鋅-2銀-0.4鎂多孔合金支架的體外生物相容性、成骨性及抗菌性能評價

王順，馮微，廖燚，夏海軍，張德華，毛峰，王健

(1.新疆克拉瑪依市中心醫(yī)院骨科中心，新疆 克拉瑪依市 834000；2.新疆克拉瑪依市中心醫(yī)院神經(jīng)內科，新疆 克拉瑪依市 834000；3.同濟大學附屬同濟醫(yī)院骨科，上海 200092)

骨科應用可吸收內植物的歷史非常悠久，最早在1 900年Payer就將金屬鎂制作為內固定器械應用于動物實驗中進行骨修復，到今已有100多年歷史，期間人們進行了大量的研究[1]。2014年，鄭玉峰教授提出了可生物降解金屬植入物的概念，也就是在活體內可以逐步降解，機體對降解產物反應和諧，材料最終完全消失，局部組織損傷得到修復[2]。

2016年，美國材料與試驗協(xié)會(American Society for Testing and Materials，ASTM)給出了ASTM-F3160標準，為可生物降解金屬植入物應滿足植入的金屬可以直接降解，或者可以通過設定好的途徑進行降解，最終被細胞或者組織完全代謝或者吸收。對體內可生物降解金屬的要求是100%的可降解性及100%的生物相容性[3-4]。主要的金屬合金有三種，包括鐵合金、鎂合金及鋅合金，鐵合金降解速度過慢，鎂合金的降解速率過快，且局部易產生氫，因此人們逐步將研究工作轉向鋅合金[5-6]。

骨組織缺損是指因創(chuàng)傷、炎癥、骨病所致的骨質短缺，超過臨界尺寸(>骨直徑1.5倍)的骨組織缺失稱為骨缺損，這種骨缺損超過自體修復的臨界狀態(tài)，常造成骨吸收、骨不連、延遲愈合或不愈合，最終導致局部功能障礙，給患者帶來巨大痛苦。目前，臨床治療骨缺損的金標準是自體骨移植[7-8]。骨移植在臨床應用中受到較多限制，常見原因有：來源有限且獲得自體骨組織時增加了患者其他部位的創(chuàng)傷、繼發(fā)感染、慢性疼痛、骨折等；同種異體骨移植臨床應用受限，是因為其具有發(fā)生傳染疾病和產生免疫排異反應的可能。因此，自體骨移植與同種異體骨移植的臨床應用均受到較多限制。隨著材料和生物科學的發(fā)展，應用骨組織工程理念發(fā)展起來的生物替代品有望實現(xiàn)骨缺損重建、修復，甚至改善骨組織功能的目的[9-10]。

本文制備了一種鋅基合金，為了提高其成骨性，加入了鎂元素，為了提高其抗菌性能，加入了銀元素，通過對其體外生物相容性、抗菌性及成骨活性的檢測，為骨組織工程驗證一種新的鋅基合金，為進一步開展骨組織工程支架的研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及儀器 本文研究所用的主要試劑包括細胞計數(shù)試劑(cell counting kit-8，CCK-8)(C0038，碧云天)盒，0.25% Trypsin-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)(25200-072，Gibco)，胎牛血清(FBS，10270106，Gibco)，α-MEM培養(yǎng)基(12571089，Gibco)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)(20012，吉諾生物)，鬼筆環(huán)肽(FITC Phalloidin)(40735ES75，YEASEN)，青-鏈霉素(BL505A，Biosharp)，多聚甲醛(80096618，國藥試劑)，TritonX-100(30188970，國藥試劑)，DAPI熒光染料(Sigma)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒(TE0007，LEAGENE)。

研究中應用的主要儀器包括生物安全柜(HFsafe-1200C，Heal Force)；CO2培養(yǎng)箱(HF 90，Heal Force)；冰箱(BCD-189Z，Haier)；熒光顯微鏡(BX53，Olmpus)；全波長酶標儀(Multiskan GO，Thermo)，多功能酶標儀(MULTISCAN GO，Thermo)，手持電動勻漿器(S-18KS，萊普特)。

1.2 鋅-2銀-0.4鎂三元合金多孔支架的制備及初篩 合金原材料的準備：純鋅、純鎂、純銀及合金材料由寧波博威合金材料股份有限公司制備，選擇99.99wt.%純鋅、99.99wt.%純鎂、99.99wt.%純銀作為合金材料；將純鋅、純鎂、純銀按照鋅-2銀-0.4鎂(wt.%)的比率稱重，混合后置于溫度為650℃的圓柱形石墨坩堝內，Ar+2%六氟化硫(SF6)保護環(huán)境下高溫熔化并攪拌10 min使之充分混勻，隨后倒入預熱至100℃的低碳鋼模具內，獲得合金鑄錠。

采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(7700 ICPMS，Agilent)測量合金中各組成的質量百分比。篩分一定尺寸的NaCl顆粒，在一定的壓力和溫度下進行燒結獲得NaCl預制體。將鑄錠置于NaCl預制體模具之上，加熱至430℃左右，待合金完全熔化后，通過壓力浸滲工藝獲得鋅合金與預制體的復合體，采用流水清洗，去除NaCl預制體獲得鋅合金多孔支架[6]。

1.3 細胞毒性測試 實驗采用小鼠顱頂前成骨細胞株(MC3T3-E1)，P/S(Gibco)。采用第3-8代細胞，培養(yǎng)箱要求含有5% CO2且溫度控制在37℃。細胞培養(yǎng)基采用α-MEM(Gibco，USA)，含10%胎牛血清(FBS，Gibco)以及100 unit P/S(Gibco)。采用噻唑藍法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)測試細胞毒性。

1.4 細胞黏附 將MC3T3-E1細胞懸液濃度稀釋至1×104/mL，樣品經(jīng)過紫外消毒后分別放入24孔板中，每孔加入1 mL細胞懸液，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h、1 d、3 d。細胞在材料表面黏附形貌分別采用Live/Dead染色法和掃描電鏡觀察。

1.5 細胞骨架染色 采用Alexa Fluor 488染料和DAPI染料分別用于細胞骨架染色和細胞核染色，激發(fā)波長分別為488 nm和340 nm。

1.6 細胞遷移 將MC3T3-E1細胞懸液濃度稀釋至5×104/mL，以2 mL/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，用20 μL槍頭在細胞層中劃出直徑約250 μm的線。吸出培養(yǎng)基，加入浸提液2 mL。再培養(yǎng)6 h、12 h、24 h并在顯微鏡下觀察細胞在劃線處的遷移情況，使用Imaje J軟件測量的面積縮小比率。

1.7 ALP表達水平 稀釋MC3T3-E1細胞懸液濃度至5×103/mL，以2 mL/孔接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)基，加誘導浸提液2 mL。每3天更換1次誘導浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3周，吸光度值/總蛋白含量即為ALP表達水平。

1.8 礦化及Ⅰ型膠原染色 礦化采用溶度為40 mmol/L茜素紅染色，pH值用氨水調整至4.2，Ⅰ型膠原表達檢測采用溶度為0.1%的天狼星紅染色。稀釋MC3T3-E1細胞懸液濃度為5×103/mL，以2 mL/孔接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)基，加誘導浸提液2 mL，之后再培養(yǎng)2周。2.5%戊二醛作用30 min，PBS試劑清洗2次進行固定。采用天狼星紅染液或者茜素紅染液染色30 min，PBS試劑清洗2次，顯微鏡下觀察。

1.9 鋅合金支架的體外抗菌性能評價 金葡菌及表葡菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，將金葡菌和表葡菌分別接種于胰豆酵母提取物培養(yǎng)基中與鋅-2銀-0.4鎂合金支架在生物反應器內共培養(yǎng)，PBS液洗脫未貼附于支架表面的細菌，將支架連同貼壁的細菌以20 kHz 超聲浴處理15 min，使貼壁的細菌與支架完全分離，并收集起來用于后續(xù)量化，以live-dead染色及細胞核計數(shù)儀測定貼附于支架表面的細菌數(shù)量及活性，并與對照組比較。

1.10 鋅合金的體外成骨誘導性能評估 鋅合金支架與成骨細胞共培養(yǎng)，采用Western-blot和逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法分別測定鋅合金組織工程支架對細胞骨相關基因和Osterix蛋白(OSX)、骨鈣素(osteocalcin，OC)的表達，在分子水平上研究鋅合金組織工程支架降解對成骨細胞增殖、分化和礦化功能的影響，探討骨響應機理。

2 結 果

2.1 細胞毒性檢測 細胞毒性檢測結果顯示鋅銀鎂合金具備較低的細胞毒性，與對照組接近(見圖1)，實驗采用的1/8浸提液進行細菌培養(yǎng)，這符合目前常見的浸提液濃度的稀釋，也符合人體內浸提液濃度的梯度選擇。

圖1 細胞毒性檢測

2.2 細胞骨架染色 用熒光標記的鬼筆環(huán)肽染色可以清晰地顯示細胞中微絲的分布，進而表達細胞的活性(見圖2)，最終的細胞計數(shù)實驗結果進一步證實了鋅銀鎂合金具備更低的毒性，因而具備更優(yōu)的細胞相容性(見圖3)。

a 對照組

圖3 細胞骨架染色結果

2.3 細胞遷移檢測 細胞遷移指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質的濃度梯度后而產生的移動。過程中細胞不斷重復著向前方伸出突足，然后牽拉胞體的循環(huán)過程。

分組細胞培養(yǎng)細胞鋪于6孔板中，貼壁24 h后，用20 μL槍頭在細胞層中劃出約250 μm寬的劃痕。24 h拍照記錄劃痕處的細胞遷移情況。使用Image J軟件打開圖片后，隨機劃取6～8條水平線，計算細胞間距離的均值。細胞劃痕24h后觀察到對照組細胞劃痕寬度恢復至35%，鋅組24%，鋅銀組27%，鋅銀鎂組33%，說明鋅銀鎂組相對于鋅組、鋅銀組細胞能力更好，進一步證實了鋅銀鎂合金具備更優(yōu)的細胞相容性(見圖4～5)。

a 對照組 b 鋅組 c 鋅銀組 d 鋅銀鎂組

圖5 劃痕試驗面積縮小百分比 圖6 ALP表達水平比較 圖7 imaje礦化面積比率

2.4 ALP表達水平檢測 對照組、鋅組、鋅銀組、鋅銀鎂組ALP表達水平比較，結果顯示ALP表達水平與成骨性密切相關，證實鋅銀鎂合金具備更優(yōu)的成骨性(見圖6) 。

2.5 茜素紅染色 Imaje J軟件測量四組礦化面積比率，顯示鋅銀鎂合金組礦化面積比率更高(見圖7)。對照組、鋅組、鋅銀組、鋅銀鎂組茜素紅染色對比，結果顯示鋅銀鎂合金的礦化性能優(yōu)異，進一步證實了鋅銀鎂合金具備更優(yōu)的成骨性能(見圖8)。

圖8 茜素紅染色結果比較(茜素紅染色，×100)

2.6 體外抗菌測試 將金黃色葡萄球菌稀釋1×105，對照組菌落總數(shù)值為1 036株，鋅組菌落總數(shù)值為8株，鋅銀組菌落總數(shù)值為14株，鋅銀鎂組菌落總數(shù)值為13株；表皮葡萄球菌稀釋1×105，對照組菌落總數(shù)值為1 010株，鋅組菌落總數(shù)值為0株，鋅銀組菌落總數(shù)值為1株，鋅銀鎂組菌落總數(shù)值為2株?？咕阅芙Y果表明三種合金具備良好的抗菌性能(見圖9～11)。

圖9 金葡菌及表葡菌抗菌水平比較

圖10 金葡菌抗菌水平比較 圖11 表葡菌抗菌水平比較

2.7 鋅合金的體外成骨誘導性能評估 成骨誘導培養(yǎng)基和金屬浸提液進行混合培養(yǎng)1～2周。OSX、OC引物在RNA水平上的表達比率隨著時間延長而增高，顯示鎂的加入提高了材料的成骨性能，提高了純鋅的細胞相容性和成骨特性(見圖12)。

a OSX b OC

3 討 論

近年來，隨著新型生物醫(yī)用材料的不斷研發(fā)以及臨床需求的不斷提高，可降解金屬材料已經(jīng)成為科研工作者研究的前沿課題。鋅及其合金良好的生物相容性、易生物降解性，展現(xiàn)了作為可降解生物醫(yī)用材料的巨大優(yōu)勢和潛力。

Vojtěch等[11]首先提出了用于骨固定的鋅合金，指出鑄態(tài)鋅-3鎂合金腐蝕性能良好，但力學性能較差。針對目前鋅合金力學性能較差的問題，本研究將銀、鎂元素添加到鋅基體中，制備鋅-2銀-0.4鎂三元合金。旨在改善鋅合金的力學性能，同時調控鋅合金的降解速率，使骨組織的生長與鋅基合金的降解相一致。此外，作為醫(yī)用植入材料中添加銀后，通過銀離子的釋放，可對植入材料和周圍環(huán)境起到消炎和避免感染的作用。

鋅銀鎂合金具有更好的體外生物相容性、成骨性以及抗菌性能[12-15]，主要原因有：鎂元素是一種人體內的必須微量元素，鎂能夠在體內降解為鎂離子。鎂離子主要貯存于骨骼中，是多種酶的輔助因子；鎂離子還能夠刺激骨折端硬骨痂的生成、誘導成骨，促進骨折愈合，并刺激軟骨生成[16-18]。在鋅鎂合金的基礎上加入少量銀元素，利用銀的廣譜抗菌性和不產生耐藥性的特點[19]，開發(fā)出具有抗菌性能的醫(yī)用鋅銀鎂合金。

綜上所述，鎂的加入提高了材料的成骨性能，銀的加入顯著提高了材料的抗菌性能，兩種元素的加入提高了純鋅的細胞相容性和成骨特性，表現(xiàn)為能促進MC3T3-E1細胞增殖、黏附、擴散和成骨。因此，鋅銀鎂合金有望成為骨科種植體的新選擇材料，特別是在骨缺損修復領域。