(fā)生顯著性下調(diào)(圖4(b)和(d))，且與該濃度下GJIC功能受到抑制(圖3(b))的效應(yīng)吻合。后續(xù)可以對加入ERα抑制劑后Cx26和Cx43的表達情況進行定量分析，為AHTN通過ERα介導(dǎo)的基因組途徑影響HaCaT細胞GJIC功能提供更可靠的科學(xué)證據(jù)。

另外，Cx26和Cx43作為人角質(zhì)形成細胞間隙連接的主要成分，與GJIC功能直接相關(guān)，常被用作各類皮膚癌癥發(fā)生和發(fā)展的生物標(biāo)志物。在皮膚瘢痕癌中，Cx26的mRNA表達下調(diào)，GJIC功能減弱[43]；在黑色素瘤中，Cx26、Cx43表達下調(diào)導(dǎo)致GJIC功能減弱，誘發(fā)癌癥的發(fā)生[44]。本研究發(fā)現(xiàn)10-8mol·L-1AHTN暴露48 h，Cx26和Cx43表達下調(diào)(圖4(b)和(d))，提示AHTN暴露可能具有潛在誘發(fā)皮膚癌的風(fēng)險。雖然目前尚缺乏AHTN暴露與皮膚癌發(fā)生相關(guān)性的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，但有學(xué)者采用實驗與理論計算相結(jié)合的研究發(fā)現(xiàn)，AHTN可以作為光敏化劑，誘導(dǎo)人體氨基酸發(fā)生光敏化氧化，并且猜測其可能像其他光敏化劑一樣，導(dǎo)致生物分子損傷，引起細胞凋亡或壞死，影響信號通路，甚至誘發(fā)皮膚癌的發(fā)生[45]。

在GJIC功能調(diào)控的非基因組機制中，MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路可通過調(diào)節(jié)下游Cx的磷酸化狀態(tài)、空間結(jié)構(gòu)及降解等發(fā)揮作用。Rivedal和Opsahl[46]發(fā)現(xiàn)12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)暴露處理大鼠肝上皮細胞WB-F344，可激活ERK，提高Cx43的磷酸化水平，降低GJIC功能。Klotz等[47]發(fā)現(xiàn)維生素K3(甲萘醌)可通過激活MAPK激酶，導(dǎo)致Cx43磷酸化增加，從而降低WB-F344細胞的GJIC。Lee等[48]發(fā)現(xiàn)褪黑素可顯著增加Cx26和Cx43的表達，下調(diào)ERK的磷酸化水平，促進H2O2處理后HaCaT細胞的GJIC功能。本研究發(fā)現(xiàn)10-8mol·L-1和10-9mol·L-1AHTN暴露可上調(diào)級聯(lián)分子MEK、ERK、PI3K和AKT的磷酸化水平(圖6)，激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路，進而上調(diào)Cx43磷酸化水平，抑制GJIC功能。

綜上所述，本研究通過體外實驗，證明了環(huán)境相關(guān)濃度AHTN對人皮膚細胞活性及GJIC的影響，并對其可能的分子機制進行了分析。本研究發(fā)現(xiàn)AHTN一方面可以上調(diào)ERα的表達，通過ERα介導(dǎo)的基因組途徑，改變下游GJIC標(biāo)志物Cx26和Cx43的表達，發(fā)揮弱的類雌激素效應(yīng)；另一方面，AHTN可通過上調(diào)級聯(lián)分子MEK、ERK、PI3K和AKT的磷酸化水平，激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路，提高下游Cx43的磷酸化水平，進而導(dǎo)致HaCaT細胞的GJIC功能受到抑制(圖7)。本研究的結(jié)果將為客觀評價AHTN的生物毒性和致癌風(fēng)險提供了科學(xué)依據(jù)。

圖7 AHTN對HaCaT細胞GJIC功能可能分子機制推測Fig. 7 Putative mechanism of AHTN on GJIC function in HaCaT