糖基化改性對(duì)英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽抗氧化活性的影響

趙玉濱， 穆秋霞， 董憲慧， 鄭喜群，王 坤， 崔素萍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319) (國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319) (糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心3，大慶 163319)

抗氧化肽是一類生物體內(nèi)源或由動(dòng)植物蛋白質(zhì)水解后生成的，具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化作用的活性寡肽或多肽。抗氧化肽作為一種天然抗氧化劑，其結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，具有易吸收、穩(wěn)定性好、無免疫反應(yīng)性等優(yōu)點(diǎn)，在食品和醫(yī)療保健品領(lǐng)域備受關(guān)注[1]，可作為食品添加劑減緩食品在儲(chǔ)藏過程中的氧化反應(yīng)[2]。喬曉林等[3]通過酶解小麥面筋蛋白，利用超濾膜對(duì)小麥面筋蛋白酶解物進(jìn)一步分離、純化，獲得了具有很強(qiáng)的體外抗氧化活性多肽組分。

目前，抗氧化肽的抗氧化活性仍然遠(yuǎn)不如人工合成的抗氧化劑活性高，因此，提高天然抗氧化肽活性的改性方法是目前的研究熱點(diǎn)之一[4]。常用的改性方法有化學(xué)改性、酶法改性和基因工程改性等。化學(xué)改性方法包括糖基化、磷酸化、?；?、脫酰胺、共價(jià)交聯(lián)、水解及氧化等法；其中糖基化改性是一種非酶促褐變反應(yīng)，是基于美拉德反應(yīng)機(jī)理的羰氨縮合反應(yīng)，該過程不需任何化學(xué)催化劑參與即可完成[5]，糖基化改性有助于增加抗氧化能力和抗菌能力等[6]?？寡趸耐ㄟ^糖基化改性后抗氧化活性會(huì)得到大幅提升，這些研究使人們對(duì)抗氧化肽的生物活性有了新的認(rèn)識(shí)。研究表明，糖基化改性不但可以有效提高天然蛋白質(zhì)及肽的抗氧化活性，而且具有低毒、高效等優(yōu)點(diǎn)[7]。林巍等[8]利用 3 種糖與紫花蕓豆肽發(fā)生糖基化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物的 ATBS 自由基清除率及 DPPH 自由基清除率也顯著增加。但目前有關(guān)糖基化改性反應(yīng)溫度過高(高于 100 ℃)，易生成有害物質(zhì)，杜卿卿等[9]利用木糖和半胱氨酸在 110 ℃ 下發(fā)生糖基化反應(yīng)，產(chǎn)物中含有呋喃、雜環(huán)胺等有害物質(zhì)。邵艷紅[10]在對(duì)牛血清蛋白進(jìn)行糖基化改性時(shí)也發(fā)現(xiàn)改性產(chǎn)物中由類黑精、果糖胺等有害物質(zhì)的生成；所以如何更好地利用濕法糖基化改性在提高目標(biāo)物抗氧化活性的同時(shí)，又能保證產(chǎn)生較少的有害物質(zhì)是需要進(jìn)一步研究的課題。

英國(guó)紅蕓豆是豆科菜豆屬的一種雜糧作物，蕓豆品種最早引自英國(guó)，外觀呈紫紅色，腎型，該品種是近年來在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)非常暢銷的蕓豆品種[11]。我國(guó)主要在東北、內(nèi)蒙古、陜西、河北等地區(qū)種植[12]，其中黑龍江省是英國(guó)紅蕓豆的主要產(chǎn)區(qū)，占全年英國(guó)紅蕓豆出口總量的1/4左右[13]。韓晶等[14]在對(duì)黑龍江 6 個(gè)主要種植品種的蕓豆進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)素評(píng)價(jià)研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)En、紫荊花、白沙克、日本紅、西班牙白、英國(guó)紅等 6 個(gè)品種進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定后得到結(jié)論，英國(guó)紅蕓豆的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到 22.03%，是6個(gè)蕓豆品種中蛋白質(zhì)含量最高的。

本課題組前期制備了英國(guó)紅蕓豆蛋白抗氧化肽，為了進(jìn)一步提高其抗氧化活性，擬對(duì)其進(jìn)行糖基化改性，同時(shí)為了減少糖基化改性產(chǎn)物中有害物質(zhì)丙烯酰胺的生成，將改性溫度控制在 90 ℃。以抗氧化肽凍干粉為原料，運(yùn)用濕法糖基化改性的方法，使蕓豆抗氧化肽與木糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)，以羥自由基清除率和丙烯酰胺生成量為指標(biāo)，確定糖基化改性最佳反應(yīng)條件；然后分析糖基化改性產(chǎn)物的抗氧化情況、褐變程度和接枝度；最后通過熒光光譜法、紫外光譜法、傅里葉紅外光譜法、SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳和粒徑分布測(cè)定，對(duì)糖基化改性產(chǎn)物進(jìn)行分析，以期為英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽糖基化改性產(chǎn)物的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

英國(guó)紅蕓豆；堿性蛋白酶(2709，2.0×105U/g)、還原型谷胱甘肽，為生化試劑。木糖、果糖、葡萄糖等其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

日立 U-2910 型紫外分光光度計(jì)，Chrwasta Epsilon 2-4 D 型冷凍干燥機(jī)， CF16 RN 型超速離心機(jī)，RF-6000 型熒光光譜儀，Tensor 27 型傅里葉變換紅外光譜儀。

1.3 方法

1.3.1 英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽的制備

參照參考文獻(xiàn)[15]的方法，利用堿性蛋白酶制備英國(guó)紅蕓豆蛋白抗氧化肽，真空冷凍干燥備用。

1.3.2 抗氧化肽糖基化改性最佳還原糖的確定

分別稱取 0.1 g糖(木糖、果糖、葡萄糖)和 0.1 g英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽，加入 10 mL水充分溶解，調(diào)節(jié) pH 7，進(jìn)行 10 min 紫外線殺菌。反應(yīng)溫度為 90 ℃，反應(yīng)時(shí)間 4 h，以相同濃度的VC溶液作對(duì)照，以糖基化產(chǎn)物羥自由基(·OH)清除率為指標(biāo)，確定最佳還原糖，羥自由基清除率的測(cè)定方法見參照文獻(xiàn)[16]。

1.3.3 糖基化改性最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化

丙烯酰胺測(cè)定方法見參照文獻(xiàn)[17]，丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=-6×10-5c+0.316 9，回歸系數(shù)R2=0.991 6。其中c為丙烯酰胺濃度，y為吸光度(A)。將 1.3.2 中確定的最佳還原糖用于后續(xù)糖基化改性，改性溫度控制在 90 ℃，分別對(duì) pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，反應(yīng)時(shí)間(2、3、4、5、6 h)和糖肽比為(0.5∶1，1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5 ∶1、1∶1.5、1∶2.5)等進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以糖基化產(chǎn)物的羥基自由基清除率和丙烯酰胺含量為指標(biāo)，確定正交實(shí)驗(yàn)因素的最優(yōu)水平后，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終確定糖基化改性的最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.3.4 抗氧化肽糖基化改性前后體外抗氧化活性分析

參照參考文獻(xiàn)[16]的方法對(duì)糖基化產(chǎn)物進(jìn)行羥自由基清除率、DPPH 自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及還原力的分析。

1.3.5 糖基化改性褐變程度分析

褐變程度測(cè)定方法見文獻(xiàn)[18]，稍有改動(dòng)，分別取2.0 mL質(zhì)量濃度為 10 mg/mL 的糖基化反應(yīng)前后的溶液加入 8.0 mL 稀釋液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%SDS 及 0.05 mol/L 硼砂)，在 420 nm 下測(cè)量糖基化反應(yīng)前后的吸光度，以稀釋液作空白。

1.3.6 糖基化改性接枝度的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[19]的方法，用游離氨基酸含量表征產(chǎn)物的接枝度(DG%)。測(cè)定時(shí)將糖基化改性前后的溶液分別稀釋至 2 mg/mL，運(yùn)用 OPA 法測(cè)定接枝度(DG)。

1.3.7 熒光光譜分析

利用 pH 7.2 的磷酸緩沖液，分別配制濃度均為 5 mg/mL 的蕓豆蛋白抗氧化肽和糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的待測(cè)液。取 20 μL ANS溶液(8 mmol/L)加到 4 mL 待測(cè)液中混合均勻，在激發(fā)波長(zhǎng)為 347 nm 處激發(fā)，激發(fā)帶寬 5 nm，掃描速率為 100 nm/min，迅速進(jìn)行 365～550 nm 波長(zhǎng)掃描，以未加樣品的磷酸鹽緩沖液為空白。

1.3.8 紫外-可見光譜分析

將質(zhì)量濃度為 2 mg/mL 的英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽和糖基化反應(yīng)產(chǎn)物用紫外可見分光光度計(jì)從 245 nm 掃描到 400 nm，比較反應(yīng)前后樣品的紫外吸收特性的變化。

1.3.9 傅里葉中紅外光譜分析

將 2 mg 糖基化改性前后的凍干樣品分別與 200 mg溴化鉀粉末充分混合研磨，在 10～12 T 壓力下將混合粉末壓制成固體薄膜，進(jìn)行全波段掃描，測(cè)量范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.10 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

實(shí)驗(yàn)使用 5% 的丙烯酰胺濃縮膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.5%丙烯酰胺分離凝膠進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，制備 pH 8.0 的樣品緩沖液。將 200 μL 濃度為 40 mg/mL 樣品溶液與 200 μL 的 1×SDS 負(fù)載緩沖液混合，置于沸水中 5 min。冷卻后，將 Marker、蕓豆抗氧化肽、糖基化改性產(chǎn)物以及英國(guó)紅蕓豆蛋白溶液樣品分別取 18 μL 注入斑點(diǎn)井。將濃縮凝膠中的電壓設(shè)置為 60 V，分離凝膠電壓設(shè)置為 110 V 進(jìn)行電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)離凝膠底部約 1 cm 時(shí)，電泳終止，通過凝膠成像儀進(jìn)行觀察。

1.3.11 粒徑分布測(cè)定

分別用去離子水配制 1 mg/mL 的抗氧化肽和糖基化改性產(chǎn)物溶液，采用 ZEN-3700 型馬爾文激光粒度儀對(duì)溶液的平均粒徑進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)時(shí)測(cè)定時(shí)間設(shè)為 120 s，選用 DTS0012 皿在室溫條件(25 ℃)下重復(fù)測(cè)定 20 次。

1.3.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用 Origin 8.5 和 SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析(ANOVA)，用 Duncan 法進(jìn)行差異顯著性分析，所有實(shí)驗(yàn)均做3次重復(fù)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳還原糖的確定

由表1可見，木糖與抗氧化肽糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除率為 66.4%，顯著高于(P<0.05)葡萄糖和果糖，但顯著低于同等質(zhì)量濃度(10 mg/mL)下VC的活性，結(jié)果與孫煒煒等[20]在進(jìn)行賴氨酸糖基化改性研究的結(jié)果一致。由于木糖是一種五碳糖，與葡萄糖和果糖相比，更容易發(fā)生糖基化反應(yīng)。因此，選擇木糖作為英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽糖基化改性的目標(biāo)糖。

表1 單糖種類對(duì)糖基化產(chǎn)物羥自由基清除率的影響

表2 pH 對(duì)糖基化反應(yīng)產(chǎn)物羥自由基清除率和丙烯酰胺含量的影響

表3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖基化反應(yīng)產(chǎn)物羥自由基清除率和丙烯酰胺含量的影響

表4 糖肽比對(duì)糖基化反應(yīng)產(chǎn)物羥自由基清除率和丙烯酰胺含量的影響

2.2 糖基化改性條件優(yōu)化

2.2.1 最佳 pH 的確定

如表2所示，當(dāng)pH 7.0時(shí)，糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除率最高為 71.1%，且差異顯著(P<0.05)，但顯著低于VC的清除能力。堿性條件下生成的丙烯酰胺量顯著低于酸性條件下的生成量，當(dāng) pH 為8.0時(shí)，丙烯酰胺含量均最低。由于pH為8.0時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除能力顯著低于pH 7.0，不利于提高改性產(chǎn)物的抗氧化活性。綜合考慮抗氧化活性及丙烯酰胺生成量，初步確定pH 7.0為糖基化改性最佳pH。郭浩等[21]在研究葡萄糖糖基化改性玉米醇溶蛋白膜的物化性質(zhì)時(shí)，選用的最佳pH也是7.0。

2.2.2 最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

如表3所示，反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除率最高為69.3%，且差異顯著(P<0.05)，但顯著低于VC的清除率。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，丙烯酰胺含量顯著增加，反應(yīng)時(shí)間為2、3 h時(shí)，丙烯酰胺含量較低。綜合考慮改性產(chǎn)物的抗氧化活性及丙烯酰胺的生成量，確定糖基化改性最佳反應(yīng)時(shí)間為4 h，這與趙玉濱等[22]在研究糖基化改性對(duì)酪蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性影響時(shí)所選的最佳反應(yīng)時(shí)間一致。

2.2.3 最佳糖肽比的確定

如表4所示，在糖肽比為 1∶1 時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除率為 72.8%，顯著(P<0.05)高于其他各組，但顯著低于 VC的清除率。在糖肽比為 1∶1.5 和 1.5∶1 時(shí)，羥自由基清除率也較高，說明糖肽比例越接近于 1∶1，反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除率就會(huì)越高，相應(yīng)的抗氧化性也會(huì)越強(qiáng)。當(dāng)糖肽比為 1∶1 時(shí)，丙烯酰胺含量最低，為 279.50 μg/L，且差異顯著(P<0.05)；在糖肽比為 1.5∶1 時(shí)的丙烯酰胺生成量顯著低于 1∶1.5 的丙烯酰胺含量?？梢?，反應(yīng)體系中越丙烯酰胺的含量隨著木糖的含量增加而增加。當(dāng)肽糖比例控制在 1∶1 時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除率最大且丙烯酰胺含量最低。張亞婷等[23]在研究復(fù)合物改性大豆分離蛋白功能性質(zhì)時(shí)，也利用了糖基化改性提高抗氧化性，得出的最佳糖肽比也為 1∶1。

2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表 5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 6。K(k) 代表羥基自由基清除率，K’(k’)代表丙烯酰胺含量。在糖基化溫度為 90 ℃，影響改性產(chǎn)物羥自由基清除率的主次因素為：A>C>B，pH 為主要影響因素；影響丙烯酰胺生成量的主次因素為：B>C>A，時(shí)間為主要因素。羥自由基清除率和丙烯酰胺生成量的最優(yōu)水平分別為A2B1C1(pH 7、反應(yīng)時(shí)間 3.5 h、糖肽比 1∶1.25)和A2B2C2(pH 7、反應(yīng)時(shí)間 4 h、糖肽比 1∶1)，反應(yīng)溫度均為 90 ℃。

表5 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

續(xù)表6

2.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將2個(gè)最優(yōu)水平組合設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證結(jié)果表明，A2B1C1的羥自由基清除率為 67.5%，丙烯酰胺生成量為342.66 μg/L；A2B2C2的羥自由基清除率為 77.2%，丙烯酰胺生成量為 359.23 μg/L，我國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求一般食物或食物原料中最大檢測(cè)限為 0.2 mg/kg(干基含量)，在動(dòng)物可食性組織中的檢測(cè)限為 0.05 pg/g，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與我國(guó)丙烯酰胺行業(yè)檢出標(biāo)準(zhǔn)接近。其中A2B2C2條件下制備糖基化改性產(chǎn)物的羥自由基清除率顯著高于A2B1C1；兩種條件改性產(chǎn)物中丙烯酰胺生成量較低且無顯著性差異，所以A2B2C2為英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽糖基化改性的最佳反應(yīng)條件，即 pH 7、時(shí)間 4 h、糖肽比例 1∶1，反應(yīng)溫度為90 ℃。

糖基化改性可以顯著提高英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽的抗氧化活性，最優(yōu)的糖基化改性條件為：反應(yīng)體系 10 mg/mL、反應(yīng)溫度 90 ℃、pH 7、反應(yīng)時(shí)間 4 h、反應(yīng)體系糖肽比為 1∶1。

2.3 糖基化改性前后體外抗氧化活性分析

由表7可見，與改性前相比，改性后羥基自由基清除率、DPPH 自由基清除率、還原力分別提高了80.9%、75.1% 及 135.7%，但均顯著低于同等濃度 VC的抗氧化能力；改性前后與亞鐵離子螯合能力均顯著高于 VC，這與 Li等[24]的研究結(jié)果一致，改性后的蕓豆抗氧化肽與亞鐵離子的螯合能力提高到了 60.4%。抗氧化劑的抗氧化機(jī)理有自由基清除劑、單線態(tài)氧淬滅劑、氫過氧化物轉(zhuǎn)化劑、金屬螯合劑等。劉祥等[25]在研究糖基化對(duì)玉米蛋白粉雙酶水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，糖基化產(chǎn)物羥基自由基清除率、DPPH 自由基清除率、還原力、與亞鐵離子螯合能力均得到顯著提高。江連洲等[26]在研究葡聚糖糖基化處理對(duì)綠豆蛋白抗氧化性影響研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)，綠豆蛋白還原力、DPPH 自由基清除能力、超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力都有顯著提高。可見，糖基化改性是提高英國(guó)紅蕓豆抗氧肽組分抗氧化性的一種非常高效的方法。

表7 糖基化改性前后抗氧化活性的變化

2.4 褐變程度分析

糖基化產(chǎn)物褐變程度及接枝度見表8。通過糖基化改性反應(yīng)，改性產(chǎn)物的褐變程度達(dá)到了0.52；改性后產(chǎn)物的接枝度為 39%，改性前接枝度 2%，說明抗氧化肽中氨基酸與木糖進(jìn)行了充分的羰氨縮合反應(yīng)，生成了分子量較大的物質(zhì)如類黑色素類，導(dǎo)致吸光度上升，反映出褐變程度加深。劉郁琪等[22]在研究酪蛋白與可溶性大豆多糖糖基化產(chǎn)物制備時(shí)，接枝度也達(dá)到 20.7%，與本研究相符。反應(yīng)后的產(chǎn)物接枝度增大，說明反應(yīng)體系游離氨基含量減少。

表8 糖基化改性前后褐變程度及接枝度改變情況

2.5 熒光光譜分析

如圖1所示，熒光物質(zhì)是糖基化反應(yīng)進(jìn)行到末期階段生成的產(chǎn)物，是糖基化改性反應(yīng)的一個(gè)顯著特征[27]。伴隨糖基化改性的發(fā)生，反應(yīng)產(chǎn)物中生成大量的有色物質(zhì)[28]。反應(yīng)前的抗氧化肽最大吸收峰在413 nm附近，最大熒光強(qiáng)度為3 761，而改性后的反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收峰在419 nm附近,最大熒光吸收強(qiáng)度達(dá)到了12 806.6，熒光吸收特性顯著增強(qiáng)，這符合糖基化產(chǎn)物所具有的熒光特性。有研究報(bào)道在葡萄糖和賴氨酸體系中熒光物質(zhì)的積累是由于還原物質(zhì)與胺之間不可逆轉(zhuǎn)的反應(yīng)[29]，大多數(shù)熒光化合物的形成是與存在酪蛋白以及褐變的發(fā)生相關(guān)聯(lián)的，證明了蕓豆蛋白肽和木糖發(fā)生了共價(jià)接枝反應(yīng)。

圖1 熒光吸收光譜

2.6 紫外吸收光譜分析

如圖2所示，糖基化改性產(chǎn)物紫外光吸收的最大吸收峰都出現(xiàn)在265～275 nm內(nèi)，在此范圍內(nèi)有較大的吸收峰的應(yīng)該是抗氧化組分中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸所致，若此3種氨基酸發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在265～275 nm處紫外吸收強(qiáng)度應(yīng)該降低，但是糖基化產(chǎn)物的吸收峰強(qiáng)度較蕓豆抗氧化肽相比反而明顯增強(qiáng)，并且反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收峰向左偏移發(fā)生了藍(lán)移現(xiàn)象，這可能是由于糖基化改性反應(yīng)過程中，產(chǎn)生了較多的具有紫外光吸收特性的物質(zhì)[24]，所以導(dǎo)致糖基化改性產(chǎn)物在此處紫外吸收強(qiáng)度增大。

圖2 紫外吸收光譜

2.7 傅里葉中紅外光譜分析

圖3 傅里葉中紅外光譜

2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

如圖4所示，第1泳道的蕓豆蛋白抗氧化肽未出現(xiàn)明顯條帶，說明蕓豆蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解后生成的多肽種類較多，多肽的分子量大小大多集中在20 ku處左右，與最右側(cè)第 3 泳道的蕓豆蛋白相比，分子量明顯減小，表明堿性蛋白酶對(duì)蕓豆蛋白酶解比較徹底。分子量明顯經(jīng)過糖基化改性反應(yīng)以后生成第2泳道的糖基化改性產(chǎn)物顏色變淺，可能是蕓豆抗氧化肽經(jīng)過糖基化反應(yīng)后，自由氨基減少，染色劑考馬斯亮藍(lán)與糖基化改性產(chǎn)物反應(yīng)位點(diǎn)減少，進(jìn)而減少了考馬斯亮藍(lán)與多肽的結(jié)合，導(dǎo)致考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)顏色變淺，這也間接證明了經(jīng)過糖基化改性生成了新的物質(zhì)[32]。

注：M為蛋白肽Marker；1為蕓豆抗氧化肽；2為糖基化改性產(chǎn)物；3為蕓豆蛋白。圖4 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.9 粒徑分布測(cè)定

如圖5所示，反應(yīng)前抗氧化肽的粒徑分布在400～1 100 nm之間，經(jīng)過糖基化改性生成的糖基化改性性產(chǎn)物的粒徑分布在100～300 nm之間，糖基化改性產(chǎn)物的粒徑減小，這與于楓[33]在研究米糠蛋白糖基化改性產(chǎn)物粒徑的變化趨勢(shì)一致；粒徑減小的原因可能是蕓豆抗氧化肽經(jīng)過糖基化改性反應(yīng)后，由于木糖的接入，使得抗氧化肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，抗氧化肽溶液中原有的聚集顆粒被破壞分散，形成粒徑更小的均一體系。粒徑對(duì)抗氧化肽乳液的穩(wěn)定性十分關(guān)鍵，較小的粒徑導(dǎo)致界面張力下降，提高了乳液抵抗失穩(wěn)的能力，同時(shí)粒徑越小乳液越不容易分層，相應(yīng)的乳液中的聚集現(xiàn)象越少，這增加了分子內(nèi)部疏水基團(tuán)發(fā)揮作用的機(jī)會(huì)，表明蕓豆抗氧化肽糖基化改性產(chǎn)物作為乳化劑具有很好的應(yīng)用潛力。

圖5 粒徑分析圖

3 結(jié)論