中國(guó)白酒健康功能成分吡嗪類化合物研究進(jìn)展

丁海龍，沈小娟，宋 川，熊燕飛*，鄧 波，敖 靈，曾 珊，李 嘉，俞 佳

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；2.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000）

白酒是我國(guó)具有悠久歷史的傳統(tǒng)蒸餾酒，是中華民族智慧的結(jié)晶。和其他蒸餾酒相比，中國(guó)白酒的風(fēng)味物質(zhì)和生物活性成分含量異常豐富。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止2018年，白酒風(fēng)味數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物已多達(dá)1 874種[1]，這些豐富的風(fēng)味成分中蘊(yùn)含了諸多的功能因子或生理活性物質(zhì)，如吡嗪類化合物、芳香族化合物、萜烯類化合物等，能夠起到緩解酒精傷害、提升人體防御機(jī)能、調(diào)節(jié)生理節(jié)奏，以及預(yù)防疾病、促進(jìn)康復(fù)等功能[1-3]。

吡嗪類化合物廣泛存在于自然中，也是在各類香型白酒中均有檢出的一類微量健康成分[4-6]，具有特殊香氣和獨(dú)特健康功能。吡嗪類化合物是中國(guó)白酒風(fēng)味相關(guān)的重要化合物，它的香味閾值低，對(duì)白酒的風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)，同時(shí)也是一種有益人體健康的物質(zhì)，長(zhǎng)期以來受到了研究者的極大關(guān)注。本文就中國(guó)白酒的微量健康成分吡嗪類化合物研究現(xiàn)狀進(jìn)行分析，以期為科學(xué)認(rèn)識(shí)中國(guó)白酒中的生物活性成分健康功能提供參考。

1 吡嗪類化合物介紹

1.1 吡嗪類化合物及功能

吡嗪類化合物是指苯環(huán)的1,4位含兩個(gè)氮原子的六元雜環(huán)化合物，廣泛存在于自然界和發(fā)酵食品中，具有類似于炒堅(jiān)果、烤肉的怡人香氣，以及易揮發(fā)、香勢(shì)強(qiáng)、閾值低等特點(diǎn)，并以多樣的生理活性和健康功能而受到廣泛關(guān)注和重視[7-8]。許多天然食品中或食品在煮、炒、發(fā)酵過程中都能檢測(cè)出吡嗪類化合物。到目前，已累計(jì)發(fā)現(xiàn)120余種吡嗪類化合物，其中2-甲基吡嗪等34種吡嗪類化合物在我國(guó)已被應(yīng)用于食品添加劑[9]，2,5-二甲基吡嗪等6種吡嗪類化合物已制定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[10]，甲基吡嗪等5種吡嗪類化合物已制定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.2 吡嗪類化合物的應(yīng)用

吡嗪類化合物目前已廣泛應(yīng)用于香料、藥物和食品添加劑行業(yè)。由于吡嗪類化合物具有特殊香氣，從20世紀(jì)60年代開始，學(xué)者對(duì)吡嗪類化合物的合成和應(yīng)用進(jìn)行了大量研究，2,3-二甲基吡嗪等多種吡嗪類化合物應(yīng)用于香料，并成為香料中的重要系列[12]；多種吡嗪類化合物應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，如天然活性成分四甲基吡嗪及其衍生物可捕捉超氧陰離子，并減少人體粒細(xì)胞的氮氧化物產(chǎn)生，具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值[13]。2,5-二甲基吡嗪是合成阿西莫司等新型藥物的重要中間體2-甲基-5-吡嗪甲酸的重要原料[14]，用于治療糖尿病、高脂血癥和結(jié)核??；此外，吡嗪類化合物及衍生物在農(nóng)藥、電子和高分子材料中也具有重要應(yīng)用價(jià)值。

1.3 吡嗪類化合物的制備

吡嗪類化合物的制備方法有直接提取法、化學(xué)合成法以及生物發(fā)酵法3種方式[15-17]。直接提取法是指在自然原料中提取。1976年，北京制藥工業(yè)研究所成功在川芎中提取川芎嗪?jiǎn)误w[16]，但因產(chǎn)量得率較低無法適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；化學(xué)合成法是吡嗪類化合物工業(yè)化生產(chǎn)主要方式，常用方法是利用相應(yīng)的羰基、氨基化合物縮合為吡嗪環(huán)，再通過環(huán)上及側(cè)鏈取代基上的反應(yīng)來制取目標(biāo)化合物，具有收率高、成本低廉、可大規(guī)模制備的特點(diǎn)，但存在一定原料短缺和環(huán)境污染問題；生物發(fā)酵法是指以糖和氨為培養(yǎng)基通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物[17]，因其原料來源豐富、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品綠色天然等諸多優(yōu)勢(shì)，使其成為當(dāng)前關(guān)注的熱點(diǎn)。其中，桿菌屬能在發(fā)酵過程中生產(chǎn)四甲基吡嗪，被認(rèn)為是一類良好的吡嗪生產(chǎn)菌株。但由于微生物發(fā)酵產(chǎn)生的中間體乙偶姻量少、乙偶姻向四甲基吡嗪轉(zhuǎn)化率低，造成目標(biāo)產(chǎn)物在微生物的發(fā)酵液中含量較低，且分離提純存在一定難度。因此，綜合利用生物工程技術(shù)、發(fā)酵工程技術(shù)以及外加前驅(qū)物質(zhì)等方式，以大幅度提高發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物受到廣泛關(guān)注，并有著廣闊應(yīng)用前景。

2 中國(guó)白酒中的吡嗪類化合物

2.1 白酒中吡嗪類化合物及功能

吡嗪類化合物普遍存在于白酒中[18-19]，是白酒中的主要含氮化合物，對(duì)白酒風(fēng)味和健康有重要貢獻(xiàn)。目前，中國(guó)白酒中已檢測(cè)出吡嗪類化合物29種[2，20-21]，以烷基吡嗪類為主，主要包括四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等。FAN W L等[6]對(duì)12種白酒樣品的吡嗪類化合物進(jìn)行了檢測(cè)，研究結(jié)果表明，醬香型和濃醬兼香型白酒中吡嗪類化合物種類和含量較高，約為3 000～6 000 μg/L，含量較高的吡嗪類物質(zhì)主要集中于2-乙基-6-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪等。濃香型白酒次之，其含量約為500～1 500 μg/L，個(gè)別濃香型白酒的吡嗪類化合物總量也能達(dá)到醬香型白酒的水平。吡嗪類化合物在其他香型白酒也有檢出。

2.2 白酒中四甲基吡嗪及功能

四甲基吡嗪（2,3,5,6-tetramethylpyrazine，TMP）又稱為川芎嗪，是一種重要的吡嗪類化合物。TMP天然存在于中藥材川穹根莖以及大豆、咖啡和乳制品中，目前作為常見的呈堅(jiān)果味和烤面包口味的食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品、飲料、肉制品及乳制品等食品工業(yè)中[22]。除應(yīng)用于食品工業(yè)外，TMP還是一種重要的治療心腦血管疾病臨床藥物成分，具有擴(kuò)張血管、促進(jìn)血循環(huán)、改善酒精對(duì)胃黏膜和肝臟的損傷等功能[23-24]，是中藥“速效救心丸”和西藥“川芎嗪注射液”的主要成分[25]。

在所有蒸餾酒中，四甲基吡嗪是中國(guó)白酒特有的功能性成分，近年來因其特殊的風(fēng)味及明確的生物活性作用在白酒健康領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。TMP在濃香型、醬香型、清香型、芝麻香型、藥香型、兼香型、老白干香型等各類香型白酒中均有檢出，質(zhì)量濃度范圍在500～6 000 μg/L之間。TMP在白酒中具有較低的風(fēng)味閾值，不同酒精含量下香味識(shí)別閾值為372.11～743.39 μg/L[26]，對(duì)酒體貢獻(xiàn)甜香、堅(jiān)果香及花香，能對(duì)其他香味物質(zhì)起到明顯的烘托疊加作用，豐滿白酒的香氣。TMP對(duì)白酒風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)的同時(shí)，也賦予了中國(guó)白酒有益健康的功能，楊濤等[27]經(jīng)動(dòng)物模型試驗(yàn)研究后認(rèn)為TMP具有保肝、護(hù)肝等功效，為“適量飲酒，有益健康”提供了依據(jù)。

3 白酒中吡嗪類化合物的分析檢測(cè)

作為白酒中一類重要功能物質(zhì)，早在1989年，陸懋蓀等[28]開始利用陽離子樹脂富集白酒中的含氮化合物，為我國(guó)白酒中吡嗪類化合物分析檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。目前，針對(duì)白酒中吡嗪類化合物檢測(cè)方法的研究逐漸增多，氣相色譜（gas chromatography，GC）技術(shù)、液相色譜（liquid chromatography，LC）技術(shù)及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-massspectrometry，GC-MS）技術(shù)均應(yīng)用于該領(lǐng)域中。

3.1 氣相色譜法

氣相色譜法因具有分析靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，成為目前應(yīng)用最廣泛的分離檢測(cè)技術(shù)，而研究者對(duì)白酒中吡嗪類化合物的分析檢測(cè)，多是直接進(jìn)樣或是采用液-液萃取、頂空固相微萃取等前處理技術(shù)，結(jié)合氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜分析進(jìn)行。氣相色譜法檢測(cè)白酒中吡嗪類化合物的研究進(jìn)展見表1。

表1 氣相色譜法檢測(cè)白酒中吡嗪類化合物研究進(jìn)展Table 1 Research progress in determination of pyrazines in Baijiu by gas chromatography

續(xù)表

3.2 液相色譜法

相對(duì)于氣相色譜樣品的前處理過程繁瑣、重復(fù)性相對(duì)較差，液相色譜因不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，從而在吡嗪類化合物的分析測(cè)定中也有諸多應(yīng)用。液相色譜法檢測(cè)白酒中吡嗪類化合物的研究進(jìn)展見表2。

表2 液相色譜法檢測(cè)白酒中吡嗪類化合物研究進(jìn)展Table 2 Research progress in determination of pyrazines in Baijiu by liquid chromatography

4 白酒中吡嗪類化合物的生成途徑

研究認(rèn)為，白酒中吡嗪類化合物主要來源于發(fā)酵過程中的微生物代謝，這體現(xiàn)了功能微生物在白酒釀造中的重要作用和研究?jī)r(jià)值，部分研究者認(rèn)為美拉德反應(yīng)也是生成途徑之一。

4.1 白酒的吡嗪類化合物的微生物合成途徑

研究證實(shí)，中國(guó)白酒中吡嗪類化合物產(chǎn)生的主要途徑來源于微生物的代謝反應(yīng)。1962年，KOSUGE T等[37]第一次報(bào)道了枯草芽孢桿菌具有生物合成TMP的能力，并提出生物發(fā)酵液中TMP是由芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙偶姻與氨基酸反應(yīng)生成。此后微生物發(fā)酵法合成TMP的文獻(xiàn)報(bào)道逐漸增多。徐巖等[38]對(duì)白酒中TMP的來源及產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，驗(yàn)證了TMP產(chǎn)生的主要途徑來源于微生物的代謝反應(yīng)。侯孝元等[17]證實(shí)代謝反應(yīng)第一階段是微生物發(fā)酵酶促反應(yīng)產(chǎn)生前體乙偶姻，第二階段由乙偶姻與銨離子自發(fā)的熱力學(xué)反應(yīng)生成TMP，這一理論目前已得到學(xué)術(shù)界的普遍接受。

4.2 白酒中吡嗪類化合物的其他生成途徑

吡嗪是許多食品的風(fēng)味物質(zhì)，炒堅(jiān)果、咖啡、可可豆中吡嗪的形成大多通過非酶褐變中的美拉德反應(yīng)產(chǎn)生。因此，除微生物生成途徑外，部分研究者認(rèn)白酒釀造過程美拉德反應(yīng)途徑也會(huì)生成吡嗪類化合物。吳建峰[39]認(rèn)為，在白酒制曲過程和釀酒堆積發(fā)酵過程均會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生的TMP經(jīng)蒸餾帶入酒中。余曉等[21]認(rèn)為吡嗪類化合物的生成與美拉德反應(yīng)有密切關(guān)系，其含量與高溫制曲工藝密切相關(guān)。

5 白酒中吡嗪類化合物提升思路

吡嗪類化合物作為白酒中重要風(fēng)味物質(zhì)和健康功能成分，如何有效提升其在白酒中的含量受到廣泛關(guān)注。近年來，優(yōu)良菌株選育以及基于培養(yǎng)基、發(fā)酵過程優(yōu)化的發(fā)酵工程技術(shù)應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)，為吡嗪類化合物含量提升帶來了全新思路。

5.1 高產(chǎn)菌種選育

目前針對(duì)白酒中吡嗪類化合物的含量提升研究大多集中在高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株的篩選上，篩選的菌株大多為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。沈毅等[40]篩選出兩株高產(chǎn)吡嗪類的地衣芽孢桿菌L8、枯草芽孢桿菌L17并應(yīng)用于大曲生產(chǎn)，所得半成品曲坯中吡嗪類物質(zhì)含量是空白組的3.85倍。王霜等[41]在兼香型白酒酒醅中篩選出兩株菌株，具有代謝產(chǎn)生TMP前體物質(zhì)乙偶姻的能力。趙德義等[42]對(duì)高產(chǎn)TMP的菌株篩選獲得1株枯草芽孢桿菌功能菌株，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后TMP產(chǎn)量達(dá)11.42 g/L；葛向陽等[43]使用強(qiáng)化高產(chǎn)四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌的大曲，可以使?jié)庀阈驮浦蠺MP含量提高到3～6 mg/L，較傳統(tǒng)濃香型白酒提高了5～20倍；研究證實(shí)，酵母菌在厭氧環(huán)境中具有合成前體物質(zhì)乙偶姻的能力。MENG W等[44]通過分子育種手段選育了2,3-丁二醇脫氫酶基因破壞的地衣芽孢桿菌BLA菌株，TMP和乙偶姻的最大產(chǎn)量分別增加了18.16%和17.87%，這對(duì)利用分子育種技術(shù)提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量具有重要指導(dǎo)借鑒意義。

5.2 發(fā)酵工程技術(shù)

根據(jù)四甲基吡嗪微生物發(fā)酵的合成機(jī)理，代謝反應(yīng)第二階段是由乙偶姻與銨離子在熱動(dòng)力學(xué)作用下進(jìn)行。XIAO Z J等[45]利用兩步溫度控制策略在該階段升高反應(yīng)溫度至65～95 ℃，得到TMP含量為8.34 g/L的發(fā)酵液。徐巖等[38]采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分、添加前體物質(zhì)、調(diào)控發(fā)酵條件等發(fā)酵工程技術(shù)，對(duì)篩選的高產(chǎn)菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，明顯提高了白酒中TMP的含量，在釀酒企業(yè)轉(zhuǎn)化應(yīng)用取得了良好的效果。

6 結(jié)語

隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，前沿技術(shù)在白酒風(fēng)味成分的研究得到充分應(yīng)用，白酒中吡嗪類化合物不斷被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)，其活性成分種類、生成機(jī)理、健康功效的面紗逐步揭開，這對(duì)于客觀科學(xué)地認(rèn)識(shí)中國(guó)白酒中的生物活性成分的健康功效，促進(jìn)中國(guó)白酒的科學(xué)發(fā)展、可持續(xù)發(fā)展起到了重要作用。然而，白酒中吡嗪類化合物尤其是TMP總體含量偏低，如何綜合利用微生物選育技術(shù)、發(fā)酵工程技術(shù)進(jìn)一步有效提升酒體中TMP產(chǎn)量需要深入研究；同時(shí)，吡嗪類化合物僅是白酒中含量豐富的功能性成分的很小部分，中國(guó)白酒中諸如有機(jī)酸類、不飽和脂肪酸類、雜環(huán)類化合物和酚類化合物等有益健康的成分，以及多種成分之間的協(xié)同效用和互作機(jī)理，值得進(jìn)一步研究和發(fā)掘。