發(fā)酵營養(yǎng)劑NutrienFast添加時期對葡萄酒發(fā)酵的影響

陳 暉，張方方，覃先武，楊 萌，李 輝，常 煦，李志軍，聶文強(qiáng)

（安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443200）

在葡萄酒發(fā)酵過程中，營養(yǎng)管理是確保發(fā)酵順利完成的關(guān)鍵，葡萄汁中缺乏含氮物質(zhì)影響酵母合成生長代謝所需要的蛋白質(zhì)，特別是酵母可同化氮（yeast assimilable nitrogen，YAN）的缺乏，影響糖類物質(zhì)運輸和代謝，從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)生問題[1-2]。不同年份葡萄汁中的含氮物質(zhì)之間具有明顯的差異，葡萄汁中的營養(yǎng)物質(zhì)主要受到葡萄的成熟度、氣候環(huán)境、栽培管理技術(shù)、土壤條件、施肥等因素的影響[3]。葡萄汁中的含氮營養(yǎng)物質(zhì)主要包括有機(jī)氮和無機(jī)氮兩種形式，在不同品種的葡萄、不同的生長年份和不同管理措施的葡萄中有機(jī)氮和無機(jī)氮之間的比例不同。

在發(fā)酵中缺乏營養(yǎng)，酵母生長受到影響，因此出現(xiàn)發(fā)酵遲緩甚至發(fā)酵停止的風(fēng)險增加。缺乏營養(yǎng)也可能產(chǎn)生一些不良的風(fēng)味物質(zhì)，如硫化氫、乙酸等物質(zhì)，從而影響葡萄酒的香氣質(zhì)量[4-5]。葡萄汁的含糖量越高，酵母將葡萄汁中的糖全部代謝轉(zhuǎn)化成酒精所需要的營養(yǎng)物質(zhì)也越多[6-7]。影響葡萄酒發(fā)酵的主要因素為葡萄汁中YAN的含量，葡萄汁中的YAN主要包括銨離子、α-氨基酸和小肽。在發(fā)酵的早期階段，酵母迅速吸收積累這些營養(yǎng)物質(zhì)，從而滿足酵母代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)合成和生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，剩余YAN則儲存在細(xì)胞液泡中[8-9]。在實際生產(chǎn)過程中，釀酒師通常選擇不同的營養(yǎng)調(diào)整葡萄汁的營養(yǎng)含量，保證發(fā)酵的順利進(jìn)行，向葡萄汁中添加營養(yǎng)物質(zhì)不僅改善酒精發(fā)酵，還能提高葡萄酒品質(zhì)[10]。

由于全球氣候變暖，葡萄中的含糖量不斷升高，在我國新疆、寧夏等釀酒葡萄主產(chǎn)區(qū)，葡萄的含糖量到達(dá)280 g/L以上屢見不鮮，而釀造這些高糖度的葡萄汁不僅需要耐酒精度高的酵母，同時也要滿足酵母對營養(yǎng)的需求，但這些葡萄汁中的營養(yǎng)往往不能滿足酵母的代謝需求。

在含氮量不足的情況下，為了避免發(fā)酵出現(xiàn)停滯等現(xiàn)象，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整葡萄汁的營養(yǎng)成分，保證發(fā)酵順利的進(jìn)行。安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast是含有酵母制品、磷酸氫二銨以及酵母需要的微量營養(yǎng)物質(zhì)，添加100 mg/L的安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast將會增加13～14 mg/L YAN。本實驗在缺乏營養(yǎng)且含糖量在280 g/L的葡萄汁中進(jìn)行，通過在不同的發(fā)酵時期添加發(fā)酵營養(yǎng)劑NutrienFast，研究其對葡萄酒酒精發(fā)酵的影響，以期解決或預(yù)防葡萄酒的發(fā)酵停止或停滯問題，提高葡萄酒的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安琪葡萄酒酵母、安琪發(fā)酵營養(yǎng)劑NutrienFast：安琪酵母股份有限公司。

葡萄汁：赤霞珠葡萄除梗、破碎，添加30 mg/L果膠酶（商業(yè)果膠酶，按照說明書用量使用），在4 ℃條件下冷浸漬24 h，分離葡萄汁和葡萄皮渣，然后用0.8 g/L的皂土進(jìn)行下膠處理，48 h后分離上清葡萄汁，葡萄汁的糖度用葡萄糖調(diào)節(jié)至280 g/L，相對密度1 118，用酒石酸調(diào)節(jié)pH為3.6，酵母可同化氮為180 mg/L。

1.2 儀器與設(shè)備

Chromaster系列5210高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日立高新技術(shù)公司；PH-3C pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BSA3202S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HGZN-32電熱恒溫干燥箱、HPX-Ⅱ300恒溫生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；DMA35 便攜式密度計：奧地利Anton Paar（安通帕）公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄酒發(fā)酵方法

將500 mL葡萄汁裝入500 mL三角瓶中，三角瓶用U型單向閥封口，單向閥中加入1.5 mL水密封，CO2能正常溢出，同時防止氧氣進(jìn)入，模擬葡萄酒的厭氧發(fā)酵。

酵母活化：酵母的用量為250 mg/L，用10倍酵母質(zhì)量、溫度35～40 ℃、含有5%葡萄糖水溶液活化酵母20 min，活化后加入裝有500 mL葡萄汁的三角瓶中，將三角瓶置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵17 d，分別在發(fā)酵第0、1、2、3、4、6、7、8、9、10、11天添加0.4 g/L安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast。每天測定CO2的質(zhì)量損失。

發(fā)酵完成后放入4 ℃冰箱中，待酵母沉降后，分離上清液，檢測葡萄酒的相對密度、酒精度、殘?zhí)恰ＪＳ嗟慕湍赋两滴镉脼V紙分離酵母，將分離后的酵母，放入105 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱量酵母的干質(zhì)量。

1.3.2 測定方法

葡萄酒的相對密度：使用DMA35 便攜式密度計測定；葡萄酒酒精度、殘?zhí)牵喊凑誈B/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測定[11]。

CO2質(zhì)量損失：添加酵母后，用單向閥封口，稱量原始質(zhì)量，每天用分析天平稱量整個發(fā)酵體系的質(zhì)量。計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵營養(yǎng)劑NutrienFast的添加時期對酵母發(fā)酵進(jìn)程的影響

在葡萄酒生產(chǎn)中影響酵母發(fā)酵進(jìn)程的主要因素是營養(yǎng)物質(zhì)的含量和種類，其中葡萄汁中YAN的含量是影響葡萄酒發(fā)酵進(jìn)程的主要因素[12]。研究發(fā)現(xiàn)，酵母提供氮素營養(yǎng)和其他營養(yǎng)物質(zhì)能提高酵母對酒精的耐受性[13-14]，改善葡萄汁中營養(yǎng)成分對葡萄酒的香氣物質(zhì)的種類和濃度的影響[15-17]。酵母不同的生長階段對營養(yǎng)的需求不同，本研究是通過在酵母發(fā)酵不同的階段添加發(fā)酵營養(yǎng)劑NutrienFast，研究營養(yǎng)對酒精發(fā)酵代謝的影響，結(jié)果見表1。

表1 發(fā)酵營養(yǎng)劑NutrienFast添加時間對發(fā)酵結(jié)束后CO2累積質(zhì)量損失的影響Table 1 Effect of fermentation nutrient agent NutrienFast addition time on CO2 cumulative mass loss after fermentation

由表1可知，與對照（未添加營養(yǎng)）相比，在發(fā)酵不同時期添加安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast，CO2累積質(zhì)量損失均有所提高，其中在發(fā)酵第3天（糖消耗36.26%）、第4天（糖消耗44.18%）時添加安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast，CO2累積質(zhì)量損失最高，分別為129.62 g/L、128.82 g/L，說明此時添加安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast發(fā)酵最徹底；這一階段是酵母生長的穩(wěn)定期，其他研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期添加營養(yǎng)對酵母的蛋白質(zhì)合成和糖的轉(zhuǎn)運具有積極顯著的促進(jìn)效果[18]。發(fā)酵第4天后添加安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast對發(fā)酵的促進(jìn)作用減弱，在發(fā)酵第11天（糖消耗73.95%）時添加安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast，對發(fā)酵的影響最弱。

2.2 發(fā)酵營養(yǎng)劑NutrienFast添加時期對酵母生物量的影響

本研究中酵母接種量為250 mg/L，接種后的酵母活細(xì)胞數(shù)為6×106cells/mL。研究發(fā)現(xiàn)，在含有足夠營養(yǎng)的葡萄汁中，葡萄酒發(fā)酵完成后，酵母數(shù)量能達(dá)到108個細(xì)胞/mL左右，酵母生物量能達(dá)到3～5 g/L，若葡萄汁中的營養(yǎng)不足，酵母數(shù)量和酵母干質(zhì)量均受到影響[19-20]。

在不同時期添加發(fā)酵營養(yǎng)劑NutrienFast對酵母細(xì)胞干質(zhì)量的影響見圖1。由圖1可知，與對照（未添加營養(yǎng)）相比，發(fā)酵前6 d（糖消耗≤56.46%）添加營養(yǎng)都能明顯的促進(jìn)酵母的生長，發(fā)酵結(jié)束后酵母干質(zhì)量均在3.2 g/L以上，其中發(fā)酵第2～4天時添加營養(yǎng)對酵母干質(zhì)量的影響最為顯著，發(fā)酵結(jié)束后酵母干質(zhì)量分別為3.53 g/L、3.57 g/L、3.62 g/L，發(fā)酵結(jié)束后酵母干質(zhì)量的變化趨勢與酵母發(fā)酵速率和酵母累積質(zhì)量損失的趨勢一致，因此酵母的生物量的大小影響了酵母的發(fā)酵速度，不同時期添加營養(yǎng)劑對酵母的生物量和酵母的發(fā)酵速度具有不同的影響，在YAN不足的發(fā)酵中，不僅需要添加營養(yǎng)劑，還需要確定最佳的營養(yǎng)劑添加時期，才能達(dá)到最佳的應(yīng)用效果。MENDES-FERREIRA A等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，YAN通過增加酵母生物量、刺激酵母對糖的利用影響葡萄酒的發(fā)酵，添加氮素營養(yǎng)導(dǎo)致了細(xì)胞數(shù)量的增加，增加了比發(fā)酵速率，從而縮短了發(fā)酵的時間。

圖1 營養(yǎng)添加時間對發(fā)酵結(jié)束后酵母干質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of nutrition addition time on yeast dry mass after fermentation

2.3 營養(yǎng)添加時期對葡萄酒理化指標(biāo)的影響

2.3.1 營養(yǎng)添加時期對葡萄酒相對密度的影響

發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒的相對密度越低，表示葡萄酒中的殘?zhí)呛吭降停凭仍礁摺?/p>

從圖2可以看出，在發(fā)酵第3天和第4天時添加安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast葡萄酒相對密度最低，分別為991和990.5。在發(fā)酵過程中酵母的生長時期主要包括遲滯期、指數(shù)生長期，穩(wěn)定期和消亡期。在遲滯期，酵母需要適應(yīng)葡萄酒的發(fā)酵環(huán)境，然后酵母進(jìn)入指數(shù)生長期，此時酵母快速繁殖，大量的吸收葡萄汁中的營養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)酵母指數(shù)生長期結(jié)束時，對應(yīng)糖消耗大約為30%[22]，此時若葡萄汁中缺乏營養(yǎng)將導(dǎo)致發(fā)酵不完全，因此在發(fā)酵進(jìn)行到30%左右添加營養(yǎng)對發(fā)酵具有明顯的促進(jìn)作用。本研究在發(fā)酵進(jìn)行到第3天和第4天時添加營養(yǎng)，發(fā)酵完成后的相對密度最低，此時的發(fā)酵進(jìn)行到35%～45%之間，該時期添加營養(yǎng)對酵母的影響最大。

圖2 營養(yǎng)添加時間對發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒相對密度的影響Fig.2 Effect of nutrition addition time on specific gravity of wine after fermentation

2.3.2 營養(yǎng)添加時期對葡萄酒殘?zhí)呛康挠绊?/p>

圖3表示了不同時期添加營養(yǎng)對最終葡萄酒中殘?zhí)堑挠绊?，發(fā)酵第3天和第4天時添加安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast，葡萄酒殘?zhí)亲畹?，分別為3.38 g/L和3.68 g/L，均低于4 g/L，說明發(fā)酵完全，而其他時期添加營養(yǎng)均不能發(fā)酵完全，添加過早或過晚均不能使酵母很好的代謝葡萄汁中的糖。發(fā)酵進(jìn)行到30%～40%時，酵母到達(dá)穩(wěn)定期階段，在這一階段添加營養(yǎng)，一方面對發(fā)酵速度影響非常顯著，該時期添加營養(yǎng)會減少發(fā)酵時間，促進(jìn)酵母發(fā)酵速度，快速完成發(fā)酵[23]。從圖3可以看出，第3天和第4天添加營養(yǎng)的發(fā)酵中發(fā)酵完成，其他時期添加營養(yǎng)的發(fā)酵中糖均高于4 g/L，因此均未完成發(fā)酵。

圖3 營養(yǎng)添加時間對發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒殘?zhí)呛康挠绊慒ig.3 Effect of nutrition addition time on residual sugar content of wine after fermentation

2.3.3 營養(yǎng)添加時期對葡萄酒酒精度的影響

圖4顯示了不同營養(yǎng)添加時期對最終葡萄酒酒度的影響，發(fā)酵第3天和第4天時添加安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast，發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒的酒精度最高，分別為16.5%vol和16.4%vol。本實驗中葡萄汁中的糖含量為280 g/L，YAN為180 mg/L，葡萄汁中缺乏營養(yǎng)，不能完成葡萄酒的發(fā)酵，因此需要添加營養(yǎng)物質(zhì)使酒精發(fā)酵完全。研究發(fā)現(xiàn)氮素的缺乏導(dǎo)致酵母的代謝活性和生物量降低[8-9，24]，引起酵母發(fā)酵困難，從而出現(xiàn)發(fā)酵停滯的風(fēng)險，本研究中在缺乏營養(yǎng)的葡萄汁發(fā)酵的不同時期添加營養(yǎng)物質(zhì)，結(jié)果顯示，在發(fā)酵中期（35%～45%）添加營養(yǎng)，葡萄酒中的酒精度達(dá)到最高，且含糖量低于4 g/L，符合國家標(biāo)準(zhǔn)對干型葡萄酒的要求。因此推薦該時期作為補(bǔ)充營養(yǎng)的最佳時期，在缺乏營養(yǎng)的葡萄汁中通過補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)來防止發(fā)酵緩慢或停滯[25]。

圖4 營養(yǎng)添加時間對發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒酒精度的影響Fig.4 Effect of nutrition addition time on alcohol content of wine after fermentation

3 結(jié)論

本研究從CO2累積質(zhì)量損失、最終酵母干質(zhì)量，葡萄酒的理化指標(biāo)等方面評價不同時期添加安琪發(fā)酵營養(yǎng)NutrienFast對葡萄酒發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，在發(fā)酵第3天（糖消耗36.26%）、第4天（糖消耗到達(dá)44.18%）時添加營養(yǎng)對發(fā)酵的影響最大，此時CO2累積質(zhì)量損失最高，分別為129.62 g/L和128.82 g/L；酵母干質(zhì)量最高，分別為3.57 g/L、3.62 g/L；葡萄酒相對密度最低，分別為991和990.5；殘?zhí)亲畹?，分別為3.38 g/L和3.68 g/L；酒精度最高，分別為16.5%vol和16.4%vol；且酒精發(fā)酵完全（殘?zhí)欠謩e為3.38g/L和3.68 g/L，均＜4 g/L，符合國家標(biāo)準(zhǔn)對干型葡萄酒的要求，因此在發(fā)酵第3～4天（發(fā)酵進(jìn)行到35%～45%之間）添加營養(yǎng)物質(zhì)可有效解決或者預(yù)防葡萄酒的發(fā)酵停止或停滯的問題，使發(fā)酵完全達(dá)到國家對干型葡萄酒的要求。本研究中還缺乏添加營養(yǎng)對葡萄酒香氣的影響，需要在后期進(jìn)行深入的研究。