USP6基因重排檢測(cè)在骨與軟組織病理診斷中的作用

吳春鋒，朱維健，徐 毅，沙曉筱，夏春燕

泛素特異性蛋白酶6(ubiquitin-specific protease6, USP6)又稱TRE17或Tre2，是泛素特異性蛋白酶家族中被最早發(fā)現(xiàn)的成員之一。Oliveira等[1]發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性動(dòng)脈瘤樣骨囊腫(aneurysmal bone cyst, ABC)中存在CDH11-USP6基因重排，提示USP6基因可能具有潛在的致病性。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性ABC、結(jié)節(jié)性筋膜炎(nodular fasciitis, NF)、骨化性肌炎(myositis ossificans, MO)等疾病中存在USP6基因與多種基因發(fā)生重排現(xiàn)象。USP6基因重排在原發(fā)性ABC、NF等軟組織病變的診斷中具有較好的特異性，能與其他組織學(xué)相似的病變進(jìn)行鑒別[2]。本文回顧性分析42例骨和軟組織病變標(biāo)本，采用FISH法檢測(cè)USP6基因重排情況，了解其在原發(fā)性和繼發(fā)性ABC、MO及NF等病變中的診斷及鑒別診斷作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月～2020年12月海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科送檢的骨和軟組織標(biāo)本42例，其中男性22例，女性20例。年齡3～55歲，平均26歲。脊柱病變28例，脛骨病變3例，股骨病變2例，髂骨2例，肱骨1例，髕骨1例，上頜竇1例，右頰1例，手指1例，足趾1例，肩胛1例。1例為穿刺活檢標(biāo)本，41例為手術(shù)刮除或切除標(biāo)本。所有病例均經(jīng)兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家重新閱片，按照WHO(2020)骨與軟組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷，并進(jìn)行USP6基因重排檢測(cè)。

1.2 影像學(xué)特征原發(fā)性和繼發(fā)性ABC呈膨脹性溶骨性生長(zhǎng)，由充滿血液的腔隙組成，血池間有包含骨小梁的纖維組織間隔。其MRI圖像改變包括多個(gè)大小不等的囊狀骨破壞，受累骨呈分葉狀膨脹變形，常向軟組織膨出，邊界為殼狀的骨膜骨或無鈣化的骨膜，其囊腔內(nèi)含新鮮或陳舊的血液，常常表現(xiàn)為液液平面。

1.3 標(biāo)本處理送檢組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定、徠卡ASP300脫水機(jī)脫水浸蠟、常規(guī)石蠟包埋、切片。質(zhì)硬骨組織樣本經(jīng)10%甲酸脫鈣液脫鈣軟化處理。

1.4 免疫組化3～5 μm厚的組織防脫切片行免疫組化MaxVision法染色，H3F3A抗組蛋白H3.3 G34W兔單克隆抗體(克隆號(hào)RM263)，H3F3B抗組蛋白H3.3 K36M兔單克隆抗體(克隆號(hào)RM193)和羊抗兔鼠通用型二抗試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物公司，陽性均為細(xì)胞核著色。

1.5 FISH檢測(cè)及結(jié)果判讀USP6基因雙色分離探針試劑盒購(gòu)自廣州安必平醫(yī)藥公司。探針位于染色體17p13.2，基因近端(近著絲粒)探針標(biāo)記紅色熒光，基因遠(yuǎn)端(近端粒)探針標(biāo)記綠色熒光。

FISH檢測(cè)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化流程操作，具體步驟：3～5 μm厚的組織防脫切片(65±5) ℃烤片2 h，脫蠟、水化，(100±5) ℃去離子水煮片20 min，胃蛋白酶消化15 min，滴加探針，雜交儀中85 ℃變性5 min，37 ℃雜交10～18 h。4’，6-二脒基-2’-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2’-phenylindole，DAPI)進(jìn)行核復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察。

結(jié)果判讀：FISH結(jié)果由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師獨(dú)立判讀：計(jì)數(shù)200個(gè)不重疊的細(xì)胞核，紅色信號(hào)和綠色信號(hào)距離>2個(gè)信號(hào)點(diǎn)為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞比例>5%視為分離重排陽性。

1.6 Sanger測(cè)序使用PCR儀擴(kuò)增H3F3A和H3F3B 2號(hào)外顯子目的片段，引物由廈門艾德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所合成提供。目的片段擴(kuò)增反應(yīng)體系為反應(yīng)液12.5 μL(dNTPs、Mg2+、Taq酶)，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL，總反應(yīng)體系25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物交由廈門艾德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與基因組DNA序列進(jìn)行對(duì)比，參考序列分別為NM_002107.6和NM_005324.5。

2 結(jié)果

經(jīng)FISH檢測(cè)，42例中40例見可判讀的熒光信號(hào)；2例檢測(cè)不成功，鏡下無熒光信號(hào)，均為經(jīng)酸脫鈣處理。21例USP6基因斷裂重排陽性(1A)，結(jié)合病理特征及影像學(xué)表現(xiàn)，18例確診為原發(fā)性ABC(圖1B)，其中4例為實(shí)性ABC(圖1C)、2例NF、1例MO。19例USP6基因斷裂重排陰性(圖2A)，結(jié)合影像學(xué)表現(xiàn)、病理特征、免疫表型及基因測(cè)序結(jié)果，其中8例診斷為原發(fā)性ABC，7例診斷為繼發(fā)性ABC，包括軟骨母細(xì)胞瘤(chondroblastoma, CB)2例(圖2B)，骨巨細(xì)胞瘤(giant cell tumour of bone, GCT)1例(圖2C)，骨肉瘤1例，纖維結(jié)構(gòu)不良1例，骨化性纖維瘤1例，慢性炎癥1例；另外非ABC樣改變的富于巨細(xì)胞的腫瘤4例，分別為骨囊腫2例，腱鞘巨細(xì)胞瘤1例，無明確診斷1例。2例FISH檢測(cè)失敗，最終診斷1例為纖維結(jié)構(gòu)不良繼發(fā)ABC，另1例結(jié)合病理特征及影像學(xué)表現(xiàn)，最終診斷為原發(fā)性ABC。

①A①B①C②A②B②C

本實(shí)驗(yàn)成功檢測(cè)到18例原發(fā)性ABC、1例MO、2例NF存在USP6基因重排。FISH法檢測(cè)USP6基因重排診斷原發(fā)性ABC的敏感性為69.2%(18/26)，特異性為100%(18/18)，準(zhǔn)確率為75.8%(25/33)(表1)。

表1 40例骨和軟組織病變標(biāo)本中USP6基因重排情況

3 討論

本實(shí)驗(yàn)探討FISH檢測(cè)USP6基因重排在骨和軟組織病變(ABC、MO、NF等)病理診斷中的作用。本組病例檢測(cè)到USP6基因重排的軟組織病變包括原發(fā)性ABC、NF及MO。其中原發(fā)性ABC全部發(fā)生于骨，以脊柱最多見(81.4%)，脊柱病變中又以頸椎病變最多見(42.8%)，這些病例基本為我院骨腫瘤科送檢的手術(shù)標(biāo)本，可能與收治的患者以脊柱腫瘤多見有關(guān)。2例NF及1例MO具有典型的組織學(xué)特征，因發(fā)生部位較特殊，行USP6基因重排檢測(cè)以輔助診斷，結(jié)果均為陽性。文獻(xiàn)報(bào)道USP6基因重排還見于指趾纖維骨性假瘤[3]、顱骨筋膜炎[4]、富細(xì)胞腱鞘纖維瘤[5]等疾病。

利用FISH法對(duì)USP6基因重排進(jìn)行檢測(cè)，在骨和軟組織腫瘤的病理診斷中具有廣泛的運(yùn)用前景，具有快速、準(zhǔn)確且易于開展的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)診斷工作幫助較大。但在檢測(cè)過程中也存在一些需要注意的問題。首先是樣本的前處理，尤其是骨腫瘤標(biāo)本，含骨質(zhì)豐富，質(zhì)地堅(jiān)硬，需脫鈣處理。普通強(qiáng)酸脫鈣液因破壞蛋白質(zhì)及核酸，影響免疫組化和基因檢測(cè)，目前已不適用于骨病變的病理診斷。本組42例中2例檢測(cè)不成功，鏡下均未見任何有效熒光信號(hào)，可能與標(biāo)本經(jīng)酸脫鈣軟化處理時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān)。EDTA脫鈣液和甲酸性質(zhì)溫和，對(duì)組織內(nèi)的核酸和抗原損傷小[6-7]，目前已成為我科常規(guī)使用的脫鈣液。EDTA脫鈣液脫鈣效果雖然更為理想，但脫鈣時(shí)間長(zhǎng)，最好同時(shí)配合使用超聲脫鈣儀，可以縮短脫鈣周期。其次，在FISH制片過程中，雜交前煮片預(yù)處理與胃蛋白酶消化時(shí)間及程度是最關(guān)鍵的兩個(gè)環(huán)節(jié)，雜交前煮片預(yù)處理可采用去離子水高溫水煮法和EDTA修復(fù)液高溫水煮法。經(jīng)對(duì)比分析，對(duì)富含骨基質(zhì)的切片，采用前者處理的組織細(xì)胞核輪廓完整、熒光信號(hào)強(qiáng)度適中且紅綠信號(hào)對(duì)比度合適，背景干凈，易計(jì)數(shù)。此外，合理控制胃蛋白酶的消化時(shí)間也很重要，本組骨和軟組織標(biāo)本是先進(jìn)行了較短時(shí)間的消化處理，終止消化后，使用DAPI對(duì)核進(jìn)行復(fù)染，觀察細(xì)胞核的消化程度，如消化不足，可再用胃蛋白酶進(jìn)行二次消化，直至得到較好的消化結(jié)果即為理想的胃蛋白酶消化時(shí)間。參考文獻(xiàn)報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)[8]，當(dāng)鏡下觀察到DAPI復(fù)染后的核呈現(xiàn)細(xì)胞核完整，邊緣完整略呈鋸齒狀、網(wǎng)格狀時(shí)即為最優(yōu)的消化結(jié)果。計(jì)數(shù)判讀時(shí)，可先鏡下觀察HE染色形態(tài)(FISH檢測(cè)應(yīng)連續(xù)切3張組織切片，分別用于HE染色，F(xiàn)ISH制片及備用)，圈出病變區(qū)域，再行FISH觀察，需注意不管是原發(fā)性ABC或是繼發(fā)性ABC，組織標(biāo)本中成分復(fù)雜，富含炎癥細(xì)胞和多核巨細(xì)胞，此類細(xì)胞幾乎不出現(xiàn)USP6基因重排，應(yīng)當(dāng)不予計(jì)數(shù)。當(dāng)陽性比值臨近Cut-off值時(shí)，可以重新觀察HE染色形態(tài)，重新?lián)Q區(qū)域計(jì)數(shù)或采用雙熒光信號(hào)通道選擇紅綠信號(hào)分離較多的區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，再觀察HE染色形態(tài)確定所計(jì)數(shù)的區(qū)域是否為病變區(qū)域。當(dāng)出現(xiàn)紅綠信號(hào)分離間距小而又與內(nèi)對(duì)照細(xì)胞紅綠間距的狀態(tài)存在差異時(shí)，可以選擇相應(yīng)的RT-PCR或二代測(cè)序等方法進(jìn)行驗(yàn)證，如二代測(cè)序法驗(yàn)證出現(xiàn)新的USP6基因融合點(diǎn)位，也可設(shè)計(jì)新的FISH法融合探針予以反向驗(yàn)證檢測(cè)，這既可以提高檢測(cè)的敏感性，也可以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的條件不同，發(fā)生重排的陰性閾值也不盡相同，我科選擇適當(dāng)?shù)年幮圆±鲱A(yù)實(shí)驗(yàn)，確定本實(shí)驗(yàn)室的陰性閾值。此外，需要至少兩位分子學(xué)病理醫(yī)師進(jìn)行判讀以減少判讀誤差。

USP6基因重排檢測(cè)在骨與軟組織富于巨細(xì)胞的病變及軟組織低級(jí)別梭形細(xì)胞腫瘤的鑒別診斷中具有重要作用。巨細(xì)胞病變，如經(jīng)典型原發(fā)性ABC與良性或惡性骨腫瘤繼發(fā)的ABC及骨囊腫易混淆，而實(shí)體型ABC則與骨巨細(xì)胞瘤、軟骨母細(xì)胞瘤、巨細(xì)胞修復(fù)性肉芽腫、棕色瘤、腱鞘巨細(xì)胞瘤等均存在形態(tài)學(xué)的重疊，導(dǎo)致鑒別診斷困難。近年來，隨著骨腫瘤一些特異性標(biāo)志物的出現(xiàn)及使用，Rehkamper等[9]提出4步法對(duì)這類腫瘤進(jìn)行鑒別診斷，首先是根據(jù)影像學(xué)和形態(tài)學(xué)進(jìn)行初步診斷，然后結(jié)合免疫組化法標(biāo)記H3.3.G34W、H3.3.K36M的結(jié)果，陰性病例繼續(xù)行FISH檢測(cè)USP6基因重排情況，以上檢測(cè)結(jié)果全部陰性的病例進(jìn)行相應(yīng)基因的測(cè)序。例如本組有1例形態(tài)學(xué)不典型、免疫組化及FISH結(jié)果均陰性的富于巨細(xì)胞的骨腫瘤，H3F3A和H3F3B測(cè)序也均陰性，最終結(jié)合影像學(xué)表現(xiàn)及病理特征后歸入U(xiǎn)SP6陰性的原發(fā)性ABC。此外，另有2例免疫組化標(biāo)記分別為H3.3.G34W、H3.3.K36M灶性陽性，F(xiàn)ISH法檢測(cè)USP6基因重排陽性，而H3F3A和H3F3B測(cè)序均陰性，最終診斷為原發(fā)性ABC，此2例說明當(dāng)H3.3.G34W和H3.3.K36M免疫組化標(biāo)記非彌漫陽性或可疑時(shí)，F(xiàn)ISH法檢測(cè)USP6基因重排具有必要性。Oliveira等[10]研究結(jié)果顯示原發(fā)性ABC UPS6基因重排發(fā)生率為69%，本組為69.2%，結(jié)果與之一致，該報(bào)道還發(fā)現(xiàn)部分原發(fā)性ABC存在非USP6基因融合的其他基因融合類型。此外，存在部分H3F3A突變陰性的巨細(xì)胞瘤[11]。因此，如何更加精確地對(duì)富于巨細(xì)胞的骨和軟組織腫瘤進(jìn)行鑒別診斷，還有待深入探究。

在骨和軟組織腫瘤中越來越多特異性基因突變被發(fā)現(xiàn)，提高了對(duì)疾病本質(zhì)的認(rèn)識(shí)，為精準(zhǔn)診斷提供了更客觀的指標(biāo)。這些突變基因也可能是今后腫瘤靶向治療的靶標(biāo)。本組病例采用FISH法進(jìn)行UPS6基因重排檢測(cè)，在骨和軟組織病變的診斷中具有較高價(jià)值，但也會(huì)出現(xiàn)結(jié)果的假陰性與假陽性，因此在骨和軟組織病變的診斷中需要綜合臨床特征、影像學(xué)表現(xiàn)及病理特征。UPS6基因重排在骨和軟組織病變的發(fā)生和發(fā)展中的作用也有待深入分析。