高產(chǎn)四甲基吡嗪微生物的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

郭春生，楊 舟，喬月梅，楊 婧，趙永紅，李林達，李力群*

（1.內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，是醬香型白酒中重要的香氣成分，具有發(fā)酵、烘烤、可可等氣味[1-3]，其作為川穹的有效藥用成分，在治愈呼吸系統(tǒng)疾病、缺血性血管疾病、腎小球疾病等臨床疾病上有顯著的效果，同時作為香料廣泛應用于食品調(diào)香中[4-9]。目前，四甲基吡嗪的合成方法有直接提取法、化學合成法和微生物發(fā)酵法[10]。與其他方法相比，微生物發(fā)酵法產(chǎn)生四甲基吡嗪具有原料廣泛、反應條件溫和、對環(huán)境污染小等優(yōu)點。雖然價格昂貴，但消費者更傾向于這種天然的四甲基吡嗪[11]。

微生物以淀粉質(zhì)原料為底物生成乙偶姻，在發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)被分解成氨基酸，氨基酸在谷氨酸脫氫酶作用下生成氨，乙偶姻和氨在高溫條件下生成四甲基吡嗪[12-14]。目前，產(chǎn)生四甲基吡嗪的菌種有芽孢桿菌（Bacillus）[15]、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）[16]和醋酸桿菌（Acetobacter aceti）[17]等。其中，以芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵相關研究最多，但微生物發(fā)酵法產(chǎn)四甲基吡嗪存在產(chǎn)量低的問題。有研究表明，通過誘變處理[18]、基因工程手段[19]及發(fā)酵過程優(yōu)化[20]的方式均能進一步提高四甲基吡嗪的產(chǎn)量，但是作為應用于食品的風味物質(zhì)，通過基因工程的方式獲得高產(chǎn)四甲基吡嗪菌的應用還存在爭議。因此，篩選高產(chǎn)四甲基吡嗪的天然菌株具有重要的意義。

有研究表明，芽孢桿菌為產(chǎn)四甲基吡嗪的主要菌株，且在高溫大曲中含有大量的芽孢桿菌屬微生物[21]?；诖耍狙芯恳愿邷卮笄鸀椴牧?，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分離篩選高產(chǎn)四甲基吡嗪的芽孢桿菌菌株，通過分子生物學技術對其進行菌種鑒定，并通過單因素試驗和響應面試驗對其產(chǎn)四甲基吡嗪的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，以期為進一步提高四甲基吡嗪的生產(chǎn)提供菌種來源，并為其應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

高溫大曲：2019年7月采集自內(nèi)蒙古某濃香型白酒企業(yè)，分別取五塊大曲粉碎后混勻作為實驗樣品，室溫保存。

1.1.2 試劑

葡萄糖、磷酸氫二銨、氯化鈉（均為分析純）：天津市智遠化學試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母提取粉、瓊脂（均為生化試劑）：廣東桓凱微生物科技有限公司；甲醇、三氟乙酸（均為色譜純）：天津市廣大化學試劑有限公司；四甲基吡嗪（色譜純）、乙偶姻（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；細菌基因組提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固態(tài)培養(yǎng)基[22]：NaCL 10.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取粉5.0 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[23]：胰蛋白胨30.0 g/L、磷酸氫二銨30.0 g/L、酵母提取粉10.0 g/L、葡萄糖50.0 g/L，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

HCB-1300V潔凈工作臺、THZ-98C恒溫振蕩器、DHG-9053A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；SX-500全自動高壓滅菌鍋：上海新普儀器設備有限公司；GM-2真空抽濾系統(tǒng)：天津津騰實驗設備有限公司；3-18KS高速離心機：上海成貫儀器有限公司；U3000高效液相色譜儀、Veriti96聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：上海賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌菌株的分離及純化

稱研磨后的高溫大曲10.0 g，加90 mL無菌生理鹽水于三角瓶中，在37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)1 h，于80 ℃條件下水浴30 min[21]。將菌懸液稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于LB固體培養(yǎng)基上進行純化，將純化后的菌株4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 產(chǎn)四甲基吡嗪菌株的篩選

挑取分離得到的單菌落接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結束后將發(fā)酵液用體積分數(shù)70%的甲醇稀釋并提取，10 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm有機濾膜后，采用HPLC法對上清液中四甲基吡嗪含量進行檢測。

1.3.3 分析檢測

四甲基吡嗪含量的測定：采用高效液相色譜法[24]。

殘?zhí)呛康臏y定：采用3,5-二硝基水楊酸比色法[8]。

乙偶姻含量的測定：采用高效液相色譜法[25]。

OD600nm值的測定：以蒸餾水為空白對照，在波長600 nm處測定發(fā)酵液的吸光度值，用OD600nm值表示菌體量。

1.3.4 產(chǎn)四甲基吡嗪菌株的分子生物學鑒定

利用細菌基因組提取試劑盒提取產(chǎn)TTMP菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用細菌通用引物1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）和27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）對菌株的16S rDNA基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系（25 μL）：引物1492R和27F各1.0 μL，Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，雙蒸水（ddH2O）9.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增結束后，取1 μLPCR擴增產(chǎn)物，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后委托測序生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）對測序結果進行同源檢索，選取同源性高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA10.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，對菌株進行菌種鑒定。

1.3.5 菌株產(chǎn)四甲基吡嗪發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

固定初始發(fā)酵條件為初始pH值7.0、接種量5%、發(fā)酵溫度37 ℃、裝液量20%、轉(zhuǎn)速180 r/min、無銨鹽添加、發(fā)酵時間10 d。結合文獻[26-28]，采用單因素輪換法依次考察初始pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、發(fā)酵溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）和銨鹽（磷酸氫二銨）添加量（20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L，在發(fā)酵第6天時添加）對四甲基吡嗪、乙偶姻、殘?zhí)呛考癘D600nm值的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗結果基礎上，以發(fā)酵溫度（A）、初始pH值（B）、銨鹽添加量（C）為自變量，四甲基吡嗪含量（Y）為響應值，采用Box-Behnken 試驗設計，響應面試驗因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)利用Microsoft office Excel 2016進行統(tǒng)計分析，利用Origin 2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)四甲基吡嗪菌株的分離及篩選

從高溫大曲中共分離獲得103株疑似芽孢桿菌，利用HPLC法測定各菌株發(fā)酵上清液中的四甲基吡嗪含量，結果發(fā)現(xiàn)其中59株菌可以以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)四甲基吡嗪，結果見表2。由表2可知，菌株1-13的四甲基吡嗪含量最高，為112.26 mg/L，因此確定其為后續(xù)的試驗菌株。

表2 篩選菌株發(fā)酵液中四甲基吡嗪含量的檢測結果Table 2 Determination results of tetramethylpyrazine contents in fermentation broth of screening strains

2.2 菌株1-13的分子生物學鑒定

基于16S rDNA基因序列，構建菌株1-13的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖1。由圖1可知，菌株1-13與解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）聚于一支，親緣關系最近。因此，將菌株1-13鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。

圖1 基于16S rDNA基因序列菌株1-13的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain 1-13 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株1-13產(chǎn)四甲基吡嗪發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 初始pH值對菌株1-13產(chǎn)四甲基吡嗪的影響

pH在發(fā)酵過程中影響著微生物的生長及四甲基吡嗪的含量，初始pH值對菌株1-13產(chǎn)四甲基吡嗪的影響見圖2。由圖2可知，隨著初始pH值的升高，四甲基吡嗪及乙偶姻產(chǎn)量整體呈先升高后下降的趨勢，當初始pH值為7.0時，四甲基吡嗪及乙偶姻產(chǎn)量均達到最高，分別為125.48 mg/L、854.12 mg/L。菌株1-13的OD600nm值受初始pH值的影響較小。當初始pH值為8.0時，發(fā)酵液中的殘?zhí)呛枯^高，這可能是因為較為極端的pH影響菌株1-13糖代謝所致。結果表明，中性條件下，乙偶姻與銨離子反應生成四甲基吡嗪的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量最高。ZHU B等[26]研究發(fā)現(xiàn)，當pH值為5.5時枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵獲得最大乙偶姻積累量，再調(diào)節(jié)pH值至7.0時，實現(xiàn)了乙偶姻向四甲基吡嗪的含量的轉(zhuǎn)化，與本研究結果略有不同，分析原因可能是不同微生物代謝產(chǎn)生四甲基吡嗪的最適生長pH不同。因此，確定最優(yōu)初始pH值為7.0。

圖2 初始pH值對菌株1-13發(fā)酵產(chǎn)四甲基吡嗪的影響Fig.2 Effect of initial pH on tetramethylpyrazines produced by strain 1-13 fermentation

2.3.2 發(fā)酵溫度對菌株1-13產(chǎn)四甲基吡嗪的影響

發(fā)酵溫度對菌株1-13產(chǎn)四甲基吡嗪的影響見圖3。由圖3可知，四甲基吡嗪及乙偶姻產(chǎn)量均隨著發(fā)酵溫度的升高呈先升高后下降的趨勢，OD600nm值呈下降的趨勢，殘?zhí)橇砍氏壬吆笙陆刀笊仙内厔?。當發(fā)酵溫度為40 ℃時，四甲基吡嗪及乙偶姻含量均達到最大值，分別為132.06 mg/L、794.12 mg/L，OD600nm值為1.74，殘?zhí)橇繛?.63 g/L。有研究表明，從乙偶姻到四甲基吡嗪的反應是自發(fā)的非酶催化反應，高溫有利于乙偶姻和氨生成四甲基吡嗪。因此，利用溫度二階段調(diào)控能夠有效提高四甲基吡嗪的產(chǎn)量[27]。綜上，確定最優(yōu)的發(fā)酵溫度為40 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對菌株1-13發(fā)酵產(chǎn)四甲基吡嗪的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on tetramethylpyrazines produced by strain 1-13 fermentation

2.3.3 銨鹽添加量對菌株1-13產(chǎn)四甲基吡嗪的影響

研究表明添加銨鹽對四甲基吡嗪生成速率和產(chǎn)量有重要影響[27]。經(jīng)預試驗發(fā)現(xiàn)菌株1-13在發(fā)酵第6天時乙偶姻的含量最高，因此，選擇在發(fā)酵第6天時添加銨鹽。銨鹽添加量對菌株1-13產(chǎn)四甲基吡嗪的影響見圖4。

圖4 銨鹽對菌株1-13發(fā)酵產(chǎn)四甲基吡嗪的影響Fig.4 Effect of ammonium salt on tetramethylpyrazines produced by strain 1-13 fermentation

由圖4可知，隨著銨鹽添加量的增加，四甲基吡嗪及乙偶姻產(chǎn)量均呈先增加后減少的趨勢。當銨鹽添加量為50.0g/L時，四甲基吡嗪含量達到最大值為155.08 mg/L。當銨鹽添加量為40g/L時，乙偶姻含量達到最大值為548.92 mg/L。分析原因可能是，當銨鹽添加量為20～40 g/L時，磷酸氫二銨作為緩沖溶液，使得發(fā)酵液的pH值趨于穩(wěn)定，負責合成乙偶姻的乙酰乳酸合成酶被激活，乙偶姻的含量增加。當銨鹽添加量＞50.0 g/L之后，四甲基吡嗪產(chǎn)量不再增加，這是因為前體物質(zhì)乙偶姻含量不足以支持四甲基吡嗪合成。OD600nm值隨著銨鹽添加量的增加而減少，殘?zhí)橇侩S著銨鹽添加量的增加而增加，原因可能是高濃度的銨鹽抑制了細胞的生長代謝[28]。綜上，確定最優(yōu)的銨鹽添加量為50 g/L。

2.4 菌株1-13產(chǎn)四甲基吡嗪發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

2.4.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗結果基礎上，以影響菌株1-13發(fā)酵產(chǎn)四甲基吡嗪含量最主要的三個因素發(fā)酵溫度（A）、初始pH值（B）、銨鹽添加量（C）為響應變量，四甲基吡嗪含量（Y）為響應值，采用Box-Behnken設計進行響應面試驗，試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 回歸模型的方差分析結果Table 4 Results of variance analysis of the regression model

續(xù)表

采用Design-ExpertV8.0.6軟件對表3試驗結果進行多元回歸擬合分析，得到四甲基吡嗪含量對各因素的二次回歸方程：Y=167.39-12.64A+12.53B+0.99C+8.83AB-0.89AC-4.89BC-38.85A2-64.26B2-28.87C2。

由表4可知，該模型的P＜0.01，極顯著，失擬項P=0.081 2＞0.05，不顯著，表明模型可較好地擬合試驗情況。決定系數(shù)R2=0.981 6，擬合性良好，說明98.16%的四甲基吡嗪產(chǎn)量變化可以用此回歸模型解釋，可較好反映出四甲基吡嗪與發(fā)酵溫度、初始pH值、銨鹽添加量之間的關系。調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.958 0，說明四甲基吡嗪產(chǎn)量有95.80%受試驗因素影響。綜上所述，以四甲基吡嗪為響應值建立的四甲基吡嗪最佳發(fā)酵工藝模型，可對四甲基吡嗪產(chǎn)量進行分析和預測。由表中P值可知，初始pH值和發(fā)酵溫度對四甲基吡嗪產(chǎn)量的影響極顯著（P＜0.01），銨鹽添加量對四甲基吡嗪產(chǎn)量的影響不顯著（P＞0.05），二次項對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項對結果影響不顯著（P＞0.05）；由F值可知，各因素對四甲基吡嗪產(chǎn)量的影響程度為A＞B＞C，即發(fā)酵溫度＞初始pH值＞銨鹽添加量。

2.4.2 響應面交互效應分析

根據(jù)回歸方程繪制響應面和等高線，發(fā)酵溫度、初始pH值、銨鹽添加量的兩兩交互作用對四甲基吡嗪產(chǎn)量的影響見圖5。

圖5 各因素間交互作用對菌株1-13產(chǎn)四甲基吡嗪影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of interaction between each factor on tetramethylpyrazine production by strain 1-13 fermentation

由圖5可知，響應面開口向下，等高線為橢圓形，表明各因素間有交互作用，但交互作用不顯著，與方差分析結果一致。

2.4.3 響應面驗證試驗

根據(jù)試驗結果和模型分析，得到菌株1-13發(fā)酵產(chǎn)四甲基吡嗪的最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度39.23 ℃、初始pH值7.04、銨鹽添加量50.12 g/L（發(fā)酵第6天時添加）。在此條件下四甲基吡嗪產(chǎn)量預測值為168.90 mg/L。為了便于實際操作，將發(fā)酵條件調(diào)整為發(fā)酵溫度39.0 ℃、初始pH值7.0、銨鹽添加量50.0 g/L（發(fā)酵第6天時添加），在此條件下發(fā)酵10 d，四甲基吡嗪產(chǎn)量實際值為（166.19±2.79）mg/L，與理論值偏差為1.60%，說明此模型能夠用于本研究中，四甲基吡嗪產(chǎn)量比優(yōu)化前提高48%。

3 結論

本研究以高溫大曲為試驗樣品，篩選獲得以葡萄糖為發(fā)酵底物高產(chǎn)四甲基吡嗪的菌株1-13，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。通過單因素試驗及響應面試驗優(yōu)化確定其產(chǎn)四甲基吡嗪的最優(yōu)發(fā)酵工藝為初始pH值7.0、發(fā)酵溫度39.0 ℃、接種量5.0%、裝液量20.0%、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、銨鹽添加量50.0 g/L（發(fā)酵第6天時添加），在此優(yōu)化條件下，四甲基吡嗪產(chǎn)量可達（166.19±2.79）mg/L，較優(yōu)化前提高48%。此研究為解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)四甲基吡嗪的應用提供理論基礎，促進微生物產(chǎn)四甲基吡嗪生產(chǎn)實現(xiàn)工業(yè)化應用。